（生物化学与分子生物学专业论文）pam14的细胞转染表达和定位.pdf

安擞医科大学硕士毕业论吏 英文缩写 a m p b p c d n a c l 心 d d m f d m s o d 0 髓 e c o l i e d t 八 e r g g f p h l m b p 1 n u n m i p - 2 a m l m o r f 4 m o p s 英文缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 a m p i e i l l i n b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d c a l fi n t e s t i n ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e d a y n ，n d i m e t h y l f o r m a m i d e d i m e t h y ls u l f o x i d e d r o p - o u tm i x e t h i d i u mb r o m i d e e s c h e d c h i ac o l i e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m g r a m g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n h o u r l i t r e c - m y cp r o m o t e r - b i n d i n gp r o t e i nl m i n u t e m b p - li n t e r a c t i n gp r o t e i n m i l l i l i t e r m o r t a l i t y f a e t o ro nc h r o m o s o m e4 3 一i n m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i c a c i d 中文全称 氨苄青霉素 碱基对 互补d n a 小牛肠碱性磷酸酶 天 n ，n 二甲基酰胺 二甲基亚砜 营养缺陷混合物 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 内质网 克 绿色荧光蛋白 小时 升 e - m y e 启动子结合蛋白1 分钟 p 1 结合蛋白 毫升 死亡相关因子4 3 ( n 吗啡啉) 乙磺酸 安徽医科大学硕士毕业论文 m r g n s f o d p a m l 4 p e g p c r r b r p m s d s s e c s e d t t f t r a p p 秭s m o r f 4 一r e l a t e dg e n ef a m i l y n - e t h y m a l e i m i d e - s e n s i t i v ef a c t o r o p t i c a ld e n s i t y p r o t e i na s s o c i a t e dw i t hm r g , 14 k d p o l y e t h y l e n eg l y c o l p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e t i n o b l a s t o m a r o t a t i o np e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s e c o n d s p o n d y l o e p i p h y s e a ld y s p l a s i a t a r d a t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r t r a n s p o r tp r o t e i np a r t i c l e t d s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e m o r f 4 相关基因家族 n 乙基顺丁烯二酰亚胺 敏感因子 光密度 m r g 相关蛋白1 4 聚乙二醇 聚合酶链反应 视网膜母细胞瘤 每分钟转数 十二烷基磺酸钠 秒 迟发性脊椎骨骨骺发育不良 转录因子 运输蛋白颗粒 三羟基甲基氨基甲烷 2 学位论文独创性声明 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特另0 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。 学位论文作者签名：毯压翌 日 期：趔z ：丝二2 i 学位论文使用授权声明 本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定。学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定 学位论文作者签名：孤二彗 导师签名：十g j 丕k 窘弋 魄刎棚例 魄勰。_ 1 安徽医科大学硕士毕业论文 p a m l4 的细胞转染表达和定位 摘要 目的近年来发现p a m l 4 蛋白可与r b 等介导转录蛋白结合，因而该蛋白很可能在转录 调控中发挥重要作用。为此，我们构建了带g f p 标签的p a m l 4 ( p r o t e i na s s o c i a t e dw i t h m r l 3 i1 4 k d ) 表达载体，将其转染至h e k2 9 3 t 细胞检测其表达，转染至c o s 7 细胞观 察p a m l 4 蛋白在细胞内的定位。 方法以含人p a m l 4 全长c d n a 序列的质粒p a c t 2 p a m l 4 为模板，用p c r 方法扩增 p a m l 4 编码序列，用限制性内切酶酶切p c r 产物，回收的目的片段，然后插入带g f p 标签的载体p c d g f p 中构建表达载体p c d g f p p a m l 4 。经酶切和测序鉴定正确后，将 构建正确的质粒转染至h e k2 9 3 t 细胞，提取蛋白质，用w e s t e r n 印迹法检测其表达； 转染至c o s 7 细胞，在荧光显微镜下观察其在细胞内的定位。 结果经限制性内切酶酶切图谱分析及d n a 序列测定证实p c d g f p p a m l 4 的构建是正 确的，w e s t e r n 印迹法检测此表达载体在h e k2 9 3 t 细胞中能够有效表达，荧光显微镜下 观察表明p a m l 4 主要在c o s 7 细胞的细胞核内定位，胞质内也有少量表达。 结论成功构建表达载体p c d g f p p a m l 4 ，通过细胞转染明确此表达载体在h e k2 9 3 t 细胞中能够有效表达，且p a m l 4 主要在c o s 7 细胞的胞核内定位。实验结果为进一步 了解p a m l 4 的功能提供了一定的基础。 关键词p 枷1 4 基因表达转染转录调控细胞定位 安徽医科大学硕士毕业论文 e x | a n dl o c a l i z a t i qo fp a m l 4i nt r a n s f e c t e dcelll6xoressiona nl o c a l t z a t i o no i 4i nt r a n s f e c t e d1 1 a b s t r a c t o b j e c t i v ep a m 14p l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nt r a n s c r i p t i o n ，s ow ew a n tt oc l o n ep a m i4 ( p r o t e i na s s o c i a t e d 诚t l lm r g ，14 k d ) g e n ei n t op c d g f p v e c t o ra n de x p r e s st h i sv e c t o ri n a p p r o p r i a t em a m m a l i a n c e l ll i n e st oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o na n dl o c a l i z a t i o no ft h ep r o d u c t o f p a m l 4g e n e m e t h o d st h ef u l ll e n g t he d n af r a g m e n to fp a m14i np a c t 2 - p a m14v e c t o rw a su s e da s t e m p l a t et ob ea m p l i f i e d 、析t l lp c r p c rp r o d u c ta n dp c d g f pv e c t o rw e r ed i g e s t e db y a p p r o p r i a t er e s t r i c t i o ne n z y m e ss e p a r a t l y ，a n dl i g a t e di n t op c d g f p p a m1 4c o n s t r u c t , w h i c h w a sc o n f i r m e db yd n a s e q u e n c i n g t h ee x p r e s s i o no f p c d g f p - p a m l 4w a sd e ! t e c t e di n h e k2 9 3 tc e l l s 、 r i mw e s t e m b l o ta n dc o s 7c e l l s 、i t i lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e r e s u l t sa n a l y s i so fr e s t r i c t i o ne n z y m e sh y d r o l y s i sa n dd n a s e q u e n c i n gd e m o n s t r a t e dt h a t t h ee x p r e s s i o nv e c t o ri n s e r t e d 、i t l lp a m 14 g e n ew a sc o n s t r u c t e di nf r a m e t h i se x p r e s s i o n v e c t o rc a ne x p r e s sp a mi4 - g f pp r o t e i na ts i g n i f i c a n tl e v e li nh e k2 9 3 tc e l l s ，a n dt h e p a m i4 一g f pp r o t e i nw a sf o u n dt ob ed i s t r i b u t e di nt h en u c l e io fc o s 7c e l l s ，a n ds o m ei nt h e c y t o p l a s m c o n c l u s i o n st h ee x p r e s s i o nv e c t o rp c d g f p - p a m 14w a sc o n s t r u c t e dc o r r e c t l y t h ev e c t o r p c d g f p - p a m 14c a ne x p r e s se f f i c i e n t l yi nh e k2 9 3 tc e l l s ，a n dd i s t r i b u t e dm a i n l yi nt h e n u c l e io fc o s 7c e l l s t h er e s u l t sp r o v i d et h eb a s i sf o rf u l t h g rf u n c t i o ns t u d i e so fp a m i4 k e yw o r d sp a m l4 g e n ee x p r e s s i o n t r a n s f e c t i o n t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n 4 安徽医科大学硕士毕业论文 1 前言 p a m l 4 的细胞转染表达和定位 正常体细胞在培养过程中生命是有限的。经过有限次的细胞分裂后，细胞即进入不 可逆的不分裂期，但细胞仍然能够存活至少三年，这一过程称为复制性衰老，是体内细 胞衰老的代表机制，也是一种抑癌作用机制。正常细胞同永生细胞的杂交说明衰老是显 性表型【l l 。为了研究细胞衰老的分子机制，d u n c a n 等将各种正常细胞与永生细胞融合 得到杂交的具有分裂潜能的细胞，这研究明确了4 组杂交细胞( a 、b 、c 、d ) 具有这 种分裂潜能，同时也初步揭示了这些正常细胞经过杂交可获得有限的分裂潜能口一鲫。h u n t 等对b d 组细胞的研究发现，可能存在的衰老相关基因定位在人类4 、1 和7 号染色 体【4 1 。进步的研究发现4 号染色体上的- 4 , 段基因与细胞不死有关，其中m o r f 4 ( m o r t a l i t y f a c t o ro nc o m o s o m e4 ) 基因可引起b 类细胞出现衰老，并由此发现了与衰 老相关的一个基因家族m o r f 4 r e l a t e dg e n ef a m i l y ( m r g ) 家族5 卅。这一家族在细胞 衰老和增殖，转录调节及d n a 的损伤修复过程中发挥重要的生物学功能。m r g l 5 家族 共有7 个成员，但只有m o r f 4 ，m r g l5 ( m o r f 4 r e l a t e dg e n e0 1 1c h r o m o s o m e15 ) 和 m r g x ( m o r f 4 - t d a t e dg e n e0 1 3c h f o m o s o m ex ) 可以正常表达，其它四个成员为m r g1 ， m r g5 ，m r gl l ，m r o4 【6 j 。 n w l 4 ( p r o t e i na s s o c i a t e dw i t hm r o ，1 4 k d ) 是l e u n g 等朔通过酵母双杂交实验筛选 与m r g l 5 相互作用的蛋白质时发现的一种新的蛋白质，p a m l 4 基因全长e d n a 序列 共1 2 0 5 个碱基对，编码一个含1 2 7 个氨基酸残基的p a m l 4 蛋白，分子量为1 4 k d 。p a m l 4 是一种与m r g ( m o r f 4 - m l a t c dg e n ef a m i l y ，m r g ) 基因家族和r b 蛋白( m t i n o b l a s t o m a t u m o rs u p p r e s s o rp r o t e i n ) 相关的蛋白1 7 捌。 p a m l 4 蛋白序列具有高度的保守性，对其蛋白质的二级结构进行分析发现p a m l 4 蛋白结构中含有三个长的n 螺旋，还含有多个卷曲螺旋结构域( 。0 i l e d c o i lr e g i o n ) ，一 种可介导蛋白质之间的相互作用的结构域 7 11 9 。 安徽医科大学硕士毕业论文 1r pld iv elaep eev e vl ep ee 坠至星q 至坠l 至里堇照至丛基星卫l 点 4 0 曼坠! 基至塾垒基矗里圣基n r s k 坠堕星丛墅班丛坠! q ! k ! q y 至蔓至星曼坠盟 8 0 塾量q n pc d 矗矗星垒基矗基基星k 矗至星k 矗k 呈堇矗基毡至丛ly 圣坠篁壁翼 1 2 0 蝉s ess 图lp a m l 4 蛋白序列图( 划线部分表示可能存在的卷曲螺旋结构域) f i g1p r o t e i ns e q u e n c eo f p a m l 4 ( u n d e r l i n e ds e q u e n c ed e n o t e sr e g i o n sw i t hp r e d i c t e dc o i l e d - c o i lm o t i f s ) 小鼠的p a m l 4 蛋白序列与人的高度一致，人p a m l 4 和小鼠p a m l 4 蛋白质具有8 6 的同源性，都在3 端不翻译的区域含有一个长2 5 0 b p 的内含子。研究表明p a m l 4 在 小鼠的各个组织中广泛表达，在脑，心脏以及睾丸中表达量最高。这与m r g l 5 和m r g x 分布是高度一致的。更令人感兴趣的是p a m l 4 在小鼠胚胎时期表达量是逐渐升高的， 七天时达到最高峰，而随后的发育过程中表达趋于稳定【1 0 1 。 研究显示p a m l 4 能与m o r f 4 撇家族蛋白以及肿瘤抑制蛋白r b 结合，从而表 明p a m l 4 可能参与细胞生长、永生化( i m m o r t a l i z a t i o n ) 以及衰老等生命过程【7 】【引。 本实验室通过酵母双杂交实验证明p a m l 4 也可以和s e d l i n 蛋白相互作用。s e d l i n 蛋 白是一种高度保守的蛋白质，由s e d l 基因编码【l l l ，其基因序列s e d l 的突变可引起迟 发性脊椎骨骨骺发育不良( s e d t ) 。s e d l 基因定位于x p 2 2 2 x p 2 2 1d x s l 6 和d x s 9 2 之间的区域【1 2 , 1 3 l ，含有六个外显子。人基因组中还包括7 个s e d l 假基因，分别被称为 s e d l p l 7 ，其中的s e d l p l 具有表达功能。虽然s e d l p l 和s e d l 的开放读码框架序 列不完全一致，但是它们编码的蛋白质的氨基酸序列相同。g h o s t 等【1 4 】通过酵母双杂交 实验从h e l a 细胞c d n a 库中筛选出e - m y e 启动子结合蛋白1 ( c - m y cp r o m o t e r - b i n d i n g p r o t e i n1 m b p 1 ) 的结合蛋白m i p 2 a ( m b p 1i n t e r a c t i n gp r o t e i n ) 。研究表明，m i p 2 a 可以减少m b p 1 对转录的抑制作用，并且可以对抗在成纤维细胞中m b p 1 介导的细胞 死亡。m i p 2 a 的编码基因定位于人1 9 号染色体，其编码序列与s e d l 基因的编码序列 完全相同。 6 安擞医科大学硕士毕业论支 为了探讨p a m l 4 的功能，我们在克隆这一基因的基础上构建了带g f p 标签的表达 载体p c d g f p p a m l 4 ，并将其转染h e k2 9 3 t 细胞和c o s 7 细胞，对p a m l 4 在细胞内 的表达和定位进行了初步的研究。 2 材料与方法 2 1常用仪器及材料 2 1 1 常用仪器 ( 1 ) p c r 仪，珠海黑马医学科学仪器公司，4 8 0 0 型； ( 2 ) 电热恒温培养箱，d n p 9 1 6 2 型，上海精宏实验设备有限公司； ( 3 ) 电热恒温鼓风干燥箱，d h f 9 2 0 3 a 型，上海三申医疗器械有限公司； ( 4 ) 电子天平，j y 2 0 0 2 型，上海精密科学仪器有限公司； ( 5 ) 精密酸度计，p h s 3 型，上海天达仪器有限公司； ( 6 ) 磁力加热搅拌器，7 8 1 型，国华电器有限公司； ( 7 ) 超净台，h s 8 4 0 u 型，苏净集团安泰公司； ( 8 ) 电热恒温水槽，d k 8 d 型，上海精宏实验设备有限公司； ( 9 ) 气浴恒温振荡器，s h z 8 z 型，常州国华电器有限公司； ( 1 0 ) 水浴恒温振荡器，s h a - c 型，常州国华电器有限公司； ( 1 1 ) 手提式不锈钢蒸气消毒器，y x 2 8 0 a ，上海三申医疗器械有限公司； ( t 2 ) 高速离心机，t g l 1 6 h ，珠海黑马医学科学仪器公司； ( 1 3 ) 冷冻高速离心机，t g l 1 8 r 。珠海黑马医学科学仪器公司： ( 1 4 ) 大容量冷冻低速离心机，l x j i t 型，上海医用分析仪器厂； ( 1 5 ) 快速混匀器，s k 1 型，常州国华电器有限公司； ( 1 6 ) 纯水机，d z g 3 0 3 a 型，上海生仪分析技术有限公司； ( 1 7 ) 紫外可见分光光度计，u v - 7 5 4 ，山东高密彩虹分析仪器有限公司； ( 1 8 ) 紫外手提式分析仪，z f p 型，上海长明光学电子仪器厂： 7 安徽医科大学硕士毕业论文 ( 1 9 ) 石英比色皿，q - 4 4 型，江苏宜兴市晶科光学仪器有限公司； ( 2 0 ) 超低温冰箱，u l t1 3 8 6 3 v 3 6 ，r e v c o ； ( 2 1 ) 核酸蛋白质凝胶图象分析系统，g s g 2 0 0 0 ，黑马仪器公司； ( 2 2 ) 微量移液器，2 0i x l 、2 0 0g l 、1 0 0 0m ，上海大龙； ( 2 3 ) 电泳仪，d y y 1 0 型，北京六一仪器厂； ( 2 4 ) 电泳槽，d y y u i 型，北京六一仪器厂； ( 2 5 ) 荧光显微镜o l y m p u s ，b x 6 1 型； ( 2 6 ) c o2 恒温培养箱，美国s h e l d o nm a n u f a c t u r i n g ，i n c ( 2 7 ) 电泳仪，美国b i or a d0 4 i b r ； ( 2 8 ) 垂直电泳槽，美国b i or a d5 2 5 b r 。 2 1 2 质粒和菌株 ( 1 ) 质粒p c d g f p ：为带有g f p 标签的p c d n a 3 载体，由中国科学院上海生物化学与 细胞生物学研究所朱学良博士构建并提供。 ( 2 ) 大肠杆菌t g l 菌株：本实验室保存。 ( 3 ) 质粒p a c t 2 p a m l 4 由本实验室保存。 2 1 3 常用材料 ( 1 ) t a q 酶( 5u o i ) 为t a k a r a 产品。 ( 2 ) d n t p s ( 2 5 m m ) 、x d n a b a m hi + h i n d i i im a r k e r ( 0 1m gd n a m 1 ) 、t 4d n a 连接酶( 1u 叫) 、小牛肠碱性磷酸酶( c i a p ，1o p 1 ) 、d n t p s ( 2 5 m m ) ，均为f e r m e n t a s 公司产品。 ( 3 ) 限制性内切酶b a m hi ( 1 0u i t l ) 、e c o ri ( 1 0u i - t 1 ) 均为f e r m e n t a s 公司产品， 各种酶的酶切位点如下： b a m hi ：g g a r c ce c o ri ：g a a t t c c c t a g g c t r a a g ( 4 ) r n a s e a 酶( 1 0 0m g m 1 ) ，d m s o ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) ，t m e m d 购自s i g m a 公司。 3 安徽医科大学硕士毕业论文 ( 5 ) 胰化蛋白胨、酵母提取物为o x i o d 产品。 ( 6 ) 氨苄青霉素( a m p ) 、t r i s 碱、e d t a - n a 2 购自沃德赛斯生物公司。 ( 7 ) 琼脂为b b i 产品。 ( 8 ) 二甲苯青f f 、m o p s 、p 巯基乙醇均为a m l e s c o 产品。 ( 9 ) 小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。 ( 1 0 ) 胶回收( 小量) 试剂盒购自北京道普生物科技有限公司。 ( 1 1 ) 质粒大量抽提纯化试剂盒购自q i a g e n 公司。 ( 1 2 ) 定性滤纸购自杭州富阳特种纸业有限公司。 ( 1 3 ) 微孔滤膜( 孔径为0 2 2l u n ) 和硝酸纤维素滤膜( 孔径0 2 2l x m ) 分别购自新亚净 化器件厂和上海医药工业研究院上海亚东核级树脂有限公司。 ( 1 4 ) 丙稀酰胺，甲叉双丙稀酰胺，过硫酸胺，甘氨酸为a m r c $ c o 产品。 ( 1 5 ) n p - 4 0 ，t r i t o n x 1 0 0 ，p m s f 购自b b i 公司。 ( 1 6 ) 蛋白质m a r k e r 购自f e r m e n t a s 公司产品。 ( 1 7 ) g f p 一抗购自s a n t ac r u z 公司；羊抗兔二抗购自北京金杉；e c l 显色试剂盒是 p i e r c e 公司产品。 ( 1 8 ) 其它试剂均为国产分析纯。 2 1 4 溶液配制 ( 1 ) e d t a 溶液( 0 5m o l l ，p h8 0 ) ： 将1 8 6 1ge d t a n a 2 j i l a 8 0 0m l 去离子水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用n a o h 调节溶液的p h 值至8 0 ，定容至ll ，高压蒸气灭菌1 5m i n 。e d t a 二钠盐需加入n a o h 将溶液的p h 值调至接近8 0 时，才会完全溶解。 ( 2 ) t r i s c i 溶液( 1m o l l ) ： 8 0 0m l 去离子水溶解1 2 1 1gt r i s 碱，加浓盐酸调p h 至所需值7 5 和8 0 。使溶液冷 却至室温，方可最后调定p h 值，加去离子水定容至ll ，分装后高压蒸气灭菌1 5r a i n ， 4 储存备用。 ( 3 ) 1 0 t e 溶液( p h8 0 ) 9 安徽医科大学硕士毕业论文 1m o l lt r i s c i ( p h8 0 )1 0 0m l 0 5m o u le d t a ( p h8 0 )2 0m l 加去离子水至1l 。高压蒸气灭菌1 5m i n ，室温保存。使用时稀释为1 。 ( 4 ) l b 固体培养基 在9 5 0m l 去离子水中加入： 胰化蛋白胨 1 0g 酵母提取物 5g n a c i 1 0g 琼脂 1 5g 用n a o h 调p h 值至7 0 。用去离子水定容至ll ，高压蒸气灭菌1 5m i n 。取出培养 基，稍冷却后从烧瓶中倒至平板。待培养基完全凝固后，倒置平板并储存于4 。c 备用。 ( 5 ) s o b 培养基( 1l ) 胰化蛋白胨 2 0g 酵母提取物 5g n a c l0 5g 加入2 5 0m m o l lk c i 溶液1 0i l l l ，用n a o h 调节溶液的p h 值至7 0 ，加去离子水定 容至1l ，高压蒸气灭菌1 5m i n 。 ( 6 ) 转化缓冲液( 用于大肠杆菌感受态制备) 转化缓冲液1 ( 1l ) k c i 7 4g m n c l 2 4 h 2 0 9 9g c a c l 2 2 h 2 0 1 5g 甘油 1 5 0 0g 乙酸钾( 1m o l l ，p h7 5 ) 3 0 0 m l 用0 2m o l lh a c 调p h 值至5 8 ，加去离子水定容至1l 。过滤除菌，4 储存。 转化缓冲液2 ( 1l ) l o 安徽医科大学硕士毕业论文 m o p s ( 0 5m o l l ，p h6 8 ) 2 0 0 0m l k c l0 7 4g c a c l 2 。2 h 2 0 1 1 0 0g 甘油1 5 0 0 0g 加去离子水至ll 。过滤除菌，4 储存。 ( 7 ) 氨苄青霉素储液( 1 0 0m g m 1 ) - lg 氨苄青霉素溶于1 0m l 去离子水，0 2 2 肿滤膜过滤除菌，分装于1 5m le p 管中， 一2 0 储存。 ( 8 ) l b 液体培养基 在9 5 0m l 去离子水中加入： 胰化蛋白胨 1 0g 酵母提取物 5g n a c l1 0g 用lm o l ln a o h 调p h 值为7 0 ，用去离子水定容至ll ，高压蒸气灭菌1 5r a i n 。 ( 9 ) l b 固体培养基( 氨苄青霉素抗性) 按照上述配方配制的l b 液体培养基在灭菌前加入： 琼脂( a g a r ) 1 5g l 高压蒸气灭菌1 5m i n 。取出培养基应使培养基降温至5 0 - 6 0 ，方可按l 的量 加入氨苄青霉素储液。待培养基完全凝固后，倒置平板并储存于4 c 备用。 ( 1 0 ) lm o l l n a o h 溶液 将4gn a o h 颗粒慢慢加到8 0m l 去离子水中，边加边连续搅拌。颗粒完全溶解后， 加去离子水至1 0 0m l 。无须灭菌，于塑料容器中室温保存。 ( 1 1 ) 碱裂解溶液( 用于质粒提取) 碱裂解溶液i ( 1 0 0m 1 ) 葡萄糖 5 0m m o l l t r i s c l ( p h 8 o ) 2 5m m o l l 安徽医科大学硕士毕业论文 e d t a ( p h 8 0 ) 1 0m m o l l 高压蒸气灭菌1 5r a i n ，待冷却后4 。c 储存。 碱裂解溶液i i ( 1 0 0 m 1 ) i m o l ln a o h2 0 m l 1 0 ( m v ) s d s 1 0m l 去离子水7 0 皿 现配现用。 碱裂解溶液i i i ( 1 0 0m 1 ) 5m o l l 乙酸钾 冰醋酸 去离子水 6 0 0m l 1 1 5m l 2 8 5m l 4 保存，用时冰浴。 ( 1 2 ) 酚氯仿溶液( 5 0m 1 ) 平衡酚2 5 叫 氯仿 2 4m l 异戊醇 1n n 置于4 2 。c 水浴( 应先在室温水中浸几下，再于4 2 。c 水浴) ，直至变清为止。 ( 1 3 ) 2 m g m l 溴化乙锭( e b ) 在1 0 0m l 去离子水中加入0 2ge b ，磁力搅拌数h 以确保完全溶解，转移至棕色瓶 中，室温保存。 ( 1 4 ) 5 0 x t a e 溶液( 1l ) t r i s 碱 2 4 2 0 0g 冰乙酸 5 7 1 0 i i l l 0 5m o l le d t a ( p h8 0 ) 1 0 0 0 0m l 加去离子水至1l ，常温保存，使用时稀释为1 。 1 2 安徽医科大学硕士毕业论文 ( 1 5 ) 琼脂糖凝胶 按终浓度计算，称取一定量的琼脂糖，加入4 01 1 1 l1 t a e ，加热溶解，冷却至5 0 - - 6 0 c 时加e b ( 原浓度2m g m 1 ) 2 0 山，使之终浓度为1l x g m l ，混匀，倒胶。 ( 1 6 ) d n a 上样缓冲液 溴酚蓝0 2 5 ( m v ) 二甲苯青f f0 2 5 ( 所) 甘油3 0 0 0 ( 删) 常温保存。 ( 1 7 ) 铬酸清洁液 重铬酸钾 2 0 0g 去离子水 1 0 0 m l 浓硫酸 1 5 0 0m l 将重铬酸钾加入盛有适量水的玻璃容器内，加热，搅拌使溶解，待冷却后，将此玻 璃容器放在冷水浴中，缓慢将浓硫酸断续加入，不断搅拌，勿使温度过高，容器内溶液 颜色渐渐变深，并注意冷却，直至加完混匀。 ( 1 8 ) 1 0 p b s n a c i8 0g l k c i2g l n a 2 h p 0 4 1 4 4g l k h 2 p 0 4 2 4g l 调p h 值至7 4 ，使用时稀释为l x ，高压蒸气灭菌2 5m i n 。 ( 1 9 ) 1 0 x d h a n k s ( 1l ) n a c l8 0g k c i4 g n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 1 2g k h 2 p 0 4 0 6 9 安徽医科大学硕士毕业论文 葡萄糖 1 0g 过滤灭菌，4 。c 储存。 ( 2 0 ) 胰酶( 1l ) 胰酶 o 5g e d t a0 2g l o d h a n k s1 0 0m l 用碳酸氢钠调p h 值至7 2 ，加去离子水至ll ，过滤灭菌，分装，一2 0 储存。 ( 2 1 ) d m e m 取l 小袋d m e m ，加9 5 0m l 蒸馏水。用碳酸氢钠调p h 值至7 4 ，定容至ll 。过 滤灭菌，分装，4 c 储存。 ( 2 2 ) 谷氨酰胺( 含a m p 、k a r l ) 谷氨酰胺 a m p k a r l 过滤灭菌，- - 2 0 储存。 ( 2 3 ) 完全培养液( 2 5 0m 1 ) d m e m 小牛血清( 灭活) 0 1 6m m t 3 i l l 1 5m g m l 1 5m g m l 2 2 2 5m l 2 5m l 谷氨酰胺( 含a m p 、k a n ) 2 5m l ( 2 4 ) c a c l 2 溶液( 2m o g l ) 5 8 8gc a c l 2 2 h 2 0 溶于2 0n l l 去离子水中，过滤灭菌，一2 0 储存。 ( 2 5 ) 2 xh b s ( 1l ) n a c i 1 6 4g k c l 0 7 4g n a e h p 0 4 12 h 2 0 0 5 3 6g 右旋葡萄糖 2 1 6g 1 4 安徽医科大学硕士毕业论文 h e p e s1 1 9 2 g 调p h 值至7 0 5 ，加去离子水至ll ，过滤灭菌，一2 0 储存。 ( 2 6 ) d a p i 溶液 以浓度为1m g m ld a p i 溶于去离子水中，一2 0 。c 避光储存。 ( 2 7 ) 3 0 a c r b i c 储液 丙稀酰胺( a c r ) 3 7 5g 甲叉双丙稀酰胺( b i c ) 1g 超纯水至 1 0 0 m l 3 7 下溶解后，过滤，4 保存。 ( 2 8 ) 1 5 m o l lh s h c i ( p h 8 8 ) t r i s 超纯水 溶解后，用浓盐酸调p h 至8 8 ， 存。 ( 2 9 ) 0 5 m o l lt r i s h c i ( p h 6 8 ) i r i s 超纯水 溶解后，用浓盐酸调p h 至6 8 ， ( 3 0 ) 1 0 s d s s d s 蒸馏水至 4 5 4 3g 2 0 0 m l 最后用超纯水定容至2 5 0 m l ，高温灭菌后室温下保 1 5 1 4 2 0 0 m l 最后用超纯水定容至2 5 0 m l ，高温灭菌后室温下保存。 l og 1 0 0 m l 5 0 水浴下溶解，室温保存。 ( 3 1 ) 1 0 过硫酸胺( a p ) 过硫酸胺 0 1g 超纯水 1 0m l 溶解后，4 保存，保存时间为1 周。 1 5 安徽医科大学硕士毕业论文 ( 3 2 ) 2 0 t w e e n 2 0 t w e e n 2 0 蒸馏水至 混匀后4 保存。 ( 3 3 ) 电泳液缓冲液 t r i s 甘氨酸 s d s 蒸馏水至 溶解后室温保存。 ( 3 4 ) 转移缓冲液 2 0m l 1 0 0 m l 3 0 3g 1 8 7 7g 1g 1 0 0 0 m l 甘氨酸 2 9g t r i s5 8g s d s 0 3 7 9 甲醇2 0 0m l 蒸馏水至1 0 0 0 m l 溶解后室温保存，此溶液可重复使用3 - - 5 次。 ( 3 5 ) 1 0 x 丽春红染液 丽春红s 2g 三氯乙酸 3 0g 磺基水杨酸3 0g 蒸馏水至1 0 0 m l 使用时将其稀释1 0 倍。 ( 3 6 ) t b s 缓冲液( 1 0 0m m o l lt r i s h c ip h 7 5 ，1 5 0m m o l ln a c i ) t r i s6g n a c i 8 8 9 1 6 安徽医科大学硕士毕业论文 蒸馏水至 9 0 0 m l 溶解后，用浓盐酸调p h 至7 5 ，最后用超纯水定容至1 0 0 0 m l ( 3 7 ) t b s t 缓冲液( 含0 0 5 t w e e n 2 0 的t b s 缓冲液) t b s9 9 7 5r n l 2 0 t w e e n 2 02 5m l 混匀后即可使用，最好现用现配。 ( 3 8 ) 封闭液( 含5 脱脂奶粉的t b s t 缓冲液) 脱脂奶粉 5g t b s t1 0 0 m l 溶解后4 c 保存。 ( 3 9 ) 2 m g m l ( 1 0 m m o l l ) p m s f p m s f0 2g 异丙醇 1 0 0 m l 溶解后，分装于1 5 m l 离心管中，一2 0 保存。 ( 4 0 ) 2 x s d s 上样缓冲液 0 5m o l lt r i s h c l ( p h 6 8 ) 4m l s d s 0 8g 溴酚蓝 0 0 4g 甘油4 血 临用前加p 一巯基乙醇，使其终浓度为1 0 ( v ) ( 4 1 ) 细胞裂解液 lm o l lt r i s h c l ( p h 8 o )2 5m l n a c l 0 6 0 6g n p - 4 0 o 5m l 蒸馏水至1 0 0m l 混匀后，4 保存。使用时，加入p m s f 至终浓度为1 0 0p g m l ( 1 m l 裂解液加入 1 7 安徽医科大学硕士毕业论文 2m g m l p m s f 5 09 1 ) 。 ( 4 2 ) 1 2 分离胶和5 浓缩胶 1 2 分离胶5l l l l 超纯水 1 6 m l 3 0 a e r b i e 2 0m l 1 5m o l lt r i s h c i ( p h 8 8 ) 0 5m o l lt r i s h c i ( p h 6 8 ) 1 0 s d s 1 0 a p ( 过硫酸胺) t e m e d 2 2 方法 1 3m l 5 0u l 5 0p l 2 5u l 2 2 1 构建重组表达载体p c d g f p - p a m l 4 2 2 1 1p c r 扩增 ( 1 ) p c r 扩增 5 浓缩胶2m l 1 4 m l 0 3 3m l 2 0p l 2 0 “l 2 0g l ( 1 ) p c r 引物 正向引物：5 c g gg a t c c c g c c a c c a t gc g gc c c c t gg a c 3 反向引物：5 - g g aa 订c c ga c ga c t c g ct c t 3 引物由上海生工生物工程公司合成。 ( 2 ) p c r 的反应体系与条件： 以p a c t 2 一p a m l 4 为模板，反应体系为5 0 “l ，包括： 灭菌去离子水 3 3 山 1 0 p c rb u f f e r5p 1 m g c l 2 ( 2 5 m m ) 3p l d n t p s ( 2 5 r a m ) 4 肛l 1 8 安徽医科大学硕士毕业论文 正向引物 l 山 反向引物 l 肛l p a c t 2 一p a m l 4 2 5p l t a q 酶0 5 “l 将以上混合物在p c r 反应管内混匀，反应程序为： 9 6 lm i n 三步循环p c r 9 5 1m i n 5 8 lm i n 7 2 lm i n 共3 0 个循环 7 2 延伸1 0m i n 。 ( 3 ) 配制1 琼脂糖凝胶 称取o 4g n 脂糖，加入4 0m l1 t a e 缓冲液，加热溶解，冷却至5 0 一6 0 c h n 溴化乙 锭溶液2 0 斗l 使之终浓度为1i - t g m l ，混匀，倒入胶模中。 ( 4 ) p c r 产物的检测 取5i dp c r 产物进行l 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 2 2 1 2p c r 产物的回收 回收步骤参照胶回收( 小量) 试剂盒的说明。 ( 1 ) 取1 5m le p 管，称重。 ( 2 ) 用琼脂糖胶电泳将目的d n a 片段与其他d n a 片段尽可能分开。用紫外手提式 分析仪确定目的条带的位置，用刀片割下含d n a 的琼脂糖块，使它尽可能的小，放入 已称重的e p 管中，称胶块的重量。( 注意：紫外线照射时间尽可能的短，以防碱基突 变) ( 3 ) 加入r j 溶液( 按每1 0 0m g 琼脂糖加入3 0 0 山r j 溶液为一次标准反应) ，置5 0 - 6 0 c 水浴5 。1 0m i n ( 期间每2m i n 颠倒混匀一次) ，使琼脂糖块完全溶化。 1 9 安徽医科大学硕士毕业论文 ( 4 ) 将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，室温放置1 r a i n ，1 2 0 0 0r p m 离心l m i