（食品科学专业论文）鲢鱼蛋白的酶法水解及水解物的应用研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要对鲢鱼蛋白的深度酶解以及利用酶解液通过美拉德反应合成酱类 和肉味香味料的应用研究。旨在提高鲢鱼蛋白的水解度和降低鲢鱼蛋白深度水解 的生产成本，并将其制成不同风味的香料，取得以下主要研究结果： ( 1 ) 本论文研究在不同的酶和不同酶解方式下，鲢鱼蛋白的水解过程和水解特 性；探讨微生物蛋白酶酶解的机制；筛选出利于鲢鱼蛋白水解的蛋白酶和酶解方 式；探讨了酵母和酵母的加入方式对鲢鱼蛋白水解度的影响及防腐剂在鲢鱼蛋白 水解过程中的作用。结果表明，冷冻变性或热变性的鲢鱼蛋白的酶解速度和水解 度明显低于新鲜原料，以生鲜原料为例，在鲢鱼：水= 1 ：1 ，加入0 0 2 的n i s i n 作为防腐剂，采用分步加酶的方式，鲢鱼蛋白先用多酶( 0 1 9 酶l o o g 鱼肉蛋白， 碱性蛋白酶：中性蛋白酶= 2 ：1 ) 水解2 小时，再加入k o j i z y m e ( 0 1 ) 端解酶和酵 母( 5 ) 继续水解，4 8 小时后，水解液成分分析表明，总氮为8 ，其中游离氨基 酸为5 6 ，多肽( t c a 氮一氨基酸) 为1 8 ，氨态氮的生成率达到7 0 。 ( 2 ) 以( 1 ) 中的水解液为原料，利用其它物质如还原糖、乙醇、蒜粉、胡椒粉 等物质，通过美拉德反应合成酱味更加明显的香料。通过对单因素实验分析，确 定出生成明显酱味的最佳反应条件为：复合还原糖( 木糖：葡萄糖= 1 ：2 0 ) = 2 5 ， 乙醇= 0 2 ，蒜粉= 0 1 ，胡椒粉= 0 0 2 ，反应p h 值为5 0 ，反应时间2 0 分钟，反 应温度1 2 0 。在此试验条件下的结果表明，反应液具有明显酱味而无其它任何 杂味。鱼腥味也随m a i l l a r d 反应而完全去除，游离氨基酸的损失率为8 ，主要 为含硫氨基酸和疏水性氨基酸，而鲜味氨基酸( g l u ，a s p ) 损失较小，反应液保持 了鱼水解液特有的鲜味，完全可以取代传统的鱼露生产工艺。 ( 3 ) 将经深度酶解的鲢鱼蛋白水解液结合还原糖类、氨基酸、维生素b 。等物 质通过美拉德反应可以合成理想的肉类香味料。通过对正交实验和单因素实验结 果的分析，可以推断出美拉德反应合成肉类香味料的最佳反应条件为：木糖：葡 萄糖( 2 ) = 1 ：2 0 ，l 一半胱氨酸= 1 o ，维生素b 。= 1 0 ，维生素c = o 1 ，蒜粉= o 1 ， 反应p h 值为5 0 ，反应时间3 0 分钟，反应温度1 2 l 。在此条件下，反应液的肉 香最强。g c m s 分析表明，许多关键性的肉香味化合物和一些大分子杂环化合物被 鉴定出来，其中，肉香味最重要的化合物一呋喃硫醇在本反应体系中占挥发性化 合物的5 4 7 4 。反应体系的风味以烤肉味为主。 关键词：鲢鱼酶法水解美拉德反应酱香肉香 牮意理王大学工学磺士学位论文 a b s t r a c t t h i s p a p e rm a i n l y s t u d i e st h e d e e p l ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s o f h y p o p h t h a l m i c h t h y s m o l i t r i x p r o t e i n( h m p ) a n dt h e a p p l i c a t i o n o f h y d r o l y s a t et os y n t h e s i z es a u c ea n dm e a tf l a v o ra r o m a i tt r i e st oi m p r o v e d e g r e e o f h y d r o l y s i s ( d h ) o fh m p ，r e d u c e t h e p r o d u c t i o n c o s to f h m p h y d r o l y s a t e ，a n dp u tt h eh y d r o l y s a t ei n t od i f f e r e n tf l a v o ra r o m as y n t h e s i s ， w h i c ho b t a i n st h ef o l l o w i n gm a i nr e s e a r c hr e s u l t s t h ep a p e rs t u d i e st h ep r o c e s sa n dp e c u t i a r i t yo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s b yd i f f e r e n te n z y m ei nd i f f e r e n tm a n n e ro fe n z y m et r e a t m e n t ：d i s c u s s e st h e m e c h a n i s mo fm i c r o b i a lp r o t e a s ea c t i o n ：s i f t so u tt h ep r o t e a s ea n dw a yo f e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ：d i s c u s s e st h ee f f e c to fy e a s ta n d t h em a n n e ro f a d d i n gy e a s to nd ha n dt h ef u n c t i o no fa n t i s e p t i co nd h t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t si n d i c a t et h a te n z y m eh y d r o l y s i sr a t ea n dd ho fh m pb yf r e e z i n go r h e a td e n a t u r a t i o no b v i o u s l yg e tb e h i n df r e s hm a t e r i a l s w h e ns t i r r e df r e s h h m pm i x e sw i t he q u a lq u a n t i t yw a t e r ，a d d i n g0 0 2 n i s i na sa n t i s e p t i c ，h m p i sh y d r o l y z e db ys e v e r a lp r o t e a s e ( a l c a l a s e ：n e u t r a s e = 2 ：1 ) f o rt w oh o u r s ， f o l l o w i n gb yk o j i z y m e 0 1 篱) ，w h i l ea d d i n gs o m ey e a s t ( 5 ) 。a f t e r4 8h o u r s ， h y d r o l y s i sc o m p o n e n ta n a l y s i ss h o w s ，t h ec o n t e n to ft o t a ln i t r o g e ni s8 篱， t h e r e i n t o ，a m i n oa c i di s5 6 ，p o l y p e p t i d e ( t c an i t r o g e n a m i n oa c i d ) i s 1 8 t h et r a n s l a t i o nr a t i oo fa m i n oa c i dn i t r o g e ni so v e r7 0 u s i n gt h ea b o v eh y d r o l y s a t ea sm a t e r i a l s ，a d d i n go t h e rm a t e r i a l ss u c h a sr e d u c i n gs u g a r 、e t h a n o l 、g a r t i cp o w d e r 、p e p p e rp o w d e re t c ，s y n t h e s i z e s s a u c ef l a v o ra r o m ab ym a i 圭l a r dr e a c t i o n 。t h r o u g hs i n g l ef a c t o re x p e r 主瑾e n t a l a n a l y s i s ，r e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o ni st h a tc o m p l e xr e d u c i n g s u g a r ( x y l o s e ：g l u c o s e = 1 ：2 0 ) c o n t e n t i s 2 5 ，e t h a n o l c o n t e n ti s 0 2 ， c o n t e n to fg a r l i c p o w d e ri s0 1 ，c o n t e n to fp e p p e rp o w d e ri s0 0 2 ， r e a c t i o np hi s5 。0 ，r e a c t i o nt i m ei s2 0m i n s ，t e m p e r a t u r ei s1 2 04 c 。i nt h i s c o n d i t i o n ，t h eh y d r o l y s a t ec a ns y n t h e s i z ei d e a ls a u c ef l a v o ra r o m a 。f i s h y s m e l lc a nb ec o m p l e t e l ye l i m i n a t e dw i t hm a i l l a r dr e a c t i o n ，t h el o s i n gr a t i o o fa m i n oa c i di s8 m a i n l yc o n s i s t i n go fs u l f u r o u sa m i n oa c i d a n d h y d r o p h o b i ca m i n oa c i d ，m o r e o v e r ，t h el o s i n g o ff l a v o u re n h a n c i n ga m i n o a c i d ( g l u ，a s p ) i sq u i t e1 i t t l e ，t h er e a c t e dh y d r o l y s a t ek e e p ss p e c i a l i l a b s i r a c i f l a v o u ro ff i s hp r o t e i n t h i sm e t h o dc a nc o m p l e t e l yr e p l a c et r a d i t i o n a l f i s hs a u c ep r o d u c t i o nc r a f t w o r k a tl a s t ，t h ea p p l i c a t i o no fd e e p l yh y d r o l y s a t ei ss t u d i e dt os y n t h e s i z e m e a tf l a v o ra r o m ab ya d d i n gr e d u c i n gs u g a r ，a m i n oa c i d ，v i t a m i nb 1 t h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n ds i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tr e s u i ts h o wt h a tt h e o p t i m u mc o n d i t i o ni st h a tx y l o s e ：g l u c o s e ( 2 ) = 1 ：2 0 l - c y s t e i n ec o n t e n ti s 1 0 ，c o n t e n to fv i t a m i nb li s1 0 ，c o n t e n to fv i t a m i nci s0 1 ，c o n t e n t o fg a r l i cp o w d e ri s0 1 ，r e a c t i o np hi s 5 0 ，r e a c t i o nt i m ei s3 0m i n s ， t e m p e r a t u r ei s1 2 1 i nt h i sc o n d i t i o n t h eh y d r o l y s a t ec a ns y n t h e s i z e i d e a lm e a tf l a v o ra r o m a g c m sa n a l y s i ss h o w st h a tm a n yp i v o t a lm e a ta r o m a c o m p o u n d s a n ds o m e i m p o r t a n th e t e r o c y c l i cc o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e d t h e r e i n t o ，t h ep r o p o r t i o no ft h em o s ti m p o r t a n tm e a ta r o m ac o m p o u n d s u l f u r o li s5 4 7 4 o fv o l a t i l ec o m p o u n d s t h i sr e a c t i o ns y s t e mp r e s e n t s r o a s t i n gf l a v o r k e yw o r d s ：h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ， m a i l l a r d r e a c t i o n ， s a u c ef l a v o r ，m e a tf l a v o r i i i 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑鬟声明：所整交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得盼研究成果。除了文中特剐加敷标注雩 用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人稠集体，均墨在文中以弱确方式标嚷。本人完 全意识到本声明的法律詹果由本入承担。 馋者签名： 参? 港薯翮馨期：函方年7 胃搿毽 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者究全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被套阕和借阚。本人授权肇南瑾工大学可敬将本学位论文薜 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 绦密叠，在年解密籍适雳本授权书。 本学位论文属于 不保密叫 ( 请程潋上相应方框内打“”) 作者签名：孛卜3 更衲 日期：b ? 年 调f y 日 导舞签名：孕刃磐私曩期：加哆年，月，芦尽 f 第一章绪论 _ _ _ _ - - j _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ e _ e _ _ _ i i1 _ - | - e $ 目_ _ = e j 日_ _ _ e _ _ e = # = e | j _ - _ _ - = = = e 自= _ | j 目_ _ t _ _ _ _ _ _ _ - 置 1 。1 我国水产品资源的现状 第一章绪论帚一早珀t 匕 水产品因富含“脑黄众”一一必需脂肪酸d h a ( 二十二碳六烯酸) 和e p a ( 二 十碳五燎酸) 嚣蘩受人裁j 黉辣，菸已残梵世爨谗多国家粒建嚣提供动貔蛋自魏大 众食品。 耋羡摹舞敖以来，我毽渔数生产持续、亵遴增长。1 9 9 6 年隶产品总产攫 3 2 8 8 1 2 万吨，总产量连续7 年居世界首位。到2 0 0 1 年，水产晶总产量突破4 0 0 0 万建，加工只占总产量2 5 。拳产熬人均占有量突破3 0 公厅，超过邀爨人均占鸯 量约8 公斤。水产品在动物食品中的比熬达到2 0 以上。与此间时，我国水产品 加工业以冷冻加工为主，缀然取褥了很大成裁，但与我濒人民懋活大步迈向小壤 水平及渔业持续、迅速发展还不相适应。水产加工品折原料占水产品总量的眈例 仅3 0 。6 ，远远落嫩于发达国家加王晶比铡达7 0 以上的水平。热工品中，初级产 品仍多于糟加工、深加工产品。目前，我国人均水产品占有量匿已略趟过世界人 均占有水准( 约2 0 公斤) ，但据馈算，加工晶和优质水产晶还不足总产蹙的一半， 尚不能满足人民对水产品、加工晶的数爨、质量、花色晶种上豳趋增长的需求。 企业的综合素质、加工品的质量与发达国家尚有差距。 淡水受、低值海水鱼以及贝、藻类等水产品约占总产量的6 0 ，隧前仍是水 产品加工的薄弱环节。1 9 9 7 年我闼淡水惫产量为1 4 2 0 万吨，饭加工爨不到2 0 ， 淡水鱼加工业成了淡水鱼发展的瓶颈。这个薄弱环节解决了，水产品瓢工品的产 量、产值、质量、效益随之就可以提高了”。4 1 。 1 2 酶解法生产动物鬻白的重要意义 酶工程技术属于现代生物技术。酶解法生产水解动物蛋白( 简称h a p ) 怒目 前蹦内外都关注的项目。提取动物中的蛋白质，传统方法为酸水解和碱水解，由 于产品中存在氯丙醇等毒索，同时该方法工艺落后，反应时间长，环境污染严重 。”1 。酶水解法提取动物中的蛋囱质属于离新技术，它的主要特点：t 蛋白质的 提取率高。2 工艺易控制，酶水解反应漱度低，反应时闻短，_ j e 环境浮染。3 产 品联化性质稳定，营养价值高，提取的h a p 以低分子量的小肽和有生物活性的l 型游离氨綦酸为主，速溶性好，翳于人体消仡、吸收。 h a p 主要应用于高档调味品和汤料生产。从七十年代起方便食品风靡世界， 为掇高产品质量和档次，匿本开发出雳h a p 为鏊辩酶缝天然风睬的高稻调味晶辩 馨囊理工大学工学硪士学住_ 仑文 汤料，由予品质优良，风睐独特，取得了广阔的市场和良好的缀济效益。近年来 国内部分合资厂家生产的方便面，也开始使用以h a p 为基料的离档汤料( 如“康 师傅”、“统一面”等) ，产晶市场占有率高，深受消费者欢迎。天然h a p 高级调味 料均从豳终进口，目前国内尚不能大批量生产h a p 。 缝天然h a p 裹缓蠲猿鹣，系放瑟鲜囊貔魏缀麓孛疆取h a p 调澍瑟痰，菠震该 种调味料可体现动物性食物的原味特色，是一釉品质极佳的天然调味料。利用h a p 为基料擞产的天然h a p 高级调味料，适用于方便食品、速冻食鼎、肉质食品、膨 化食品、焙烤食品等行业，魁提高产品质量斧口档次的必备调味品。以方便面生产 为例，我圜目前已有方便灏生产线1 2 0 0 余条，年产量约在l o o 1 2 0 万吨，约需 溺精1 0 1 2 万蘸，豫合资厂终，均生产爨拯产藏。国内方便嚣稳次较纛，主要爨 困是汤料嫩产工艺落君，仍停留在味精、食慧加辛香料的配方之中，由于国内不 能生产天然h a p 高级调咪料，影响到高档汤料的研制和开发，导致产品档次低， 市场占有率低。如果国内企业有1 0 改产高档方便面，则需高档汤料l 万吨，即 需h a p 慕料1 5 0 0 2 0 0 0 吨。随着人民生活水平提高，工作节奏加快，方便食品的 霉要鬟会越寒越大，因戴，天然h a p 毫缀调壤辩瓣枣缓潜力缀大。j 遨努，天然h a p 高级调棘辩也可进入餐饮数和家庭，日本市场上就有该静产晶，产品形式有猢狄 和粉剂，深受消费者欢迎。在我国天然h a p 高级调味料如进入家庭，需求量就更 可观了。目前国际市场上h a p 粉剂售价在1 万1 5 万美元吨，供不应求“1 。 根据以上所述，水解动物蛋白具有广阔的开发前景。水解动物蛋白是近年来 蓬勃发黻怒来戆瑟方向。扶我国嚣蘸发展战略嚣标来说，东瓣凌狻蛋毫具有卡分 重要静淼义。 1 3 动物水解蛋白产品特点 1 3 1 舆有天然肉香风眯和滋味，肉昧浓郁，鲜昧完美 凌貔窳惩蛋自来源予务穆亵类( 鸡、猪、串、垒等) ，戆真实髂瑷穗痘鑫稳( 建、 猪、牛、照等) 的天然风睬“”，经分解、浓缩、反应等过程詹，产生并超出了一 般烹调的效果，天然美味，1 ：3 昧复杂、深奥、浓厚“”2 “。 1 3 2 赣养丰富 蛋鑫屡被分瓣藏多耪氨蒸酸霹获娄，辔荔教天薅瀵耽啜投，挺毫了天体怼营 养秘矮酌有效利用“。 1 3 3 品质稳定，使用范围广 不怕高温蒸煮，冷却后能保持原来风味。故适合微波食品、冷冻食品、油榨 第一章绪论 食晶、褰遗罐头襄爨p l 蕊食品。 1 3 4 使用方便，使用照不受限制 产品为粉状，其有较好的水溶性。不论是在粉类，还是在赣类，都可直接根 据调味需要添加，使用量不受限制。并且能与其他配料很好地协同作用，形成套 种复合风味“。 。4 动物零解蛋白增番调昧橇理 我们知道，赠矮、蛋魏厦、碳承讫会妨_ 秘核糖是虑类细胞中的主娶成分，也 是肉类加工时产生香气的来源。不同的加工方法会产生不同的番气，原因是产生 香气戆前驱体，如筑基酸、核糖及脂肪农不同条件下有不同的反应，该反应过程 十分复杂”7 6 “。而不同的肉类，如牛、惫、猪、鸡，各有其不问的特殊香气，这 一特殊的差异主要是脂肪衍生挥发物不同“”“1 。肉类( 鸡、猪、牛、缀等) 缀酶 作用，其蛋白质被分解为氨基酸和欣类，与欣细胞中释旅出的还原糖、脂质在一 定条件下充分反应，产生类似烹调的效粜，形成番自特有的香气，香气自然丽稳 定“”。因j 毙在食品加工时能赋予食品良好的风睬。这里，必须指出，动物永解蛋 白悬肉香风味的调味基料丽非香精，其香气不及番精浓烈，而星现的熄自然清纯 的肉香风味和浓郁、醇厚豳感虽懿有良好的稳定性“”。一般风睬料原汁呈味成分 包括提取成分和非提取成分两大类。其分别包含的具体成分见裘卜1 ： 表1 - 1 一般风味料暇汁星睬成分”， t a b l e1 1f l a v o rc o m p o n e n to fs o m es t o c k 提取成分非提取成分 游离氨基酸：谷氨般等约2 0 种油脂： 多胶类 核酸关联成分：5 核苷酸、5 一肌苷酸 52 一鸟营酸、5 一艨嘌呤羧 核瞥：肌替、鸟苷商分子物质： 碱；次黄曝呤、鸟噪跨 有机碱：甜菜碱、三甲胺氯化物、肌酸酐 有穰i 酸：璇珀酸、溪酸、柠檬酸 糖类：蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖 无躐釜：鬣纯镳、镁、钙、磷酸靛 鸡脂 猪瑟 牛脂 鱼耱 蛋白质 稠黢 糖原 淀粉 华南理工大学工学硕士学位论文 表1 - 2 动物水解蛋白产品的成分分析“1 t a b l e1 2 c o m p o n e n ta n a l y s i so fh y d r o l y s i sa n i m a lp r o t e i n 十其中蛋白质= 氨基酸+ 多肽类 由表卜2 中一些动物水解产品的成分分析，可进一步了解动物水解产品的特 性。动物水解产品含有多种氨基酸、肽类及核苷酸类物质。游离的氨基酸和核苷 酸类都有极好的呈味能力，味道鲜美，而多肽则有微妙、复杂的香味，可使总的 味道协调、深奥。 1 5 动物水解蛋白产品在食品工业的应用 1 5 1 动物水解蛋白产品在方便面的应用 现在，方便面的竞争主要有两方面，一是面块的质量，其二是调味包的风味。 方便面冲泡后风味的好坏，调味包的作用十分关键。随着国内外配料发展的日新 月异，方便面的调味包早己摆脱传统一味精、盐、油的局面，经历了几代的更换， 使用h v p 、酵母精、核苷酸、有机酸和肉类抽提物等，力求体现圆润、浓厚、鲜 美、真实自然的风味。 采用酶解法生成的动物水解蛋白，作为天然肉风味的调味基料用于方便面调 味包中，避免了整个汤底口味单薄，清汤寡水的局面，能呈现出肉的甜香和浓厚 的滋味，真实自然。 1 5 2 动物水解蛋白产品在膨化食品中的应用 肉风味是膨化食品中的主导风味，使用由动物水解蛋白产品配制而成的膨化 料，能赋予膨化食品天然、真实的肉风味、营养、健康，能提高产品的档次。 1 5 3 动物水解蛋白产品在复合调味品的应用 近年来，复合调味料有了很大的发展，鸡精只是其中较有代表性的一种，目 前，已渐渐被大众所接受，成为进入千家万户的日用调味品“。它主要由鸡肉粉 与其他配料协调作用，不仅产生鲜美甘甜、肉味醇厚、深奥的口感，而且鸡风味 真实、细致。 由上可见，不同风味的动物水解蛋白产品，在不同食品行业中应用，能与香 辛料、香精等其他不同配料协同作用，能在其原有肉味浓厚、真实自然的基础上 第一章绫谂 产生不问综合、复杂的风昧，使口味更富于变化，满足不同需骚，使产品更具有 竞争力。此外，动物水解戳臼使用方便，只需依量添加，方便快捷。 动物水解蛋白可广泛地用于食品行业，有广阔的市场前景。随着新技术的应 用，如微胶囊，以及在反旋控制上的研究及艨用，产品的品质将鸯较大程度的掇 毫，产麓瓣品穰涛更鸯鬟多榉，套程予逶应鞠毽避我国食瑟工鼗熬发震。 1 6 水解动物氨基酸的分类及其生理功能 水解动物氨基酸就其化学结构含有四类。主要是脂肪族氨撼酸，谷氨酸、谷 氨酰氨、髓氨酸、丙氨酸、丝氮酸、苏氨酸、亮氨酸等；其次怒芳香族氨基酸： 苯嚣氨羧、酪氨酸；霉荚次是杂甄氨基酸，缀爨酸、色氨酸；簸聂是杂琢耍氨慧 酸、脯氨酸，这些氨基酸都能溶于水和稀酸”。氨基酸具有各自圈有的药理作用， 临床研究确认在肉体上有恢复肝功能、抗溃疡、提高免疫力、改善心脏功能等作 用，在精神上有抗忧郁、抗虑激、镇静等作用( 表卜3 ) 淡i - 3 氨基酸的药瑷作用”1 t a b l ei - 3p h a r 瓣氆e o d v 珏a 毽i c sf u n c t i o no fa m i n oa c i d 氨繁酸功能 缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 缝鬣羧 蛋氮黻 赖氨酸 苯丙氨酸 苏氨敝 懿懿羧 色氨酸 精氨酸 谷氯鼹； 胺 脯氨酸 黉爨黢 曹鬣黢 谷氨酸 强化肌肉、肝功能 同上 同上、抑制胍肉蛋白分解 副交懑神经戆镶羚 解郁、抗肿瘤 增进食欲，促进钙吸收 抗忧郁，镇静 抑制脂肪脬 撬应激 诱眠，抗恍郁 提高免疫力，n o 源，成长激素，胰岛素分泌脲循环活性化 提高免痰力，抗溃疡 创伤的治愈 糖颞玺，分泌胰冬素，分泌增盘糖素 神经转速 神经疲劳 1 7 本论文的立论依据和研究内容 华南理工大学工学硕士学位论文 1 7 1 立论依据 水产品含有丰富的蛋白质、微量元素及生理活性物质，其滋味与人们的口味 非常吻合，纯鲜可口，余味深长，有较强的适口性，其水解产物味道更好，因而 深受人们的喜爱。3 。鲢鱼( h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x ) 俗称“大头鱼”广泛 分布于我国沿海地区。近年来由于水产资源结构发生变化，鲢鱼资源富增，成为 国内产量最大的一种淡水鱼。鲢鱼不仅营养丰富，蛋白质含量高，而且价格低廉， 是一种极好的食品加工原料，尤其适合于制作高档调味品、汤料等。但鲢鱼肉质 柔嫩多水，难以贮运保藏，在国内主要以鲜销为主。随着鲢鱼产量的上升，大量 原料仍没能很好解决加工与贮运保鲜问题，造成资源的严重浪费。因此，如何科 学地开发利用鲢鱼资源，提高其经济价值，成为目前急待解决的问题。 本论文利用蛋白酶对鲢鱼蛋白进行深度水解，从提高鱼蛋白水解率，改善水 解液风味的角度出发，对酶法制取鲢鱼水解蛋白的工艺条件进行了系统研究。鲢 鱼蛋白的深度水解液中含有大量的游离氨基酸，是一种高营养的水解蛋白质溶液， 如何将这种蛋白水解液用于实际中，也是合理充分利用该动物蛋白资源的一个重 要方面。由于鲢鱼蛋白水解液中含有大量的呈味氨基酸，所以根据鲢鱼蛋白水解 液的这种特点，以鲢鱼水解蛋白为基料分别研制具有酱类和肉类香气的新型风味 料，为鲢鱼资源的深加工开发利用进行有益的尝试。 1 7 2 研究内容 1 7 2 1 首先研究利用蛋白酶进行鲢鱼蛋白的深度酶水解，提高游离氨态氮的生 成率，最终提高鱼蛋白的水解度。比较了不同单酶、多酶体系、复合酶对鲢鱼蛋 白的水解效果，初步探索利用含酶丰富的微生物一酵母，利用微生物自身所产生 的酶，对鱼蛋白进行水解，提高氨态氮的得率，比较几种不同防腐剂在蛋白质水 解过程中的防腐效果。 1 7 2 2 其次，在对鱼蛋白深度水解初步研究的基础上，以鱼蛋白水解液为原料， 利用美拉德反应分别合成酱类香味料和肉味香味料，通过条件优化，确定反应最 佳p h 值、温度和时间，通过添加其它物质，如乙醇、胡椒粉、蒜粉等以提高酱类 香味，降低氨态氮损失率；通过添加维生素b 。、l 一半胱氨酸、维生素c 等以提高 肉类香味，降低氨态氮损失率。 第二章鲢鱼蛋白深度酶解工艺的研究 第二章鲢鱼蛋白深度酶解工艺的研究 一方面近年来，随着我国水产资源的飞速发展，鲢鱼成为目前国内产量最大 的一种淡水鱼资源，广泛分布于沿海地区。由于鲢鱼肉质柔嫩多水，难以贮运保 藏，在国内主要以鲜销为主，有时甚至因易腐败变质而被大量丢弃，这样既浪费 鲢鱼这一宝贵资源，又对环境造成极大的污染；另一方面随着社会的不断进步和 人们生活水平的不断提高。人们对食品的要求也越来越高，食品除了要具有丰富 的营养之外，还要讲求色，香、味和天然性。鲢鱼不仅营养丰富，蛋白质含量高， 而且其价格低廉，极具开发利用价值。因此，近年来，关于如何综合利用鱼蛋白 资源的研究日益活跃和深入。但在众多的研究报导中，对综合利用鲢鱼蛋白资源 的报导却较少。 提取动物蛋白产品，传统方法为酸水解和碱水解“”，由于产品中存在氯丙醇 等毒素，同时该方法工艺落后，反应时长，环境污染严重。碱水解会使鱼蛋白水 解生成的氨基酸消旋化，从而失去部分营养价值”1 。而酶水解能使氨基酸在生物 学上保存有效的l 型，易于人体消化、吸收。多种酶配合进行水解能产生“协同 增效”的作用，这已为人们所利用。有鉴于此，本章对酶法水解鲢鱼蛋白进行了 研究，先从单酶水解鲢鱼蛋白入手，从中选择合适的酶复配以进行多酶水解的研 究，然后在多酶水解的基础上，分别采取分步加酶和同时加酶的方式，对比 f l a v o u r z y m e 和k o j i z y m e 这两种复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白的特点，探讨复合蛋白 酶解的机制，并最终确定了鲢鱼蛋白深度酶解的最佳工艺条件以获得高水解度和 高氨态氮得率的深度酶解产物( 氨基酸转化率7 0 ) 。由于蛋白质水解最终生成 氨基酸，氨基酸易腐败，因此，本研究也做了一些防腐实验。 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 鲢鱼( h y p o p h t h a l i c h t h y sm o l i t r i x ) ：市售 甲醛： n a o h n i s i n 牛血清蛋白 酒石酸钾钠 五水硫酸铜 汕头市光华化学厂 广州化学试剂厂 丹尼斯克( d a n i s c o ) 公司 上海东风生物制品有限公司 广州海珠区化学试剂厂 北京化学试剂厂 华南理工大学工学硕士学位论文 表2 一l 实验辑攥驹蛋自戆 t a b l e2 1t h ep r o t e a s e su s e di ne x p e r i m e n t 名褥嫠曩类型最逶p 珏最逶t ( ) 标注活力生产厂家 l a p u ：亮氨羧氨熬驳酶攀位，1l a p u 鄹：敦落和诺德分板方法a f 2 9 8 1 ，每分 钟水解1 微媵尔l 一亮氨酸一对硝基滩胺所需的酶鬣。 2 。2 主要仪器专设备 表2 - 2 主要仪器与设备 t a b l e2 - 2m a i ni n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 备名称生产厂家 j j 2 0 0 电子天平常熟市双杰测试仪器厂 7 2 1 b 型分光光度计上海市第三分析仪器厂 h h s 4 型嘏熟恒添水浴诵上海浦东跃欣科学仪器厂 8 0 0 型离心机上海手术器械厂 p h c 一2 蛩p h 计上海莱士象亿仪器研究室 p h i l i p s 搅拌器珠海飞利浦家用电器有限公司 托盘天平托窳医焉天平厂 k d n 一0 4 消化炉上海新嘉电子有限公司 k d n - 0 4 a 定氮佼上海薪嘉恕子有隈公司 w m z k 0 1 温度指示控制仪上海医用器械厂 w a t e r s 舞效液稳色谱仅、p i c o t a g 氨灌酸分聿厅程美国 2 1 3 酶法提取惫蛋自永解液工艺 鱼裹一绞碎一加水一酶解一灭酶一除渣一离心一过滤一水解 液 2 。 。4 分耩方法 2 。1 4 1 鱼肉蛋白质的测定“8 1 蛋白质测定南微量凯式定氮法 8 第二章鲢鱼蛋自深瘦酶簿工艺弱磺究 2 1 4 2 氨态氮生成率的测慰0 9 1 氮基酸态氮嫩成率( 水解度明) = ( 游离氨态氮总蛋白氮) 1 0 0 承瓣后产生魏游辩氨态氮耀擎袋滚定法溅霆。 2 1 4 3 可溶性鬻自质含量测定o ” 1 2 t c a 沉淀后上清液用微量凯氏定氮法测定，小肽含量= t c a 可溶性氮一游离 氨基簸。 2 4 4 承鼷物巾爨基酸的分析 采用美国w a t e r s 高效液相色谱仪、p i c o t a g 氨基酸分析楗，3 8 ，2 5 4 n m 检测波长，流速为i m l m i n 条件下对鱼豢自酶解液进行氨基酸分析，测定水解物 串慧氨基酸含量氍游离氨基黢含量。 2 2 结果与讨论 2 2 鱼亵的爨自蒺含量 本实验采用新鲜市售鲢惫为原料，测得其蛋白质的含量为】4 8 。 2 2 。2 生、熟、冻鱼肉酶瓣效果的辑究 称取l o o g 耨鲜鱼肉，加入l o o m l 水，搅碎后加入原料量0 2 a l c a l a s e 鬣白 酶混合，在温度为5 0 。c 、自然p h 值下保温( 以下均相同) ，每隔一段时间测定游 离氨基酸含量。另外称取l o o g 叛鲜鱼肉，加入l o o m l 水，煮沸匿搅碎，最后称取 l o o g 冻鱼囊，躲冻、搅碎嚣麓入l o o m l 承，螽步骤均鬻上。 图2 - i 可见，经过加热处理的熟鱼肉和经过冷冻处理的鱼肉的d h 值上升缓慢。 在网样的温度、时间、加酶爨的情况下，其水解率明最低于未经预处理的生熊肉 憨承簿率，说甓鲢鱼蛋叁鼷处理矗复嚣不澍于酶约窳矮 乍矮，这与门隆兴杏在 研究由牡蛎加工调味品中，鼷验由2 8 种蛋白酶进行酶解得出的结论相符“。这 与植物蛋白需要适当变性才能提高其水解度的结论相反。因为植物蛋白的组成结 构中，以含$ - s 键必主，适当热处理使焚变为松教、柔软的结构，有剽于酶鹅使 点的暴露，两惫辍自良s 珏蕊海主，不会s - s 键，鸯露热或冷冻使冀燹往，发堂分子 间或分子内的二硫交联而使其结构变得致密。同时，加热变性使煎肌肉收缩，酶 解位点被隐藏，这也是导致加热或冷却变性状态下其水解度较低的原因之一。同 霹这胃戆还与黧焦凌中本囊存在蠹源酶溪力套关，溺魏，在本謦嫒莠夔嚣续蜜验 中均采用不经预处理的生鲜原料。 华南理工大学工学硕士学位论文 2 5 2 0 担 v = 1 5 o 赵 涟1 0 5 o o 水解时间( h ) 图2 1 原料对水解度的影响 f i g2 - 1e f f e c to ft h em a t e r i a lo nd h 8 + 生鱼肉 + 熟鱼肉 + 冻鱼肉 2 2 3 内肽酶水解鱼蛋白的研究 蛋白酶是催化肽键断裂的一群酶类，根据作用位点的不同可分为内肽酶和端 肽酶两大类。蛋白质在酶的作用下，被水解为肽类、胨、月示、及氨基酸。不同 的酶具有不同的选择性和酶切位点“。内肽酶水解蛋白质时从蛋白质分子内部切 断肽键，生成分子量更小的各类中间产物。酶用量不同，水解结果也不同。酶与 蛋白质之间发生的反应一般可以分为三个阶段：( 1 ) 底物与酶形成米氏复合物： ( 2 ) 肽键断裂并释放出一小分子肽产物；( 3 ) 亲核试剂进攻米氏复合物的剩余部 分，断裂释放另一分子肽，并释放出蛋白酶。 2 2 3 1 单酶水解鱼蛋白的研究 取一定量新鲜的碎鱼肉( 5 0 9 ) ，加入等量的水，再分别加入碱性蛋白酶0 1 m l ， 中性蛋白酶0 1 m l ，胰酶0 1 9 ( 分别占原料量的0 2 ) 进行混合，在5 0 。c 下保温， 每隔一段时间测定游离氨基酸含量。 从图2 2 可以看出：随着水解的进行，鱼蛋白的水解度不断上升但增加的幅 度逐渐减小。究其原因：( 1 ) 底物浓度的减小，反应位点逐渐被酶分子所饱和； ( 2 ) 底物浓度的增加使得竞争性抑制变强：( 3 ) 酶活性的降低；( 4 ) 中间复合物 的积累达到恒定。这些因素的综合作用使水解度的强度降低，表现为水解度趋于 平缓。 对比相同酶加入量时各酶解产物的水解度，可以反映酶水解鱼蛋白的能力。 在相同水平的酶加入量上，碱性蛋白酶和中性蛋白酶的水解产物其水解度明显地 第二章鲢鱼蛋白深度酶解工艺的研究 高于胰酶，水解液风味也较好而胰酶水解液则有较重的苦味；碱性蛋白酶的水解 产物其水解度略微高于中性蛋白酶，两者相差无几，此外胰酶的价格远高于另两 种微生物蛋白酶。所以碱性蛋白酶或中性蛋白酶是一种可取的工艺，而胰酶则不 够理想。 3 5 3 0 ，、2 5 誉 一2 0 凸 譬1 5 长1 0 0 0 024681 01 2 水解时间( h ) + a l c a l a s e 酶 + n e u t r a s e 酶 + 胰酶 图2 - 2 不同单酶对鱼蛋白水解度的影响 f i g2 - 2e f f e c to fd i f f e r e n te n d o e n z y m e so nd h 综上所述，a l c a l a s e 、n e u t r a s e 、胰酶三种蛋白酶表现出典型内切酶的性质： 主要从蛋白质分子内部切断肽键并且在最初的卜2 小时内水解能力最强“”，随后 减弱；水解产物氨态氮得率低，鱼蛋白的水解度有待进一步提高。在同样酶加入 量水平下，氨态氮得率最高的为a l c a l a s e ，其次为n e u t r a s e ，最后为胰酶。 2 2 3 2 多酶水解鱼蛋白的研究 2 2 3 2 1 不同种类多酶对鱼蛋白水解度的影响 由于不同的酶在底物的作用位点不同，因而多种酶水解时往往产生“协同增 效”作用。相同酶量的条件下，多酶比单酶的水解能力有显著的提高：水解度相 同时所得产物的种类和含量却完全不同。本节实验在酶总量( 鱼肉量的0 2 ) 不 变的前提下，分别按照a l c a l a s e ：n e u t r a s e = l ：1 、a l c a l a s e ：胰酶= l ：1 、n e u t r a s e ： 胰酶= 1 ：1 、a l c a l a s e ：n e u t r a s e ：胰酶= l ：l ：1 的比例混合成多酶，对鱼蛋白进行 水解，期望进一步提高产物中游离氨基酸的浓度。 由图2 3 可以看出，水解能力由强到弱的搭配依次为a l c a l a s e ：n e u t r a s e ：胰 酶= 1 ：1 ：l 、a l c a l a s e ：胰酶= l ：l 、a l c a l a s e ：n e u t r a s e = i ：i 和n e u t r a s e ：胰酶= l ：1 。 n e u t r a s e 和胰酶按照1 ：1 混合成的多酶在水解能力上明显低于其它三种搭配，而 华南理工大学工学硕士学位论文 且其它三种搭配对鱼蛋白水解度的影响十分接近，再考虑到胰酶价格较贵，由此 选择a l c a l a s e 、n e u t r a s e 作为研究多酶水解的组分。比较图2 2 和2 - 3 可以看出， 多酶的水解能力要强于单酶的水解能力，其原因是2 种单酶的专一性不同，能从 更多的位点切断肽链，因而提高水解率。同时感官评定表明，多酶的水解液保持 了良好的风味，其腥味和苦味明显比单酶的小。 釜 v 吞 世 漤 * 3 5 3 0 o3691 21 51 82 l2 4 水解时间( h ) - a ：n = 1 ：1 + a ：胰= 1 ：1 + n ：胰= 1 ：1 + a ：n ：胰= 1 ：1 ：1 图2 3 不同种类的多酶对水解度的影响 f i g2 - 3e f f e c to fs e v e r a lp r o t e a s e so fd i f f e r e n t v a t i e t i e so nd h 2 2 3 2 2 不同比例的多酶对鱼蛋白水解度的影响 根据2 2 3 2 1 实验结果，采用a l c a l a s e 和n e u t r a s e 复合时( 两者比例为 1 ：1 ) 作用较佳。但由于两种酶对鱼蛋白作用结果不同( 图2 2 ) ，所以在酶总量 不变的条件下，两种酶复合时比例不同，则水解结果也会有所区别。本实验采用 酶总量占原料总量的0 3 ，碱性蛋白酶与中性蛋白酶之比分别为1 ：2 ，2 ：1 ，1 ：1 进行水解，水解条件不变，所得实验曲线如图2 4 所示。 a l c a l a s e 和n e u t r a s e 虽然都是内切酶，但两者作用于底物的位点不同，因 此将两者按不同比例搭配水解鱼蛋白时，所生成产物的种类和数量也不同。由图 2 4 结果可知，各种酶复合使用时，不同的比例会有不同的水解结果，两种内肽 酶复合时的最佳比例为：碱性蛋白酶：中性蛋白