（食品科学专业论文）长寿老人源双歧杆菌优良菌株的筛选及生理功能研究.pdf

中文摘要目前，在我国乃至世界范围内优良乳酸菌资源的开发和利用己成为热点。本课题针对国内外双歧杆菌的研究现状、存在的问题等，以世界第四长寿区广西巴马百岁以上长寿老人源双歧杆菌为试材，从优良菌种的筛选、生物学特性研究、生理功能探讨与验证等方面进行了较为系统、全面的研究，以期为我国安全、优质、高效的食品用双歧杆菌发酵剂及活菌制剂的研制与开发提供理论依据、微生物资源及技术支持。具体从以下几个方面展开研究工作：1 以人结肠腺癌细胞系h t - 2 9 细胞为试材，对来源于长寿老人肠道的2 4 株双歧杆菌进行了体外黏附试验。结果发现，双歧杆菌均具有一定的黏附能力，其中的订f 、z 2 、t z 5 、j - 1 菌株具有较高的黏酣髓力。进一步对4 橡初筛双歧杆菌耐胃酸、胆汁酸和合成b 族维生素能力的试验发现，双歧杆菌丌f 菌株不仅能合成较高的b i 、b 2 、b b 、b - z 等多种b 族维生素，而且在p h3 0 的条件下处理1 2 0 m i n 存活率达9 3 1 1 ，同时在2 胆盐浓度下处理2 4 h 有较好的存活，具有显著的综合优势。通过形态学、生理生化等相关指标的鉴定该菌株为长双歧杆菌。2 以筛选出的长双歧杆菌t t f 菌株为试验菌对其生长规律、最佳生长培养基、最适生长温度、起始p h 值、促生长因子等生物学特性进行了研究。结果发现：1 ) 长双歧杆菌t t f 菌株在m r s 、改良m r s 和p t y g 三种培养基中的生长以致良m r s 培养基为最佳。通常培养6 h 进入对数期，1 2 h 进入稳定期，最适生长温度为3 7 c ，最适起始p h 值为7 5 ，活菌数对数值最高可达9 7 2 。2 ) 某些食品原料可作为双歧因子选择性促进双歧杆菌的生长。本试验条件下的牛奶( m ) 、胡萝b 汁( c j ) 和香菇浸提物( l e ) 三种食品原料对长双歧杆菌t t f 具有较好体外促生长作用的组合分别为：c j 一2 ，m 屯，l e - 2 。其中，l e 对双歧杆菌的体外促生长作用很大。同时，c j 与l e 的最适添加量均与m 的添加量有关。3 对长双歧杆菌1 v r f 与a t - 2 9 细胞黏附的相关因素、与常见抗生素、中草药的药敏性、体外清除活性氧自由基能力、增强机体免疫功能、润肠通便功能、维持和修复机体肠道正常菌群平衡作用等生理功能进行了较为全面的研究。研究结果为；1 ) 以金黄色葡萄球菌a t c c2 5 9 2 3 为质控菌，长双歧杆菌t t f 对8 类3 0 种常用抗生素的药敏性为对大环内酯类、头孢素类、青霉素类、b 一内酰胺酶抑制剂的复合物及其他类的氯霉素、呋喃妥因、利福平抗生素均敏感：对氨基糖苷类、糖肽类抗生素坶耐药；对四环索类抗生素表现出不同的药敏性。长双歧杆菌t t f 菌株经质粒d n a 的检测发现不含有质粒，说明其对药物的耐受性不为质粒编码；该菌不存在耐药因子传递的危险，可作为发酵食品或活菌制剂用安全菌种使用。2 ) 三类不同药效的中草药对长双歧杆菌t t f 体外生长的影响是不同的，除补益类中药可显著促进其生长外( p ( o 0 5 ) ，清热解毒类中药在1 、5 和1 0 三个试验浓度下随着浓度的增加抑制作用增强但均未达到显著性差异( p 0 0 5 ) ，而泻下类中药对受试菌均有显著的抑制作用( p o 0 5 ) 且大黄和芒硝达到极显著水平( p o 0 1 ) 。说明在临床使用清热解毒类、泻下类中药时，在保证疗效的前提下尽量使用低浓度并配伍补益类中药为佳。同时补益类中药均能显著促进双歧杆菌生长的结果也说明，在采用抗生素或其他药物治疗时适当配合使用补益类中药，可起到减弱药物对有益菌的抑制和杀死作用，从而起到修复和维持肠道菌群平衡的作用。3 ) 长双歧杆菌t t f 对h 卜2 9 细胞具有很强的黏附能力，其黏附作用受细菌浓度、细菌与细胞相互作用时间、温度和p h 值等的影响，并在一定范围内具有依赖性。胰蛋白酶处理双歧杆菌t t f 表面结构可导致其黏附的降低，说明长双歧杆菌t t f 菌体表面的蛋白质可能是细菌黏附素的主要组成成分。4 ) 在模型组成立的前提下，三组受试物组的小鼠首次排黑便时间、排便重量二项指标均极显著优于模型对照组和阴性对照组( p 0 叭) ，但排便粒数没有明显的差异。三组受试物组小鼠的小肠推进率极显著高于模型对照组( p 0 0 1 ) ，表明三种受试物对便秘小鼠均具有明显的润肠通便功效。就长双歧杆菌t t f 的三种受试物来讲，s c s 的效果高于i e 和l b 。5 ) 长双歧杆菌t t f 不同处理物灌胃盐酸林可霉索( l h ) 造成的菌群失调小鼠后可使肠道内双歧杆菌和乳杆菌极显著增加( p 0 0 1 ) ，产气荚膜梭菌显著降低( p o 0 5 ) ，肠杆菌、拟杆菌、肠球菌极显著降低( p o 0 1 ) ，说明该双歧杆菌无论l b 、i e 还是s o s 均可起至修复与调节机体肠道微生态平衡的作用。同时长双歧杆菌t t f 不同处理物灌胃正常小鼠后可使肠道内双歧杆菌和乳杆菌极显著增加( p o 0 1 ) ，肠杆菌极显著减少( p ( 0 0 1 ) ，拟杆菌、肠球菌显著增加( p o 0 5 ) ，但增加的幅度不及双歧杆菌和乳酸茵。说明该双歧杆菌的三种处理物均具有维持机体肠道内正常微生态平衡的作用。6 ) 长双歧杆菌t t f 三种受试物对环磷酰胺( c y ) 造成的i d 眦三项免疫指标均有显著( p 0 0 5 )或极显著( p o 0 1 ) 影响，在本试验选取的三个剂量范围内基本呈量效关系，且表现为s c s 的效果高于i e 和l b 。而对i l m 眦的非特异性免疫功能的影响普遍大于对小鼠的细胞免疫和体液免疫的影响。同时发现，长双歧杆菌t t f 的三种受试物对正常小鼠免疫功能影响的水平低于其对i d n i i各项免疫指标的影响。且无论l b 、i e 还是s c s 均不会改变小鼠自身正常的免疫功能。急性毒性试验表明，长双歧杆菌t t f 三种处理物对健康小鼠无急性毒性。7 ) 采用比色法、微量发光法和e s r 法对长双歧杆菌t t f 不同处理物体外清除活性氧自由基能力的研究结果表明，三种处理物均有一定的清除0 h 和0 2 的能力，且在本试验条件下与对照组相比达显著性差异( p i e l b 。关键词：双歧杆菌优良菌株筛选生物学特性生理功能i la b s t r a c tl a c t i ca c i db a c t e r i a , r e f e r r e dt oag r o u po fb a c t e r i at h a tc a l lf e r m e n th y d r o c a r b o n sa n dp r o d u c el a c t i ca c i d h a v el o n gb e e nf o u n da n du s e di nf e r m e n t e df o o d 。s u c ha sf e r m e n t e dm i l ka n dm e a tp r o d u c t s a tf i r s t , l a c t i ca c i db a c t e r i aw e r eu s e di nf o o di n d u s t r yo n l yf o rt e c h n o l o g i c a lp u r p o s e a sm o r ek n o w l e d g ea b o u tt h i sg r o u po fm i c r o b e sa r eo b t a i n e d ，p e o p l ef o u n dl a c t i ca c i db a c t e r i a , e s p e c i a lb i f i d o b a c t e r i a , h a v es o m eh e a l t h yf u n c t i o na n di n g e s t i o no ft h e s eb a c t e r i ac 3 qb r i n ga b o u ts o m eb e n e f i c i a le f f e c t st op e o p l e t h u sm o r ea n dm o r es c h o l a r sa r eb e c o m i n gi n t e r e s t e di ni a e t i ca c i db a c t e r i a n o w a d a y sd e v e l o p m e n to f n e ws o u r c eo f l a c t i ca c i db a c t e r i aa n dt h e i ra p p l i c a t i o ni nf o o di n d u s t r yh a v eb e e ng a i nw o r l d w i d ei n t e r e s t i nt h i ss t u d y , n e ws t r a i n so f l a c t i ca c i db a c t e r i aa r ei s o l a t e df r o mt h ef a e c e so f o l dp e o p l ea g e do n eh u n d r e dy e a r si nb a m a , o u a n g x ip r o v i n c e t h e i rb i o l o g i c a lc h a r a c t e f i s t i c sa n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sa r ca l s op r e l i m i n a r i l yi n v e s t i g a t e di nt h eh o p eo fo b t a i ns o m ev a l u a b l ep r o i n c i p l e so rb a s i ck n o w l e d g et h a tc a l lb er e f e r r e dt oi nt h et h ed e v e l o p m e n to ff o o d - g r a d eb i f i d o b a c t e r i as t a r t e ra n dm i c r o e c o l o g i c s m yr e s e a r c hw o r km a i n l yf o c u s e do nt h ef o l l o w i n ga s p e c t s ：1 u s i n ge e l o na d e n o c a r e i n o m ae e l l1 i n eh t - 2 9a st e s t i n gm a t e r i a l a d h e s i o nt e s tw a sc a r r i e do u tf o 2 4s t r a i n so f b i f i d o b a c t e r i ai s o l a t e df r o md e j e e t ao f l o n g e v o u sp e o p l ea g e do n eh u n d r e dy e a r s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l ls t r a i n sc o u l da d h e r et oc o l o na d e n o c a r c i n o m ac e l l sh 1 - 2 9 a m o n gw h i c ht h es t r a i n so ft t f z 2 ，t z 5a n dj - 1s h o w e dh i g h e ra d h e s i v ec a p a b i l i t y t h u st h e s ef o u rs t r a i n so fb i f i d o b a c t e r i aw e r ef u r t h e rt e s t e df o rt h e i re n d u r a n c et os t o m a c ha c i da n db i l ea c i d t h ep r o d u c t i o no f v i t a m i nbb yt h e s eb a c t e r i a lw e r ea l s ot e s t e d a l lt h e s et e s t si n d i c a t e dt h a tt h es t r a i no f t i th a sh i g ha b i l i t yt op r o d u c ev i t a m i nb l ，b 2 ，b s ，b 1 2 ，t h es u r v i v a lr a t ea f t e rt h et r e a t m e n tu n d e rp h3 0f o r1 2 0r a i nw a s9 3 1 1 ，a tt h es a m et i m e ，t h es t l a i nr r fc a ns u r v i v ea f t e rb e i n gt r e a t e dw i t h2 b i l ea c i df o r2 4 h a c c o r d i n gt oi t sm o r p h o l o g y , t o g e t h e rw i t hp h y s i o l o g i ca n db i o c h e m i c a lt e s t s ，t h i ss t r a i nw a si d e n t i f i e da sb i f i d o b a e t e r i al o n g u m 2 t h es t r a i no fmw a sf u r t h e rc h a r a c t e r i z e di nt e r m so fi t so p t i m a lg r o w t hm e d i a , t e m p e r a t u r e i n i t i a lp ha n dg r o w t hp r o m o t i n gf a c t o r s t h er e s u l t sa sf o l l o w s ：1 1b o n g u mr r fg r o w sb e t t e ri nm o d i f i e dm r sb r o t ht h a nm r sa n dp t y gb r o t h i tu s u a l l ye n t e r sl o g a r i t h ms t a g ea f t e r6h o u r so fi n o c u l a t i o na n de n t e r ss t a b i l i t ys t a g ea f t e r1 2h o u r s o p t i m a lt e m p e r a t u r ea n di n i t i a lp hf o ri t sg r o w t ha r e3 7 ca n d7 5 ，r e s p e c t i v e l y 2 ) s o m ef o o dm a t e r i a l s ，u s e da sb et ；a np r o m o t ei t sg r o w t h a c c o r d i n gt oo u rs t u d y , t h eb e s tc o m b i n a t i o no f t h r e ef o o dm a t e r i a l st h a tc a nc o n s i d e r a b l yp r o m o t et h eg r o w t ho f t t f 加v i t r ow a s2 c j 2 ma n d2 l e e x t r a c to fl e n t i n u se d o d e sc a l ls i g n i f i c a n t l yp r o m o t et h eg r o w t ho f i t eh o w e v e r , t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n so f t h ee x t r a c t so f c a r r o ta n da r er e l a t e dt ot h ea d d i t i o no f m i l k 3 + t h ef a c t o r si n f l u a n e i n g 丑o n gr r f sa b i l i t yt oa d h e r et oc o l o na d a n o c a r c i n o m ac e l lh t - 2 9 i t ss e n s i t i v n yt oa n t i b i o t i ca n dh e r b s ，i t se a p a b i l i t yt oe l i m i n a t ea c t i v eo x y g e n o u sf r e er a d i c a l s nv i t r o ，i t se f f e c t so nh a m a ni m l n u r l ef u n c t i o na n di n t e s t i n em i e r o f l o r aw e r ea l s os t u d i e d t h em a i nr e s u l t sa r e 1 ) w i t hs t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa t c c2 5 9 2 3a si n d i c a t o rb a c t e r i a , 且l o n g u mt t fs h o w e di t sa n t i b i o t i cs u s c 呻b i l i t yt o3 0a n t i b i o t i c so f8g r o u p s ：s e n s i t i v et om a c r o l i d eg r o u p ，c e p h a l o s p o r i ng r o u p ，p e n i c i l l i ng r o u p ，b l a e t u m a s a si n h i b i t o r s ，c h l o r a i i 】i p h e n i c o l ，n i t r o f u r a n t u i na n dr i f a m p i n ，a n dr e s i s t a n tt oa m i n o g l y c o s i d eg r o u pa n dp e p t i d eg r o u p ，w h i l ei i is h o w i n gd i f f e r e n ts u s c e p t i b i l i t yt ot e t r a c y c l i n eg r o u p d n ai d e n t i f i c a t i o no ft t fs h o w e di td o e sn o tp o s s e s st h ed r u gr e s i s t a n tp l a s m i d s ，i tm e a n st h a ti t sr e s i s t a n c et ot h ea n t i b i o t i c sw a s n te n c o d e db yp l a s m i d sa n dt h ep o s s i b i l i t yo fi n t e r c e l l u l a rt r a n s f e r r i n go f r e s i s t a n c eg e n e sw a se x c l u d e d s t r a i nt t fc a r lb es a f e l yu s e di nf e r m e n t e df o o d sa n dm i c r o e c o l o g i c s 2 ) t h ei n f l u e n c eo fh e r b s ，i n c l u d i n gf r u c t u al y c i lf r u c t u ss c h i z a n d r a o ，r a d i xe tr h i z o m ar e h m a n n i a er a d i xl s a t i d i s , r a d i xb u p l e u r i r a d i xr h e lm i r a b i l i t u md e p u r a t u m ，c o r t e xm a g n o l i a e , f r u c t u sf o r s y t h i a e , o nt h eg r o w t ho fb 1 0 n g u m1 t fi nv i t r ow a si n v e s t i g a t e d r e s u l t ss h o w e d ：r a d i xl s a t i d i s , r a d i xb u p l e u r ia n dr a d i xr h e is i g n i f i c a n t l yp r o m o t e dt h eg r o w t ho f 且l o n g u r a1 t r f ( p 0 0 5 ) i t sg r o w t hw h e na d d e da tc o n c e n t r a t i o no f1 5 a n d1 0 f r u c t u sl y e i lf r u c t u ss c h i z a n d r a oa n dr a d i xe tr h i z o m ar e h m a n n i a es i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h eg r o w t ho f 丑l o n g u mr r fr p o 0 s ) m o r e o v e r , t h ei n h i b i t o r ye f f e c t so fc o r t e xm a g n o l i a ea n df r u c t u sf o r s y t h i a ew e r es i g n i f i c a n tc o m p a r ew i t ht h ec o n t r o lg r o u pa ti e v e lo f1 t h e s er e s u l t sm i g h tb ev a l u a b l ea n da p p l i c a b l et om e d i c a lt r e a t m e n t f o ri n s t a n e e 。w ec a no s eh e r b s ，s u c ha sr a d i xl s a t i d i s , r a d i xb u p l e u r io rr a d i x 鼢“t or e d u c et h ei n h i b i t o r ye f f e c t so f a n t i b i o t i c so np r o b i o t i e si ni n t e s t i n e 3 1b o n g u mt t fh a sas t r o n ga b i l i t yt oa d h e r et oc e l lh t - 2 9 t h i sa d h e s i o ni si n f l u e n c e db yi t sc o n c e n t r a t i o n ，t h et i m et h a ti ti n t e r a c t e dw i t hc e l ll i n eh t - 2 9 ，t e m p e r a t u r ea n dp h i ns o m er a n g e t h ea d h e s i o ni sd e t e r m i n e db yt h e s ef a c t o r s w h e nt h ec e l l so f 丑a n g u m1 v r fw a st r e a t e dw i t ht r y p s i n ，i t sp e r f o r m a n c ec h a n g e d t h i si n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i ns e c r e t e da n dt r a n s p o r t e dt oi t se e f ls u r f a c eb y 且l o n g u m1 v r fm i g h tb et h em a i ni n g r e d i e n tc o m p o s i n go fa d h e s i o n 。4 ) w ee s t a b l i s h e dt h em o d e lg r o u pw i t hm i c e s u b j e c t s t h ei n d e so f t h ef i r s td e f e c a t et i m e ，t h ew e l g l l to f f a e c e so f l b ，陋a n ds c st r e a t e dg r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l yi m p r o v e dc o m p a r ew i n lt h em o d e la n dt h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p sf p o 0 1 ) b u tt h ed i f f e r e n c e so f t h ea m o u n to f t h ef a e c eg r a n u l e sw e r en o ts i g n i f i c a n t t h ec o n t e n t si nt h ei n t e s t i n eo f t h el b ，i ea n ds c st r e a t e dg r o u p sw a ss i g n i f i c a n f l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p 口 0 0 1 ) t h e s em e i l _ o st h a tt h el b ，i ea n ds c sc a ng r e a t l ym o i s t u r i z i n ga n dr e l a x i n gt h eb o w e l so ft h ec o n s t i p a t i o nm i c e ，a n ds c sw e r em o r ee 疵c t i v et h a ni ea n dl b 5 ) b yu s i n gl b ，i ea n ds c so f 丑o n g u mt r ft of e e dm i c ew h i c hl o s tt h e f ti n t e s t i n a lm l c r o e c o i n 西cb a l a n c ef o ri n g e s t i o no fa n t i b i o t i c s , w ef o u n dt h a tb 1 0 n g u mt t fc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s eb i f u t o b a e t e r i aa n dl a e t o b a e i l l ia n dd e c r e a s ee n t e r o b a c t e r i a e e a e ,b a c t e r o i d e sa n de n t e r o e o e c u si r im i c ei n t e s t i n eo 0 0 1 ) i ts i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc l o s t r i d i u mp e r f r i n g e mt o o ( 0 0 5 ) a l lt h e s es h o w e dt h a te a c ho fs c s ，i ea n dl bo f 最l o n g u mt t fc o u l dr e s t o r et h ei n t e s t i n a lm i e r o e c o l o g i cb a l a n c eo fa n i t a a l s i na d d i f i o n 丑l o n g u mt t fa l s oi n c r e a s e db i f i d o b a e t e r i a , l a c t o b a c i l l ir p o 0 1 ) a n dd e c r e a s e de n t e r o b a c t e r i a c e a e ( 卿o di r ii n t e s t i n eo fn o r m a lm i c ea f t e rf e dw i t hs c s ，i eo rl b b u ti ti n c r e a s e dt h en u m b l eo fb a c t e r o i d e sa n de n t e r o c o c c u s ( p i e l b t h e i re f f e c t so i ln o s p e e i a li m m u n i t ya r eg e n e r a l l yg r e a t e rt h a n0 ns p e c i a li m m u n i t y t h ei n f l u a n e eo fi vl b 1 ea n ds c so nn o i m a lm i c ei sn o ta se v i d e n ta so ni d m m t h e ya l ic a l l tc h a n g et h en o m l a lj m m u n ea b i l i t y s h o r tt i m et o x i c o l o g i c a lt e s t ss h o w e dt h a tl b i ea n ds c sw e r ei r n o c u o u st on o r m a im i c e 7 1t h ee f f e c t so f b o n g u mr r fo na c t i v eo x y g e n o u sf r e er a d i c a l sw e r ea l s os t u d i e db yc h e m i c a lc o l o d m e t r y , c h e m i l u m i n e s c e n tm e t h o da n de s r ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts c s i ea n dl ba l lc o u l de l i m i n a t e ，o ha n d0 2 扣v i t r o h o w e v e r , t h e i ra b i l i t yt 0e l i m i n a t et h e s er a d i c a l sw a sd i f r e r e n ta n dc o u l db er a n k e d 鲢s c s i e l b ，k e y w o r d s ：b i f i d o b a c t e r i a ，s t r a i n ，s c r e e n i n g ，b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sv独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：含争一乡时间：加4 年月夕日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：余手导师繇g 杉够时间：枷午年月，7 日时间：) 彤少年z 月 白缩略词表a b b r e v i a t i o n缩写英文全称中文全称c f ul a bb fc jml ek b 法l bi es c sp b sl t aw p cr p me p sn k 细胞i d m mc vi o 【c i c pa c i c pd o f th c 5 0d cd e l a p a ct e m 匣dd m p oc o l o n y f o r m i n gu n i t sl a c t i ca c i db a c t e r i ab i f i d u sf a c t o rc a r r o t j u i c em i l kl e n t i n u se d o d e se x t r a c tk i r b y - b a u e rl i v i n gb a c t e r i ai n t r a e e l l u l a rc e l l f r e ee x t r a c t ss p e n tc u l t u r es u p e m a t a n tp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n el i p o t e i c h o i ea c i dw h o l ep c p t i d o g l y c a nr e v o l u t i o n sp e rm i n u t em i n u t ee x o p o l y s a c c h a r i d en a t u r a lk i l l e rc e l l si m a m m o d e f i c i e n c ym i c em o d e lc y c l o p h o s p h a m i d ei m m u n eo r g a ni n d e xc l e a r a n c ei n d e xo f c a r b o np a r t i c l e sa d j u s t e dc l e a r a n c ei n d e xo f c a r b o np a r t i c l e sd i f f e r e n c eo f f o o d p a dt h i c k n e s sh a l f - h e m o l y s i sc o n c e n t r a t i o nd i p h e n o x y l a t ec o m p o u n dd i e t h y l e n e t r i a m i n e p e n t a a c e t i ea c i dn , n ，n n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e5 ，5 - d i m e t h y l 1 - p y r r o l i n e - n - o x i d c菌落形成单位乳酸菌双歧因子胡萝h 汁牛奶香菇浸提物药敏纸片琼脂扩散法活菌体菌体破碎物耗尽培养上清液磷酸盐缓冲生理盐水脂磷壁酸完整肽聚糖每m i n 转速( r r a i n )m i n胞外多糖自然杀伤细胞免疫功能低下小鼠模型环磷酰胺免疫脏器指数碳颗粒廓清指数表观黏度校正廓清指数足趾变化厚度半数溶血值复方地芬诺酯二乙烯三氨五乙酸四甲基乙二胺5 5 一二甲基一1 - - n l t 咯啉一n 一氧化物c bc a r b o n a t eb u f f e r碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液e d t ae t h y l e n e d i a m i n e t e t m a c e t i c a c i d二乙胺四乙酸e s re l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e电子自旋共振p h e n 1 ，1 0 - p h e u n n t h o l i n e邻菲罗林a pa m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵l hl i n c o m y e i nh y d r o c h l o r i d e盐酸林可霉素第一章文献综述双歧杆菌是蒂斯( t i s s i e r ) 在1 8 9 9 年首次从母乳喂养儿的粪便中分离到的一种革兰氏阳性无芽孢杆菌，迄今已近一个世纪。在这近一百年的历史进程中，双歧杆菌的研究历经了发现、认识、应用三个阶段。它曾归于奴卡氏菌属、棒杆菌属、乳杆菌属和放线菌属，直到上个世纪6 0 年代才作为独立的菌属。双歧杆菌属( b i f o d o b a e t e r i u m ) 主要寄生在人和动物肠道内，对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、控制内毒素血症、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用( a n m a c h a ! a m 酣以，1 9 9 9 ) 。它是人体肠道内正常菌群之一且与人终生相伴，但呈动态变化，双歧杆菌的存在和含量是人体健康的一个标志。1 1 双岐杆菌生物学特性1 1 1 形态双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 是革兰氏阳性、多形态杆菌。菌体形状呈y 字形、v 字形、弯曲状、刮勺状、棒状等。其典型的特征是有分叉的杆菌，因而取名为b i f i d u s ，拉丁语是裂开、分开之意( 康白，1 9 8 8 ：金世林，1 9 9 9 ) 。双歧杆菌不形成芽孢，亚甲基兰染色菌体着色不规则，无运动性，专性厌氧，过氧化氢酶阴性，不还原硝酸盐，吲哚反应阴性，明胶液化阴性，联苯胺反应阴性( 康白，1 9 9 8 ；g o m e s 甜a ，1 9 9 9 ) 。1 1 2 生活条件双歧杆菌最适生长温度3 7 - 4 1 ，最适发酵温度3 5 - 4 0 ( 2 。最低生长温度2 5 - 2 8 c ，最高生长温度4 3 - 4 5 c ：起始生长p h 值为6 , 7 7 0 ，在p h 值为4 5 - 5 0 以下或p h 值为8 0 8 5 以上的环境中一般不生长( c l a r kp fd f ，1 9 9 3 ) 。菌落为s 型，圆形凸起、光滑，边缘整齐；在血平板上，菌落白色或乳白色。但不同菌种可能有异染性，无抗酸性。1 i 3 代谢途径由于双歧杆菌缺乏醛酶和葡萄糖一6 磷酸脱氢酶而含有果糖- 6 磷酸解酮酶( f 6 p p k ) 所以双歧杆菌对糖类碳水化合物的分解代谢途径不同于乳酸菌的同型或异型发酵，而是经由特殊的双歧支路代谢途径( 康白，1 9 9 8 ) ，其中果糖- 6 一磷酸酮酶是其关键性的酶( 见图1 1 ) 其葡萄糖代谢是按果糖一6 - 磷酸酮酶途径水解，最后生成乙酸和乳酸二者摩尔比为1 5 ：1 ，不生成c 0 2 、丁酸、丙酸，所产乳酸皆为“l ”型，易消化吸收；d n a 碱基组成摩尔百分比为5 7 - 6 8 。c 0 2 对该菌有促进生长的作用。此外，双歧杆菌中还有“、p 半乳糖苷酶，d 、昏葡萄糖苷酶及人体不能消化的寡糖的酶类、肽酶、磷蛋白磷酸酶、胆酸代谢酶、结合胆酸水解酶、降解n 亚硝酸的酶等许多种酶类，参与代谢对人体有利。中国农业大学博士学位论文第一章文献综述2 葡萄糖r2 a t p( 1 )、2 a d p果糖- 6 一p( 3 )果糖一6 - p厂-厂赤藓糖- 4 - p甘油醛一3 一p景天酮穗一7 一pl( 4 )木酮糖一5 - p( d节棱糖一5 - p( 5 ) l核酮糖- 5 - pi木甯糖_ 5 _ p2 乙酰磷酸乙酰磷酸i ( 篇i乙酸i 已糖澈酶和6 磷酸葡萄糖异构酶26 - 磷酸果括磷酸酮酶3 转醛醇酶4 转酮酶55 - 磷酸核糖异构酶6 5 - 磷酸桩酮糖3 - 表异构酶z5 磷酸丰酮糖磷酸酮酶8 己酸擞酶9 乳酸脱氧酶图1 1 双歧途径f i gi ib i f i d u mp a t h w a y2团端酸一j乙一2 一1 1 4 对抗生素药物的敏感性双歧杆菌对抑制革兰氏阳性菌生长的抗生素、酶类和对厌氧菌有效的抗生素敏感，但对抑制嫌性厌氧菌感染有效的甲硝唑存在抗性。1 i 5 存在与分类根据d n a 同源性和糖发酵，双歧乳杆菌属可分为2 4 种( 1 9 8 6 年版的伯杰氏细菌学鉴定手册) ，存在于人体中的有：两歧双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u mb i f i d u m ) 、青春双歧杆菌( 置l e s c e n t i s ) 、婴儿双歧杆菌( 礁i n f a n t ) 、短双歧杆菌( 丑b r e v e ) 和长双歧杆菌( 且l o n g u m ) 。通常在婴儿肠道内以婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌占优势；在成人肠道中缺少这两种双歧杆菌，主要是青春双歧