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GeXP多功能遗传分析系统在临多功能遗传分析系统在临 床检测及医学基础研究中的应用床检测及医学基础研究中的应用 贝克曼库尔特商贸贝克曼库尔特商贸( (中国中国) )有限公司有限公司 毛细管毛细管 检测检测 窗口窗口 胶胶 初初 级级 胶胶 路路 激光激光 样品板样品板 水槽水槽 3 参数设置参数设置 运行控制运行控制 数据库管理数据库管理 测序分析测序分析 片段分析片段分析 序列比对序列比对 主要内容主要内容 测序的原理及其应用测序的原理及其应用 1 片段分析的原理及其应用片段分析的原理及其应用 2 XP-PCR的原理及其应用的原理及其应用 3 1 1、测序、测序 双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法 2013/11/12 6 2013/11/12 Call scores Heterozygote Detection Alignment 7 NO Interference from biological materials 650nm laser 750nm laser GeXP更适合检测突变更适合检测突变/杂合子：杂合子： 波长越长，干扰越少波长越长，干扰越少 ，背景噪音低，背景噪音低; 无无10的的cut off把噪音，不会把把噪音，不会把10以上杂合子去掉；以上杂合子去掉； GeXPGeXP荧光系统荧光系统 PDGFRA-exon12 KIT-Exon9 个体化用药检测个体化用药检测 EGFREGFR突变检测突变检测 肿瘤药物对应相关基因的检测肿瘤药物对应相关基因的检测 药物名称药物名称 检测基因检测基因 易瑞沙易瑞沙/特罗凯类特罗凯类 EGFR-Exon18 突变 EGFR-Exon19 突变 EGFR-Exon21 突变 EGFR-Exon20突变 伊马替尼伊马替尼 C-KIT-Exon9 突变 C-KIT-Exon11 突变 C-KIT-Exon13 突变 C-KIT-Exon17 突变 PDGFR-Exon12 PDGFR-Exon18 他莫昔芬他莫昔芬 CYP2D6*10 多态性 铂类铂类 XRCC1-Exon6 多态性 XRCC1-Exon10 多态性 ERCC1-codon118 多态性 MRP2-Exon10 多态性 BRCA1-Exon2 (女)多态性 BRCA1-Exon20 (女)多态性 XPD基因多态性 伊立替康伊立替康 UGT1A1 *6 多态性 UGT1A1*28 多态性 氟脲嘧啶类氟脲嘧啶类 DPYD*2A 多态性 HBVHBV分型、耐药突变检测分型、耐药突变检测 2 2、片段分析、片段分析 只需要研究长度，不需要知道具体序列只需要研究长度，不需要知道具体序列 分别率为分别率为1bp 片段分析应用片段分析应用 STR/SSR 融合基因，可变剪切体融合基因，可变剪切体 LOH,SNP MLPA, AFLP AlleleAllele- -1 1 Allele 2Allele 2 PCRPCR PCRPCR 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1010 1111 1212 1313 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1010 1 1 微卫星检测微卫星检测(SSR/STR)(SSR/STR) 15 结直肠癌微卫星检测结直肠癌微卫星检测 BAT25 BAT26 D2S123 D5S346 D17S250 国际上常用的国际上常用的MSI检测位点检测位点 白血病融合基因白血病融合基因 融合基因常常与一定类型的白血病发生相关 融合基因通常用与微小残留检测 CML: BCR-ABL M2: AML-ETO M3: PML-RARA M4: CBF MYH11 0 2 5 0 0 0 5 0 0 0 0 7 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 5 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 7 5 0 0 0 1 0 01 0 51 1 01 1 51 2 01 2 51 3 01 3 51 4 01 4 5 A 5 .E 0 9 _ 1 2 0 8 0 7 1 5 B G S iz e ( n t) Dye Signal 126.63 V1 (127) 0 2 5 0 0 5 0 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 2 5 0 0 1 5 0 0 0 1 7 5 0 0 2 0 0 0 0 1 0 51 1 01 1 51 2 01 2 51 3 01 3 51 4 01 4 51 5 0 A 2 .B 0 9 _ 1 2 0 8 0 7 1 5 B E S iz e ( n t) Dye Signal 115.74 121.50 143.23 V3A (122) V3B (144) EML4-ALK 2011.08.26 FDA批准批准XALKORI（crizotinib）上市）上市 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 2 0 0 0 0 2 5 0 0 0 3 0 0 0 0 3 5 0 0 0 4 0 0 0 0 1 0 01 0 51 1 01 1 51 2 01 2 51 3 01 3 51 4 01 4 5 A 7 .G 0 9 _ 1 2 0 8 0 7 1 5 B C S iz e ( n t) Dye Signal 115.58 V2 (116) 可变剪切体检测可变剪切体检测 MEF2c Size a1bga1bg 10491049 a2bga2bg 10431043 a1ga1g 10271027 a2ga2g 10201020 a1ba1b 959959 a2ba2b 951951 a1a1 935935 a2a2 929929 LOSS OF HETEROZYGOSITY 脑胶质瘤脑胶质瘤1p19q1p19q检测检测 D19S112 D1S489 D1S468 D1S436 D19S217 D19S902 SNP 铂类：铂类： XRCC1 Arg194Trp 突变增加疗效突变增加疗效 ERCC1 C8092A 突变增加严重胃肠道毒性反应突变增加严重胃肠道毒性反应 By Dr. Huang,SBC MLPAMLPA 多重连接探针多重连接探针 扩增技术扩增技术 2002年由年由Schouten 报道报道 Schouten JP, et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15;30(12):e57. multiplex ligation-dependent probe amplification MLPA用于唐氏诊断用于唐氏诊断 缺失缺失 MLPA用于地贫诊断用于地贫诊断 乳腺癌易感基因乳腺癌易感基因BRCA1BRCA1全外显子检测全外显子检测 # of Genes # of Samples 100 1000 10,000 100,000 10 100 1000 10,000 Real-time PCR Discovery 目前基因表达分析技术目前基因表达分析技术 1.每个芯片分析几千到几万个基因每个芯片分析几千到几万个基因 2.每次分析少量的样品每次分析少量的样品 3.灵敏度和准确性低灵敏度和准确性低 4.结果重复性差结果重复性差 5.成本太高成本太高 1.对芯片扫描下来的结果进行对芯片扫描下来的结果进行 进一步确认进一步确认 2.通量低通量低 3.管间差异管间差异 4.非等效扩增非等效扩增 5.耗时长耗时长 3 3、多重基因表达分析、多重基因表达分析(XP(XP- -PCR)PCR) AAA AAAA A AAAA AAAA AAAA AAAA Reverse Transcription mRNA to cDNA (non-labeled) Multiplex PCR (non-labeled) XP-PCR Priming Process Gene Specific Reverse Primer Universal Tag Reverse sequence 5 5 5 5 5 5 Multiplex PCR with “Universal” Primer set, in large molar excess Gene Specific Forward Primer 5 5 5 Universal Tag Forward sequence 根据峰的片段大小确定基因根据峰的片段大小确定基因 根据峰面积计算基因的表达量根据峰面积计算基因的表达量 荧荧 光光 强强 度度 片段大小片段大小 通用引物策略保证不同基因等比例放大通用引物策略保证不同基因等比例放大 XP-PCR技术原理技术原理 使不同基因的模板两端加上通用标签使不同基因的模板两端加上通用标签 用通用引物进行等效扩增用通用引物进行等效扩增 XP-PCR：独一无二的多重基因表达分析：独一无二的多重基因表达分析 肿瘤标志物开发和临床应用的理想平台肿瘤标志物开发和临床应用的理想平台 标准化准确：排除管间差异，操作误差标准化准确：排除管间差异，操作误差 快速出数据：快速出数据：480个样品个样品/天天 10 to 500 associated with a particular disease 5 to 40 associated with a pathway or specific response R2 = 0.9998 1 10 100 1000 1101001000 Experimental RNA (ng) Gene Expression Level 线性关系：线性关系：R20.999 值得信赖的定量分析值得信赖的定量分析 RNA CRNA D BC00068996%83% hGAPDH92%96% L27560100%92% NM_00009698%93% NM_00012594%97% NM_00012797%87% NM_00022489%97% NM_00043684%98% NM_00078894%89% NM_00110197%85% NM_00128299%71% NM_00207367%92% NM_00246698%93% NM_00291690%96% NM_00323996%97% NM_00360799%92% NM_00374894%100% NM_00388284%94% NM_00398193%97% NM_00610189%93% NM_01657769%89% NM_02205198%91% U8298791%90% X0561097%94% 无与伦比的超高灵敏度无与伦比的超高灵敏度 10-fold dilutions 2-fold dilutions 检测微小变化：检测微小变化：0.50.5倍倍 检测微小但具有显著生物学意义检测微小但具有显著生物学意义 的变化的理想方法的变化的理想方法 片段分离带来的优势片段分离带来的优势 Real-time PCR GeXP 噪音噪音 信号信号 噪音噪音+信号信号 Both signal and noise are collected Only signals are collected ! FFPE 样本表达谱分析的最佳平台样本表达谱分析的最佳平台 可对低至可对低至5ng的的RNA进行进行40重基因表达分析重基因表达分析 检测目的基因 相关药物 TUBB3 紫杉醇，多西紫杉醇， 多西他赛，长春瑞滨 PTEN 曲妥珠单抗 TOP2A 依托泊苷 HER2 拉帕替尼 ERCC1 卡铂，顺铂 TYMS 培美曲赛，5-Fu，卡 掊他滨 DPYD 5-FU,卡掊他滨 TYMP 5-FU,卡掊他滨 BRCA1 铂类 EGFR 西妥昔单抗 VEGFR 贝伐单抗 STMN1 紫杉醇/长春瑞滨 RRM1 吉西他滨 PDGFR 索拉菲尼、格列卫 PSMC4 人RNA内参1 GUSB 人RNA内参2 B2M 人RNA内参3 TATA BOX 人RNA内参4 pcDNA 反应内参 FFPE样本样本 平台平台 XPXP- -PCRPCR qPCRqPCR 芯片芯片 灵敏度灵敏度 高高 高高 中中 特异性特异性 高高 高高 中中 定量定量 是是 是是 否否 多重对照多重对照 是是 否否 是是 所需样品量所需样品量 小小 小小 大大 运营成本运营成本 低低 高高 高高 样品通量样品通量 高高 高高 低低 多重检测多重检测 是是 否否 是是 数据通量数据通量 高高 低低 高高 XP-PCR与其他技术的对比与其他技术的对比 XPXP- -PCRPCR应用应用 分子分型分子分型 个体化用药指导个体化用药指导 疗效评估及预后疗效评估及预后 产前诊断产前诊断 病原微生物检测病原微生物检测 研究背景： 小圆蓝细胞肿瘤（small round blue cell tumor）为常发生 于儿童的软组织肿瘤或者发生于中老年人的小细胞肺癌， 可分为四种不同亚型，对应不同治疗策略； 之所以统称为SRBCT是因为这四种肿瘤细胞在显微镜下看 起来都非常相似，常规的病理学检测很容易造成误诊； 因此临床医师必须很小心，且费时，才能做出正确的诊断， 进而提供合适的治疗方案。 Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 1, February 2007 Diagnosis of the Small Round Blue Cell Tumors Using Multiplex Polymerase Chain Reaction 神经母细胞瘤神经母细胞瘤 NB 横纹肌肉瘤横纹肌肉瘤 RMS 尤文家族肿瘤尤文家族肿瘤 EWS 非霍奇金淋巴瘤非霍奇金淋巴瘤 Lymph 小圆蓝细胞癌分子诊断小圆蓝细胞癌分子诊断 分子分型分子分型 37 优选出31个最具代表性 的肿瘤标志基因 选择了93个候选基因进行 多重定量基因表达分析 根据得到的数据建立人工神经网络模型，能够对患者病理类型进行智 能判断。 研究人员将已知分型的患者基因表达数据代入模型，进行了 验证，结果显示判别的准确性达到了99%。 全基因组全基因组 芯片分析芯片分析 候选基因候选基因 多重定量分析多重定量分析 多参数模型多参数模型 拟合（拟合（ANN） 检测型多重检测型多重 基因分析基因分析 HPVHPV分型及定量检测试剂盒分型及定量检测试剂盒 -Ready for RUOReady for RUO 特点特点: 25种种HPV分型分型: 19个高危个高危HPV: 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82, 83 6个低危个低危HPV: 6, 11, 42, 43, 44, 81 人类人类DNA对照对照 反应内参对照反应内参对照 定性定量同时实现定性定量同时实现 铂类用药多重基因检测铂类用药多重基因检测 肿瘤个体化用药检测肿瘤个体化用药检测 41 法华林用药指导多重检测法华林用药指导多重检测 疗效与预后评估疗效与预后评估 2013/11/12 42 日本FALCO公司乳腺癌分型预后 粉色：基因表达上升预后不良粉色：基因表达上升预后不良 蓝色：基因表达下降预后不良蓝色：基因表达下降预后不良 黄色：内参基因黄色：内参基因 目前判断肿瘤负荷、疗效和预后的方法主要有影目前判断肿瘤负荷、疗效和预后的方法主要有影 像学和病理学方法，但是这些方法存在着滞后性像学和病理学方法，但是这些方法存在着滞后性 、不能实时监控、特异性比较低等缺点。、不能实时监控、特异性比较低等缺点。 基因表达和突变等状态与疗效和预后密切相关。基因表达和突变等状态与疗效和预后密切相关。 通过基因检测来判断疗效和预后具有操作简单、通过基因检测来判断疗效和预后具有操作简单、 灵敏、准确和灵活等优点，是当前研究的热灵敏、准确和灵活等优点，是当前研究的热点。点。 五类非整倍染色体产前检测试剂盒五类非整倍染色体产前检测试剂盒 -Ready for RUO、筛查和临床辅助诊断、筛查和临床辅助诊断 43 非整倍染色体与疾病非整倍染色体与疾病 唐氏综合征唐氏综合征 (Downs syndrome ) (21三体, 47, XX (or XY), +21) Occurrence: 1/7001/600; 帕陶氏综合征帕陶氏综合征 (Pataus syndrome) (13三体, 47, XX (or XY), +13) Occurrence: 1/100001/2000; 爱德华氏综合征爱德华氏综合征 (Edwards syndrome) (18三体, 47, XX (or XY), +18) Occurrence: 1/3000; 克莱恩费尔特综合征克莱恩费尔特综合征 (Klinefelters syndrome) (XXY, 47, XXY) Occurrence: 1/650 male; 特纳氏综合征特纳氏综合征 (Turners syndrome) (XO, 45, X) Occurrence: 1/50001/2000 female. 产前诊断（产前诊断（XPXP- -PCRPCR） 44 2121 2121 2121 2121 2121 2121 2121 47, XY, T21 Normal XY 2121 2121 2121 2121 2121 2121 2121 45 X X X X X X X X X X X X X X Normal XX 45, XO X X X X X X X X X X X X X X 46 0 2 5 0 0 0 5 0 0 0 0 7 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 5 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 7 5 0 0 0 1 2 51 5 01 7 52 0 02 2 52 5 02 7 53 0 03 2 5 pcD N A -1_10w and 1_T P 1.H 10_120504088C S ize (n t) Dye Signal Inf A RNA_cont HPIV-1 BocaV HRV RXN_cont N1_TS N1_TR HAdV HCoV1 SARS-CoV N2 Inf B HPIV-3 H5N1 HPIV-2 HMPV SW H1N1 SeH1N1 Ge H1N1 H3 DNA_cont HCoV2 N1 病原微生物检测病原微生物检测 呼吸道病毒多重检测呼吸道病毒多重检测 0 2 5 0 0 0 5 0 0 0 0 7 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 5 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 7 5 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 01 5 02 0 02 5 03 0 03 5 0 I n f A 1 _ 1 0 b illio n 4 0 .E 0 5 _ 1 2 0 3 2 3 1 6 P V S ize (n t) Dye Signal InfA PcDNA 0 2 5 0 0 0 5 0 0 0 0 7 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 5 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 7 5 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 01 5 02 0 02 5 03 0 03 5 0 I n f A 1 _ 1 0 0 m illio n .E 0 5 _ 1 2 0 3 2 1 1 6 9 2 S ize (n t) Dye Signal InfA PcDNA 400 copies 0 2 5 0 0 0 5 0 0 0 0 7 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 5 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 7 5 0 0 0 1 0 01 5 02 0 02 5 03 0 03 5 0 I n f A 1 _ 1 b illio n 4 0 .G 0 5 _ 1 2 0 3 2 3 1 6 P O S iz e (n t) Dye Signal InfA PcDNA 40 copies 4 copies 甲流病毒检测甲流病毒检测 梯度稀释克隆的质粒 1. 呼吸道感染病原体： 13种病毒、8种细菌、肺炎支原体、寄生虫 2. 脑炎脑膜炎病原体：13种病毒、7种细菌、肺炎支原体、3种寄生虫 3. 腹泻病原体： 13种病毒、14种细菌、3种寄生虫 4. 发热伴出疹病原体： 13种病毒、4种细菌、肺炎支原体 5. 发热伴出血病原体： 9种病毒、5种细菌、立克次体 病原微生物检测试剂盒病原微生物检测试剂盒 台湾大学医学院台湾大学医学院 杨泮池杨泮池 院士院士 非小细胞肺癌非小细胞肺癌 Biomarkers 用表达谱芯片筛选到用表达谱芯片筛选到16个基因个基因 肺癌标记物研究肺癌标记物研究 医学基础研究医学基础研究 tube no.tube no. DUSP6DUSP6 MMDMMD STAT1STAT1 ERBB3ERBB3 LCKLCK 1 32.372208 31.821365 36.245426 32.987232 Undetermined 3 35.714275 34.059357 Undetermined 31.943768 Undetermined 5 30.12824 28.79605 33.073627 29.31014 Undetermined 7 32.534107 34.5383 36.00843 31.299223 Undetermined 8 36.01256 30.030882 38.60647 31.775482 Undetermined 10 35.9652 34.217415 38.13895 32.444706 44.97916 11 32.36764 33.368313 36.226162 31.969418 Undetermined 12 Undetermined 36.252445 Undetermined 32.89529 Undetermined 13 31.962568 30.847967 34.560844 29.931122 42.014782 14 33.21406 33.0646 40.157085 32.132317