（食品科学专业论文）苹果酒酵母营养与有机酸代谢的研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文摘要 摘要 苹果浓缩汁发酵常出现发酵迟滞或停滞的现象，其主要原因是酵母的营养问题；而有机酸则 是苹果酒中的主要呈味物质，其种类和含量大大影响了苹果酒的风味。因此本文主要研究了营养 萦的添加对于苹果酒发酵的影响，苹果酒中有机酸变化规律及其检测方法的改善。在此基础上 还对苹果酒的多菌种发酵进行了初探，主要研究结论如下： 本文通过单因素试验表明，磷酸氢二_ 二铵( d a p ) 、硫胺素及生物索的添加都对酵母代谢有显 著影响，当添加量分别为4 0 0m g ，l 、0 3 0m g ，l 及0 2 0m g l 时，酒精度达到最犬值，酵母代i 射最 为旺盛。而无枫元素的添拓并未对酵母代谢有显著促进作用，对苹果滔发酵速度及最终残糖没有 显著影响。 本文建立了苹果酒中1 1 种有机酸( 柠檬酸、丙酮酸、丙二酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸、甲 酸、乙酸、己二酸、丙酸、丁酸) 测定的高教液相色谱法，井采用柱后缓冲以提赢检测灵敏度， 达到较好的效果。 本文研究了以苹果浓缩汁和鲜榨汁两种原料而进行的苹果酒发酵过程的有机酸变化规律。研 究表明，不论何种原料，丙酮酸均在糖消耗一半时达到最大值，之后被降解，转化为其它代谢产 物：苹果酸都有一定程度的降解：乳酸、琥珀酸和乙酸均为代谢产物，含量一直上升，但具体的 生成量有较大的不同。添加营养素结果表明：d a p 、硫胺素和烟酰胺对于大部分有机酸都有一定 的影响，相比之下，生物素和泛酸的添加对于有机酸则无显著影响。眦，也进一步验证了适当 添加氮源和硫胺素等营养素对于改进发酵的必要性。推荐在以浓缩苹果汁为原料生成苹果酒时， 适当添加d a p ( 2 0 0m g i ) 、硫胺素( 0 3r a g l ) 以平衡浓缩苹果汁的营养，从而获得比较优质的 苹果酒。 本文对于多菌种发酵的研究结果表明：单菌种发酵时，综合耱代谢能力、酒精生成率以及有 机酸代谢情况，1 0 0 的发酵性能最优。1 4 6 6 不适合单菌发酵。j 0 0 与1 6 0 8 复配适合生产干酒，当 两种菌种添加比例为3 ：1 时，会获得发酵速度最快、残糖最低的产品。 关键词；苹果酒。酵母营养，氮源，有机酸，多菌种发酵 中国农业大学硕士学位论文 摘要 a b s t ra c t t h e r ei so f t e ns l u g g i s ho rs t a g n a n to ff e r m e n t a t i o ni nc i d e rf e r m e n tw i t hc o n c e n t r a t ej u i c e ，m a i nr e a s o n f o rw h i c hi sy e a s tn u t r i t i o n o r g a n i ca c i d sa r em a i nf l a v o ri nc i d e r , t h ek i n d sa n dc o n t e n t sg r e a t l ya f f e c t f l a v o ro fc i d e r i nt h i ss t u d yw em o s td or e s e a r c ho nt h ea f f e c to fa d d i t i o no fn u t r i e n t st oc i d e r f e r m e n t a t i o n ，m e t a b o l i s mo fo r g a n i ca c i d s ，a n da s s a ym e t h o d so fo r g a n i ca d d si m p r o v e m e n ta sw e l t o nt h i sb a s i s ，w el a u n c h e dr e s e a r c ho nm u l t i - s t r a i nf e r m e n t a t i o n s i n g l ef a c t o ra n a l y s i si n d i c a t e st h a td i a m m o n i u mp h o s p h a t ef d m ) ，t h i a m i n ea n db i o t i na d i i t i o n s i g n i f i c a n t l ya f f e c ty e a s tm e t a b o l i s m ，w i t ht h ec o n t e n t so f4 0 0m e e t , 1 2 0 0m g 凡0 3 0m e c la n d0 2 0 m g lr e s p e c t i v e l y , c o n t e n to fe t h a n o lr e a c h e si t sp e a ka n dy e a s tm e t a b o l i s ma tc l i m a x o nt h ec o n t r a r y i n o r g a n i ce l e m e n t sp r e s e n tl i t t l ee f f e c tt oy e a s tm e t a b o l i s me n h a n c e m e n t a ne f f i c i e n tm e t h o df o ra n a l y z i n ge l e v e no r g a n i ca c i d si nf o o d ，n a m e l yc i t r i c ，p y m v i c ，m a l o n i c ，m a l i c ， l a c t i c , s u c c i n i e , f o r m i c ，a c e t i c , a d i p i c , p r o p i o n i ca n db u t y r i ca c i d su s i n gh p l cw a sd e v e l o p e d ，a s u i t a b l ep o s t - c o l u m nb u f f e rs o l u t i o nw a su s e di no r d e rt oi m p r o v et h ed e t e c t i o nl i m i t t h em e t a b o l i s mo fo r g a n i ca c i dd u r i n gc i d e rf e r m e n t a t i o nw i t hc o n c e n t r a t ea n df r e s hj u i c er e s p e c t i v e l y w e r es t u d i e d r e s u l td e m o n s t r a t e d t h a t i nc a 驿o f e i t h e r j u i c ea sr a w m a t e r i a l p y r u v i ca c i d w i l lr e a c h i t s c l i m a xw h e ns u g a ri sh a f tc o n s u m e da n db ed e g r a d e da n dc o n v e r t e dt oo t h e rm e t a b o l i t e sl a t e r m a l i c a c i di sp a r t l yd e g r a d e d ；l a c t i c ，s u c c i n i ca n da c e t i ca c i d sa r em a i nm e t a b o l i t e s ，c o n t e n t so f w h i c hg o e su p ， y e tp r o d u c t i o no fe a c hv a r i e sr e s p e c t i v e l y t h ea d d i t i o no fn u t r i e n t ss h o w e dt h a t ：d a p , t h i a m i n ea n d n i a c i n a m i d ea f f e c tm o s to r g a n i ca c i d s ，w h e r e a s ，b i o t i na n dp a n t o t h e n i ca c i dh a v el i t t l ea f f e c tt oo r g a n i c a c i d s ，w h i c hf u r t h e rv e r i f i e st h a ta p p r o p r i a t ea d d i t i o no fd a pa n dt h i a m i n ei sn e c e s s a r yt oi m p r o v e f e r m e n t a t i o n i ti sr e c o m m e n d e dt oa d dd a pw i t h2 1 ：1 0m 如t h i a m i n ew i t h0 3m g mt oc o n c e n t r a t e j n i c et og u a r a n t e eh i g hq u a l i t yc i d e r i nt h es t u d yo fm u l t i s t r a i n sf e r m e n t a t i o n ，j 0 0i st h em o s ts u i t a b l es t a a i nt oc i d e ri no v e r a l ls u g a r u t i l i z a t i o n ，e t h a n o lp r o d u c t i v i t y , w h i l e1 4 6 6s h o w e dw o r s t j 0 0a n d1 4 0 8t o g e t h o ra r es u i t a b l e t o p r o d u c ed r yc i d e r , a n da tt h ef a t i oo f3 ：1m i x t u r ec o u l de r d a r g ef e r m e n t a t i o nv e l o c i t ya n dy i e l dl o w e s t s u g a rr e s i d u ep r o d u c t s k e yw o r d s ：c i d e r , y e a s tn u t r i t i o n ，c o n t e n to fn i t r o g e n ，o r g a n i ca c i d s ，m u l t i s t r a i nf e r m e n t a t i o n h y 9 3 9 2 6 3 独创陛声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：； 圬h 时间：2 一，占年月2 m 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：络i j “ 时间：如“年占月b 日 导师签名 时间：谢年占月z o 日 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 前言 第一章绪论 苹果酒是以苹果为主要原料，经过破碎、压榨、发酵、陈酿、调配而成的一种果酒。在英国 苹果酒用“c i d e r ”表示，其定义是：在发酵前或发酵后添加或不添加糖和水，采j = i j 苹果汁或苹果 浓缩汁，经过完全或部分发酵而成的饮料。苹果酒与其它果酒一样，是一种不经过消化就可彼人 体直接吸收的食物，它包含苹果与生物发酵所产生的双重营养成分，含有对人体有益的醇类、有 机酸、无机盐、维生索( 尤其是b 族维生素) 和含氮物质( 8 种人体必需氨基酸与人体向液中的 含量和比例接近) 。 苹果酒酿造过程中酵母的代谢至关重要。酵母的繁殖和代谢需要各种营养物质，主要包括常 量营养索碳源、氮源、无机盐和微量营养素。由于在酵母发酵时，对各种营养物质的利用是同时 进行的，当发酵的工艺条件一定时，果汁中的各种营养物质之间就存在一个彼此相互平衡的问题， 存在最适合酵母生长发酵的平衡点，果汁成分只有在此平衡点附近，酵母发酵速度晟快、酒精产 率最高、酒的风味也最佳。尤其当果汁中的营养成分不足时，研究此问题是更为必要，网为果汁 营养不足，会直接导致发酵缓慢甚至停滞，同时还会导致酒异味物质生成，影响酒的风味，这两 个问题是酿酒产生异常发酵的典型问题。目前在苹果酒发酵过程中一般碳源已经够用，酵母对 于营养素的需求缺乏主要集中在氨源和维生素上，这也是现在研究的热点之一。 有机酸是一种非常重要的成分，广泛存在于苹果、苹果汁等原料以及苹果酒这类发酵产晶中。 其含量影响果汁果酒的p h 值及风味，继而影响到酵母细胞的繁殖能力、细胞活性、营养物质的 吸收、产物的代谢与分泌；也对其微生物稳定性、营养成分、口感的可接受性及货架期有很大的 影响。大多数酵母代谢有机酸的生物途径早已为人所知，但对其的控制体系却是近些年才开始研 究的。有机酸的代谢受到发酵条件，诸如培养基的组成、通氧状况、酵母菌株、发酵温度、d h 及营养素等一系列因素的影响。我们可以通过控制发酵条件、调整相互作用的因素以及对酵母菌 株的选择和杂交达到控制风味组分的范围和数量。 有机酸的检测作为有机酸研究的一个难题，尽管研究很多，但由于苹果及其产品中特异存在 丙二酸，而其性质与苹果酸较为接近，大大干扰了对苹果酸的检测。而很多关于苹果酒有机酸检 测的文献中并未提及对丙二酸的检测。因此我们需要先懈决这个问题，进而准确的定量以苹果酸 为代表的多个有机酸，以便进行有机酸的相关研究， 苹果酒制作时，菌种的使用以及酒中的微生物对苹果酒的影响很大，不但会影响制酒的过程， 而且会影响酒的品质如风味、色泽等。因此国内外对于酵母的使用包括按种发酵及菌种复配进 行丁很多研究并且取得了一些积极的成果。 因此在苹果酒酿造过程中，对于酵母的营养、有机酸变化规律及营养素对其影响的研究就显 得尤为重要。 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 2 国内外研究现状 1 2 i 酒精发酵过程中酵母营养的研究 酵母是生物活性细胞，与其他生物一样也需要营养物质，如缺乏营养就有可能使发酵迟缓， 甚至产生异常高水平的副产物，如醋酸、丙酮酸、硫化氢和高级醇等。发酵迟缓的具体袭现是糖 的发酵速率显著降低，在发酵结束后留下高浓度的残糖( 高于体积分数0 2 ) 或发酵时间过分延 长，而氮源( 铵离子和游离氨基酸) 、维生素缺乏是发酵迟缓的常见原因【1 。 1 2 1 。1 酵母生长所需营养 酵母菌所需的营养物质包括碳源( 以葡萄糖和果糖为主) 、氨源、无机盐等常量营养素及微 量营养素。 1 2 i 1 1 碳源 苹果汁中含有较高的可发酵性糖( 大约1 3 1 5 ) ，主要以果糖( 7 4 ) 、葡萄糖( 1 1 ) 及蔗 糖( 1 5 ) 为主，可以满足酵母生长对碳源和能量的需求。 1 。2 1 1 2 氮源 氮渊是酵母完成酒糟发酵的一个至关重要的常量营养素，它能预防酒精发酵的意外停止【2 。 已证实有许多原因引起发酵延缓和停滞，但普遍认为氮源缺乏是引起发酵延缓和停滞的主要原 因。有研究表明添加一定量的氮源可以促进酵母的生长，加快发酵速度，提高酒精产最【5 】。 在氮源充足和有限的条件f 酵母的代谢特征有极大的差别。低氮的蕴群不易进入平稳期，并 且很难适应果汁的环境。相比之下，氮源充足的菌群在达到晟大发酵速度之前，就已表现出能耐 受酒精的相关代谢途径p 7 】。对果汁，酵母最初的含氧量对昂大细胞浓度与发酵速率影响的研究 表明，在所有情况下，细胞浓度是至关重要的。在最大细胞浓度( n l v c c ，2 扣4 8h 后) 和发酵速 率之间存在一个相关关系，小于一定的m v c c 阙值下，所有的发酵都可能停止，这个参数也许对 于预测缓慢发酵或停滞发酵是有效的嘲。 不管是用新鲜的苹果汁还是用苹果浓缩汁酿酒，都存在一个酵母营养的问题。苹果汁虽然比 一般的水果汁( 葡萄汁除9 1 - ) 含有较高的可发酵性糖，大约1 3 1 5 ，但是与大多数水果汁一样， 它含有较低的酵母可同化氮源( y e a s ta s s i m i l a b l en i t r o g e n o u sc o m p o u d s ，y a n c ) ，大约2 7 。5 7 4 m e , n ，平均1 3 0 m g i , i s ，而在正常的葡萄汁中，通常含有2 0 0 - 5 0 0 m g l 9 1 。一般来说，如果y a n c 含量小于1 5 0m 班，发酵就可能出现问题【。特别是苹果浓缩汁，由于加热和澄清的影响，苹果 浓缩汁中的维生素也有一定程度的损失。同时，加工和贮藏过程中的美拉德反应，不但降低了 y a n c 的含量并且还产生了酵母生长抑制物羟甲基糠醛，这样就更容易导致酒精发酵变缓或停 滞。 苹果汁中氮源以复杂的化学形式存在，包括氨基酸、n h 4 + 、胺、嘌呤、嘧啶、肽和蛋向质。 酵母可同化氮源的两个主要来源是基本氨基酸( p r i m a r y a m i n o a c i d ，p a a ) 和铵根离子( n h 4 + ) 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 它们是酵母生长并具有发酵活力不可缺少的营养物质，对多种酶的形成如己糖酶、氨基酸和铵离 子转移酶、糖分解酶以及a t p 酶等起着重要的作用【1 ”。 苹果汁中游离氨基酸大约占总氮量的5 0 ，其中天门冬氨酸、天冬酰胺酸、谷氨酸、谷氨酰 胺和丝氨酸这五种氨基酸占游离氨基酸的8 6 9 5 ，它们能很快的被酵母利用【1 “。在酒精发酵的 前两周，酵母利用氨基酸代谢产生的基质不利于细菌生长，发酵后期酵母逐渐分泌出细菌生长的 必须氨基酸，谷氨酰胺和丝氨酸，继续发酵，有更多的自由氨基酸发生性质上的变化，转变为利 于乳酸菌生长的a 丙氨酸和苯丙氨酸。 1 2 1 1 3 矿物质和微量元素 矿物质和微量元素包括m g 、c a 、m n 、k 、z n 、f e 、c u 等金属离子。微量营养素如金属离 子k 、m 9 2 + 、c a “等缺乏时，特别是当酸度较高( p h 液体试管培养 ( 1 2 1 ，1 5 m i i l 灭菌) 驴 1 2 5 倍，2 5 c ，2 4 h f ，1 5 0r p m 1 2 。b r i x 苹果汁e = = = 杀菌仁= = 三角瓶培养( 苹果汁驯化) ! ；5 ，2 5 c “8 h r 1 5 0r p m 接种 ( 2 0 a b r i x 苹果汁) 2 3 2 苹果酒发酵过程 将苹果浓缩汁稀释至2 0 。b r i x 。取稀释后的苹果汁，分装入经过1 2 1 c 杀菌的5 0 0m l 的三角 瓶中，每瓶装入4 0 0 m l 。称取偏重亚硫酸钾( k 2 s 2 0 5 ) ，用水溶解，配成3 0 9 l 溶液。用此溶液调 备罐中s 0 2 浓度达8 0m g l 。静置8h 之后，添加营养素，然后按5 接种量接入酵母菌种子液， 于1 8 卜- 发酵1 8 天。 中国农业大学硕士学位论文第二童苹果酒芨醇过程中酵母营养的研究 2 ，3 试验设计 2 3 ，3 1 营养素单因素试验设计 选用影响苹果酒发酵的营养素d a p 、硫酸铵、硫胺素、肌醇、烟酰胺、毗哆醇、生物素、泛 酸进行单困素试验，试验中各因素分别取五水平，以酒精度为检测指标分别检测酒精发酵结束后 酒样酒糟含量。 隶2 4 营养素单因素试验设计 曲b l e2 - 4 d e s i g n o f e x p e r i m e n t 硝t h e n u t d f , o n w 唧9 如盎如l ) 2 3 ，3 ，2 徽量元素单盈素试验设计 选用影响苹果酒发酵的微量元素铁、锌、钾、镁、钙进行单因素试验。试验中各因素分别取 五水平，以残糖为检测指标测定发酵0 ，2 ，4 ，6 ，1 8d 残糖，检测发酵过程中各处理总糖下降 速率。 表2 - 5 微量元素单因素试验设计 t a b l e2 - 5d e s i 伊o f e x p e r i m e n to f t h ei o n s ( m g ，l ) 硫醴铁 因素 铁 疑酸铁 硫酸铜硫酸镁 硫随镩氯化钙 镉硫酸锈镬猿酸镁锌巯髓辞 钙氯化钙 0 0 1 5 0 0 4 1 6 3 2白0 0d 0 o 0oo 水平i3 吣8 1 50 4 5 i ，1 3 3 0 0 01 5 0 0 0 o ，印1 。4 9 查! ! ：竺! ! ：! ! ! ：竺! ：堑! ! ：竺竺：竺 ! ：! ! ! ：! !：! ：! ! ! i ：垄 2 3 4 检测方法 2 3 4 1 酒精度的测定：酒精计法g b t1 5 0 3 8 - 9 4 2 3 ，4 ，2 总橱的测定：直接滴定法g b q 1 5 0 3 8 9 4 2 ，3 4 3 数据楚理软件：m l c r o s 。f e x c e l 2 4 结果与讨论 根据资料表明：d a p 、硫酸铵、硫胺素、肌酵、烟酰胺、毗哆醇、生物素、泛酸8 种营养素 均对酵母代谢能力有影响的因素，但鉴于苹果浓缩汁原料的特点，即果汁本身就含有较丰富的营 养素，但营养素的含量不均衡，因此按照试验结果将营养素又分为两大类：第一类营养素为苹果 中国农业大学硕士学位论文第二章苹果滔发酵过程中酵母营养的研究 汁中含量丰富的；第二二类营养素为苹果汁中含量少或欠缺的。以下分别进行对试验结果进行了讨 论。 2 4 1 第一类营养素试验结果 表2 - 6 四种营养素添加对酵母产酒精麓力的影响 t a b l e2 - 6e f f e c to f f o u rn u t r i e n t so na l c o h o lc o n t e n t ( ，v v ) 肌醇以1 一磷酸肌醇的形式出现时，可作为1 1 p p 激酶的辅酶，能促进酵母生长。缺乏肌醇会减 弱酵母细胞的葡萄糖代谢能力，而且酵母形成最大生长量所需的肌醇浓度高于其它生长素【”】，为 2 5m g ，l 。但由于苹果汁中含量已经超过酵母生长所需，因此添加肌醇对于酵母生长无显著影响， 这与赵宝华等人的研究：外加肌醇对酿酒酵母产酒精能力的影响不显著也一致口“。 烟酰胺是辅酶i 和辅酶的组成部分，成为许多脱氢酶的辅酶。缺乏时可影响细胞的正常呼 吸和代谢。但未见人研究在苹果洒生产时添加对于酵母的影响，试验表明苹果浓缩汁中添加烟酰 胺对于酵母无显著促进作用。 吡哆醇以磷酸吡眵酵的形式参与氨基酸的转氨作用，能促进酿酒酵母的生长，但大多数酿酒 酵母和# 氏酵母不需要毗哆醇 1 3 1 。本试验表明吡哆醇对于我实验室的酿酒酵母j 0 0 无显著促进作 j j 。 泛酸是辅酶a 的组成，参与糖和脂肪的酰基化反应，并影响酵母菌在厌氧和有氧条件下的代 谢作用。大多数的酵母菌的生长都需要有泛酸的存在，但其在合成培养基中含量为2 5m g ，l 时即 可满足酵母生长所需，而苹果浓缩汁中泛酸含量高达1 2 0 m g l ，因此添加泛酸对于酵母生长已 无显著促进作用。 结果如表2 - 6 ，可知添加肌醇( 0 - 5 0m 班) 、烟酰胺( 0 - 2 5r a g l ) 、吡哆醇( 0 1 。5m e l ) 、泛 酸( o - 5 0r a g l ) 后，并没有达到促进酵母生长的目的，经方差分析，结果均不显著。说明肌醇、 烟酰胺、吡哆醇及泛酸，当其含量为2 3 - 2 8m g l 1 5 1 、1 3 9m g l 、0 1 6 7m g l 和1 2 0m g l 时，已 满足酵母生长所需，实际生产时不需要添加。 1 7 中国农业大学硕士学位论文第二章苹果酒发酵过程中酵母营养的研究 2 4 2 第二类营养素试验结果 试验中选用添加的营养素对苹果酒酒精发酵结束后酒精度的影响结果如图2 - l 至2 - 4 所示， 方差分析见附表2 - 1 。从图中可以看出，与对照样相比，d a p 、硫酸铵、硫胺素及生物素的添加 能够在不同程度上提高酵母的产酒精能力。 1 l _ 。 。1 0 8 喜m e 蓥t 叫 蜒1 0 2 02 0 0 4 0 06 加8 0 01 0 0 01 2 0 0 d a p 添加量( m 矿一) 1 1 0 r 1 0 8 tl o 6 篓1 0 4 楚 1 0 2 1 0 0 03 0 0 6 0 09 0 01 2 0 0 1 5 0 01 8 0 0 硫酸铵添加量( m g l ) 图2 - 1d a p 添加对酵母产酒精能力的影响 圈2 - 2 磙酸铵添加对酵母产酒精能力的影响 f i g u r e2 - 1e f f e c to f d a po nt h ec o n t e n to f a l c o h o l f i g u r e2 - 2e f f e c to f a m m o n i u ms u l f a t eo i lt h ec o n t e n to f a l c o h o l o 茁 _ | 蜮 ：| 颦 艇 00 ，30 6 0 9 1 2 1 51 8 硫胺素添加量( m g l ) 图2 - 3 硫胺素添加对酵母产酒精能力的影响 f i g u r e 2 - 3 e f f e c to f t h i a m i n e o n t h ec o n t e n to f a l c o h o l 2 4 2 1 氯源 1 1 0 1 0 8 之 1 0 6 蓥1 0 4 窿 1 0 2 】o o 0 0 10 20 30 40 50 6 生物素添加量( r e # l ) 图2 4 生物素添加酵母产酒精能力的影响 f i g u r e 2 - 4 e f f e c to f b i o t i n o n t h e c o n t e n to f a l c o h o l 氮源是酵母生长和发酵中必需的营养物质，缺乏时将影响酵母的生长和酒精发酵的顺利进 行。在浓缩苹果汁稀释液中( 2 06 b r i x ) ，在酵母可同化氮源( y a n c ) 为1 5 8 2m g l 的基础上添 加d a p4 0 0m g ，l 时，酒精度比不添加氮源的对照相比上升4 0 2 ；添加量为6 0 0m g l 时并无更 多的促进作用：之后随着添加量的上升，酒精度反而降低。经方差分析表明，d a p 对酵母产酒精 的能力有显著促进，当发酵液中总y a n c 达到5 5 8 2i n g ，l 时，其酒精产量达到最大。 同样作为氮源，硫酸铵的添加对酒糟度的影响类似d a p 。随着硫酸铵添加量的增加，酒精度 1 8 2 0 8 6 4 2 o l 1 0 0 o 0 0 中国农业大学硕士学位论文第二章苹果酒发酵过程中酵母营养的研究 的产量呈现先增加后减少的规律，当添加量达到6 0 0m g l 酒精度已较对照组有较大幅度升高； 在硫酸铵添加量为1 2 0 0m g l 时，酒精产量达到最大值，较对照组升高5 0 。经方差分析表明， 硫酸铵对酵母产酒精的能力有显著促进作用。 理论上，几种铵盐都可以满足酵母的氮源需求但法国酿酒法典和德国葡萄酒法规只允许使 用d a p 作为酵母营养物，它提供的铵离子可以作为氮源，磷酸离子可参与葡萄糖和果糖转化为 酒精的反应。硫酸铵和氯化铵也可以补充氮源，但效果没有d a p 好i l 】。另外过量的含氮化合物会 影响酒的风味和微生物的稳定性，而且可能还会形成氨基，甲酸乙酯的前体物质，因此，各国对氮 源添加黛都有限定。美国规定在葡萄酒中添加磷酸氢铵( 一铵和二铵) 量不超过9 6 0 m g l ( ”】，澳 大利亚的限量为1 8 8 5m g l ”】，而欧共体的规定更为严格，规定添加d a p 或硫酸铵的用量不超过 3 0 0m g 刖”j 。本文选择添加d a p4 0 0m g l ，既促进酵母的代谢，义在一定程度上降低酒精发酵 结束后结合s 0 2 的量【l u l ，而且没有超过澳大利亚和美国对铵盐的限量要求，满足安全性要求，不 造成营养残留。 综上所述，在苹果酒发酵中，d a p 是理想的氮源，它用量少且效果显著，也符合当前国际上 关于酒生产的相关规定。 2 , 4 2 2 硫胺素 硫胺素以t p p ( 焦磷酸硫胺素) 的形式参与丙酮酸脱羧反应和己糖单磷酸途径的分子重排反 应。缺乏时，引起发酵呆滞瞄j 。我们所使用的发酵液中虽然硫胺素的含量达0 5 1 7m g 儿，但由丁 在发酵前添加的s 0 2 对硫胺素破坏较大，可达4 6 瞄】，故造成发酵液中硫胺素的缺乏。试验表 明，当硫胺素的添加量为0 3 0m g l 时，酒精产量达到最大值1 0 9 ，较对照组增幅达7 0 ：当 硫胺素添加量继续增加时，对酵母的代谢能力无较大影响，酒精度在1 0 9 上下波动。经方差分 析表明硫胺素对酵母产滔精的能力有较显著促进作用。 2 4 2 3 生物素 生物素是酵母最普遍需要的生长素，几乎所有的酵母菌都需要生物素。生物素是酵母羧化酶 和转援基酶的活性部分。当酵母生长在缺乏生物素的培养基中时，这些羧他酶的活性降低f 。试 验结果表明，当生物素的添加鬣为0 2 0m g 几时，酒精产量达到最大值1 0 7 ，较对照组增幅达 4 8 ：当硫胺素添加量继续增加时，酵母糖代谢能力反而下降，酒精产量下降。经方著分析表明， 生物素对酵母产酒精的能力有较显著促进作用。 结合对苹果浓缩汁稀释液中营养素的检测及相关试验，添加d a p 、硫胺素、生物素，使其在 发酵液中含量达到5 5 8 1 9m g l 、0 8m g 几、3 8 5m g l ，以满足酵母生长所需。同时硫胺素的添加 在不同程度上还可以降低酒精发酵结束后结合s 0 2 的残留量，提高苹果酒的安全性p ”。 1 9 中国农业大学硕士学位论文 第二章苹果酒发酵过程中酵母营养的研究 2 4 3 微量元素单因素试验结果分析 表2 7 五种金属离子的添加对酵母糖代谢能力的影响 t a b l e2 - 7 e f f e c to f f i v e i o n so n m e t a b o l i s m o f s u g a ro f j 0 0 ( g l ) 水平1 表2 - 8 五种金属离子的添加对酵母活菌觳的影响 t a b l e 2 - 8 e f f e c t o f f i v