（食品科学专业论文）酶解发酵盾叶薯蓣皂苷元的提取及纯化研究.pdf

捅墨 酶解发酵盾叶薯蓣皂苷元的 提取及纯化研究 食品科学专业硕士研究生任雁 指导教师张惟广副教授 摘要 盾叶薯蓣( 英文名c h i n e s ey a m 。拉丁名：d j o $ c o r z i n g i b e r e n s i sc h 矸确咖) 是我国特 有种，又名火头( 藤) 根，苦良姜。薯蓣皂苷元( d i o s g e n i n ) 为白色晶体或粉末，有刺激性气 味，难溶于水，易溶于苯、氯仿等有机溶剂，化学式及分子量：c 2 7 h 4 2 0 讲1 4 6 1 ，化学名 称：c 2 5 2 ) z - 异螺旋甾烯- 雏一醇，属异螺旋甾烯烷的衍生物。是薯蓣科薯蓣属植物根茎中薯蓣皂 苷( 击o s d n ) 的水解产物。皂苷元具有多种生理功能，生物界称其为“生命的钥匙”，医药界 称其为。药物黄金，激素之母” 本试验以四川遵生药用植化有限公司出售的盾叶薯蓣为原料，对盾叶薯蓣的组成成分， 常用盾叶薯蓣保藏方法进行了研究，对薯蓣皂苷元理化性质进行了定性判断，比较了传统皂 瞢元提取方法与酶解法，确定了盾叶薯蓣中皂苷元酶解法的最佳工艺条件。另外，考虑到超 声波对薯蓣结构的影响，对比了超声波辅助提取法与超声一酶解法。最后，采用大孔树脂对皂 苷元粗品进行精制，发现树脂a d s 一7 对皂苷元的吸附及解析较好，在一定程度上能有效的起 到精制效果主要研究结果如下： 1 测定盾叶薯蓣中各种成份，发现其中淀粉( 2 6 9 9 ) 和粗纤维( 5 7 7 ) 含量最大，皂 苷含量约5 2 4 。因此选择淀粉酶，纤维素酶，复合酶进行酶解发酵，更具有理论依据。研 究鲜盾叶薯蓣的保存方法。得出冷藏是一种可取的方法 2 通过两种方法对皂苷元标准品及样品的扫描，可知硫酸一甲醇法较优，在4 1 4 r i m 处出现 单一峰。通过稳定性试验( r s d - - 4 4 9 ) ，精密度试验( t s d - - 6 3 4 ) 及回收率试验( r s d - - - - 9 3 3 e ) ，可知相对标准偏差较小，结果重现性好，精密度较高，所得数据精确。直接酸水解 法最佳工艺：酸浓度为3 m o l l 。酸解时间为4 h ，发酵时间为2 4 h ，加水量为6 0 m l ( 即料液比 1 ：3 ) 。影响因素大小：酸的浓度 酸解时间 发酵时间 加水的量，所得皂苷元量为0 4 1 0 8 9 3 选择影响耐温淀粉酶四个主要因素，确定三个水平，得出最佳工艺参数：a 2 b s c 3 d 2 ，即 p h 为6 ，酶用量为0 1 m l ，酶作用温度为5 0 c ，酶作用时间为3 6 h 影响因素大小：酶作用 温度 p h 酶用量 酶作用时间，所得皂苷元量为0 4 9 3 5 9 ，比直接酸解法提高了2 0 1 3 。 4 选择影响耐高温淀粉酶的四个主要因素。得出最佳工艺参数：a ：3 3 c 4 ) 2 ，即p h 为6 ，酶 用量为0 i m l ，温度为5 0 c ，酶作用时间为2 4 h ，影响因素大小为：酶解温度 酶解时间 西南大学硕士学位论文 日量| 量皇量置旨量囊量暑目e 曩墨置昌l p h 酶用量，可得0 4 9 9 9 9 皂苷元，比直接酸解法提高了2 1 6 9 。通过加酶与不加酶提取 过程中几个参数的对比，可以看出，加酶后所得皂苷元量远大于不加酶组，且黄色废液中所 得糖含量高，为绿色无污染糖，经酸解后两次得糖相差不大分析酸用量与皂苷元，渣重， 糖的关系，可知酶作用提取皂苷元。可以减少酸的用量( 皂苷元得率达到直接发酵法提取得 率时，可节约酸3 3 3 3 ) ，降低污染。 5 将原材料经超声波处理后，索氏提取，未能明显得到皂苷元超声后不加酶法与超声后加 酶法所得皂苷元量基本相当，分别为0 4 9 7 7 9 2 0 9 粉末和0 4 9 9 4g t 2 0 9 粉末。比直接发酵法分 别提高了2 1 1 5 和2 1 5 6 可见，超声能够一定程度上取代酶作用，但其发酵后糖量略有 减少，绿色糖减少考虑到超声波对人体的负作用，以及超声波法成本要远大于生物酶法， 认为酶解发酵法较优 6 从熔点及纯度来看酶法所得皂苷元样品质量均要高于直接发酵法所得皂苷元酶法所得 皂苷元样品熔点大致在2 0 2 - 2 1 0 1 2 ，纯度均在8 8 以上，而直接水解法所得皂苷元样品熔点 一般在1 9 8 - 2 0 5 ，纯度均低2 个百分点。 7 树脂a d s - 7 对皂苷元的吸附作用很好，吸附率高达9 4 3 5 用无水乙醇作为解析剂，可 将其全部析出，说明它是一种很好的树脂乙醇的解析作用很强，9 5 乙醇基本上能将所吸 附的皂苷元全部解析下来。最终得出：8 9 预处理过的树脂a d s - 7 ，加入2 0 0 m i 浓度为0 0 9 4 m g m l 样品溶液，用数显恒流泵控制样液以l 0 m 1 m i n 的速度流入装有树脂a d s - 7 的层析柱， 待吸附完成后。收集吸附后的流出液，取l m l 进行检测皂苷元含量。算出吸附量。将层析柱 内树脂凉干( 避免层析柱破裂) ，然后加入2 5 0 m l 解析剂，解析率可达到8 7 7 6 收集解析 液，检测皂营元含量，算出皂苷元纯度为9 4 1 2 ，比纯化前提高4 5 。 关键词：酶解发酵法盾叶薯蓣皂苷元提取纯化 a b s t r a c t s t u d y o ne x t r a c t i n ga n d p u r i f y i n g d i o s g e n i nf r o m d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i s c h w r i g h tt h r o u g he n z y m a t i c z y m o t e c h n i c s c a n d i d a t e ：r e ny a h a d v i s e r ：a p r o lz h a n gw e i g u a n g d 胁c o r e a 历聊挽棚妇c h w r i g h t ( c h i n e s ey a mi sas p e c i a lk i n do f 讪斌，w h i c ha l s on a m e d h u o t o ng o n go rk u l i a n g j i a n g t h ed i u s g e n i ni sw h i t ec l y s t a lw i t hs t i m u l a t i n gs m e l li t sh a r d 幻 d i s s o l v ei nw a t e r , b u te a s y 幻d i s s o l v ei ns o i n co l g a n i co 胡删l i k eb e n z e n e 、c h l o r o f o r ma n d o n t b es t r u c t u r a lf o r m u l ao fd i o s g e n i ni s c - i - 1 4 2 0 s ，a n dt h em o l e c u l a rw e i g h ti s4 1 4 6 1 t h e d i o s g e n i n 讧t h eh y d m i y 鞠t co fd i o s c o r e a 踟g 加咖，函c h i 斩 g h t , w h i c hh a st r e m e n d o u s m e d i c a lv a l u ea n dm a r k e t a b l ep o t e n t i a l t h ed l u s g e n i nh a sm a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sw h i c h p l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nh u m a nh e a l t h , t h ew o r l do fb i o l o g yc a l l si ta s “t h ek e yo fl i f e , t h ef i e l d o f m e d i c a t i o n c a l l s i t a s “t h e g o l d i n m e d i c a t i o n , t h e m o t h e r o f h o r m o n e t h i sp a p e rs t u d i e dt h ec o m p o n e n to fd i o s c o r e az i n g i b e r e n s 缸c h w r g h ta n dt h ed i f f e r e n t m e t h o d s o f c o n s e r v a t i o n w e j e d g e d t h e d i o s g e n i n s p r o p e r t i e s o f p h y s i c a l c h e m i s l r y , c o m p a x e d t h e e x t r a c t a t i o nm e t h o d s ，i n c l o d m gt h et r a d i t i o nm e t h o da n de n z y m a t i cz y m o t e c h n i m f i n a l l y , c o n t i n u e dt h eb e s tt e c l m c ec o n d i t i o n s u l t r a s o n i cm a yi n f l u e n c et h es t r n c t t l o fd o $ c o r e a z n g b e r e n s sc h w r g h t ，s ow ec o n t r a s t e du l t r a s o n i c a le x t r a c t a t i o na n du l t r a s o n i cw i t he l l z y l l t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fd i o s g e n i nw e f eo b t a i n e d t h er e s u l t s i n d i c t e d ： 1 s t a r c h ( 2 6 9 9 ) a n dc o a r s 4 9f i b e r ( 5 7 7 ) c o n t e n tw e g et h em o s ta m o n ga l lt h ec o m p o n e n t so f d k l s 0 0 c e u 历卿蛔m 豳a j 【蚴w h i c ha l s oh a d5 2 4 d i o s c i n s ow ec h o s ea m y l a s e ，c e l l u l o s e e n z y m ea n dc o m p o u n de n z y m et ou s ei nt h ee x p e r i m e n t r e f r i g e r a t i o nw a sag o o dw a yt 0p i c m t h e 触h 觑口_ m 嘲西卿蚰m 凼c 胤矸缟加a n d h a d n oa d v e r s e e f f e c t o n t h e e x t r a c t i o n o f d i u s g e n i n m 西南大学硕十学伊论文 j i 皇墨曼量曼置舞| 鼍曼皇詈鲁鼍! 皇舅矗置量皂曼皇曼詈置置一 2 ，i nt h ed i o s g e n i nd e t e r m i n a t i o ne x p e r i m e n t ，w eu s e dt w om e t h o d s o n ew a sc o l o r l m e t r yo f v a n i i ! i n - a c e t i ca c i d a n o t h e rw a sc o l o r i m e t r yo fv i t r i o l m e t h a n 0 1 t h el a t t e ro n ew a sb e t t e rw i t h s i n g l ea p e xa p p e a r sa t4 1 4 n m , w h i c hh a ds m a l lr e l a t i v e l ys t a n d a r dd e v i a t i o n w ec a nf i n dt h eb e s t t e c h n i c sf r o mo r t h o g o n a le x p e r i m e n tb ya c i dh y d r o l y z i n gd i r e c t l y ：a c i dc o n c e n t r a t i o ni s3m u l t , t h et i m eo fa c i dh y d r o l y z i n gw a s4h o u r sa n dt h ef e r m e n t a t i o nt i m ew i t h6 0 m iw a t e rw a s2 4h o u r s a c i dc o n c e n t r a t i o nl e a d st h ef i r s tf a c t o ri nt h em e t h o da n dt h ew a 瞬a m o u n tw a st h el a s to n c 3 m o n o f a c t o r i a le x p e r i m e n th e l p e ds e l e c to u t4f a d 【o $ a n d3l e v e l sw h i c hi n f l u e n c e dt h a n n o d u r i c a m y l a s ea n dg a v et h eb e s tp r o c e s s i n gp a r a m e t e r sa sa z i h c ，d 2w h i c hc ma c c e p t0 4 9 3 5 9d o s g e n i n , 2 0 1 3 h i g h e rt h a nt r a d i t i o n a lm e t h o d ，n a m e l yt h ep a r a m e t e r sj u s tl i k et h ep hw a s6 ，t h ed o s 鸩eo f e m z y m ew a s0 1 m lt h et e m p e r a t u r ew a s5 0 c 。a n dt h et i m eo ff e r m e n t i n gw a g3 6h o u r i ；o ft h e4 f a c t o r s ，t e m p e r a t u r ea f f e c t e dm o s tw h i i ca c t i o nt i m eo fa m y l a s ew a gt h el e a s li no t h e rw o r d s ，p h a f f e c t e dg r e a t e rt h a na m y l a s ed o s a g ew h i l es m a l l e rt h a nt e m p e r a t u r e 4 s l e c t a df o u rr a c e r sw h i c he f f e c t e dm o r eo nt h e r m o s t a b l ea m y l a s e , w eg o tt h eb e s tt d 髦h l t i c s p a r a m e t e r sa sa 3 8 3 c ：l d 2 ，w h i c hc 姐a c c e p t0 4 9 9 9 9d i u s g e n i n , 2 1 6 9 h i g h e rt h a nt r a d i t i o n a l m e t h o d , t h ep a r a m e t e r sj l i s tl i k et h ep hw a s6 ，t h ed o s a g eo fe m z y m ew a s0 1 m 【t h et e m p e r a t u r e w a s5 0 a n dt h et i m eo ff e r m e n t i n gw a s2 4h o u r s o ft h e s ef o u rf a c t o r s , w ef o u n dt h a tt h e t e m p r e t u r ee f f e c t e dm o s t0 1 1a m y l a s e ，a n dt h ed o s a g eo fe l n z y m ew a st h el e a s t c o m p a r i n gt h et w o e x p e r i m e n t sw i t ha m y l a s eo rn o t , w ef o u n dt h eo u t p u to fd i o s g e n i na d d i n ga m y l a s ew a s m o l et h a n w i t h o u ta m y l a s e , a l s ow ec mg e tm o r eg r e e ns u g a rb ya d d i n ga m y l a s ea t h o u g ht h et o t a ls u g a rw a s a l m o s ts a m e a n a l y s i n gt h er e l a f i o m h i pa m o n gt h eo u t p u to fd i o s g e n i n ，t h ew e i g h to fr e s i d u ea n d s u g a r , w ec a m et o ac o n c l u s i o nt h a tu s i n gm t ka c i dc a nd e c r e a s ep o l l u t eb ya d d i n ga m y l a s ew h i c h s a v i n g3 3 3 3 a c i d 5 c o n s i d e r i n g t h ei n f l u e n c eo fu i l r a s o m co nt h es t r u c t u r eo fd i o $ c o r 嘲l z i n 如e r e n s i s c h w r i g h t , w eh a v ec o m p a r e dt h ed i u s g e n i ne x t r a c t i o np r o c e s s i n g w ec a n n o tg e td i n s g e n i no n l y u s i n g u l t r a s o n i ce x t s a c t i o nw i t h o u tf e r m e n t a t i o n w eu s e du l t r a s o n i ct oa s s i s t a m y l a s e e x u a f f i o n ，t h eo u i p u to fd i o s g e n i nw n o th i g h e ro b v i o u s l yt h a na m y l a s ee x t r a c t i o n 。i tw o u l d d e c r e a s ei ft h eu l t r a s o n i cp o w e rw a st o oh i g ho rt o ol o w 1 fu s i n gu l t r a s o n i ci n s t e a do fa d d i n g a m y l a s ew i t hf e r m e n t a t i o n ，w ec a ng e t0 4 9 7 7 9d i o s g e n i nw h i c hw a g2 1 1 5 h i g h e rt h a nt a d i t i o n a l m e t h o dw h i l eg e t0 4 9 9 4 9d i n s g e n i nw h i c hw a s2 1 5 6 h i g h e rb yu s i n gu l t r a s o n i cw i t ha m y l a s e f e r m e n t a t i o n t h a tw a st os a y , u l t r a s o n i cc a ni n s t e a do fa m y l a s ei naw a y , b u tt h ew e i g h to fs u g a r w eg o th a sd e c r e a s e db u tt h et o t a ls u g a rw a si n v a r i a b i l i t y f i n a y , c o u s i d e r i n gt h es i d ee f f e c tt o p e o p l ea n dt h eh i g h e rc o s to f u l t r a s o n i c , w et o u g h tt h ea m y l a s em e t h o dw a sb e t t e r 6 t h ed i o s g e n i ns a m p l eg o tf r o me n z y m o l y s i se x t r a c t i o nw a sb e t t e rt h a nt h a tg o tf r o md 蛔 f e r m e n t a t i o ni nt e r m so fs a m p l em e l t i n gp o i n ta n dp u r i t y t h em e l t i n gp o i n to ft h es a m p l ef r o m i v a b s t r c i e n z y m o l y s i se x t r a c t i o nw a s2 0 2 - 2 1 0 a n dp u r i t yw a so v c r8 8 w h i l et h el a t t e rf r o m1 9 8 t o 2 0 5 cw h i l ep u r i t yw a s8 6 7 r e s i na d s - 7c a na d s o t ha n dd e s o r bd o s g a n i nw e l lw i t h9 4 3 5 a b s o r p t i o nc a p a b i l i t yi nas h o r t a d s o r p t i o na n das h o r td e s o r p t i o n e t h a n o lh a das t r o n ga b i l i t yb o t hi na d s o r p t i o na n dd e s o r p t i n n , 9 5 o fe t h a n o lc o u l da l m o s td e s o r ba l lt h ea b s o r p t i o n a d d8 9a d s - 7i n t o2 0 0 m ld i o s g e n i n s o l u t i o nw i t hac o n c e n t r a t i o no f0 0 9 4 m g m l , t h e np u m pi n t oa d s - w i t hac o n s t a n tf l o wo f 1 0 m l m i nw h i l ec o l j e a 2 e f f u s i o n a f t e rc o m p l e t e da d s o r p t i o n , t a k i n g1m le f f u s i o nt od e t e r m i n e t h e a 咖i 姗l o f d i o s g e n i n , d r y i n g t h e 咄a d d i n 9 2 5 0 m l d e s o r p t i o ns o l v e n t i n t o i t ，d e s o r p f i o nr a t i o 锄c o m et o8 7 7 6 。c o n s i d e r i n gt h ec o s , t o 獬2 5 0 m ld e s o i p t i o ns o l v e n tt od e t e r m i n et h e c o n t e n t o f d i n s g e n i n , w e g o t d i o s g a n i n p i i f i t y w a s 9 4 1 2 w h i c h i n c r e a s e d b y 4 - 5 t h a n b e f o r e k e yw o r d s ：e n z y m a t i cz y m o t e c h n i c s ；d i o s c o r e az i n g i b e r e n s i sc h w r i g h t ， d i o s g e n i n ；e x t r a c t i n g ；p u r i f y i n g v 独创性声明 学位论文题目：壁鲤发醛厦吐蔓煎皇董丞盟握亟区纯焦珏盔 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者： 穆擎 签字日期： 如7 年6 月乡日 j 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：晰保密， 口保密期限至年月止) - 学位论文作者签名：伽隳 导师签卵专! 净r 一 签字日期：词年1 f 月弓日签字日期必q 年6 月弓 日 学位论文作者毕业后去向： i 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章文献综述 1 1 薯蓣概述 第1 章文献综述 1 1 1 薯蓣简介 薯蓣是薯蓣讯d f d g n b b 艇) 薯蓣属( d i o s c o r e a ) 植物的总称薯蓣属是薯蓣科中最大的1 个属，全球薯蓣科植物1 0 属约6 5 0 种，其中薯蓣属就有6 0 0 种，主要分布在东南亚、非洲及 中美、南美等热带和亚热带地区，少数几种分布于欧洲和北美洲薯蓣科植物中，我国只有 薯蓣属有分布，约有5 5 种、1 1 变种、1 亚种，主要分布于长江以南我国薯蓣植物中含薯蓣 皂苷元的种类有1 7 种、1 亚种、2 变种，可供工业生产应用的有1 0 种事实上，薯蓣属植 物在我国民间利用历史悠久，但全面而系统的研究始于1 9 5 7 年。自z 9 5 7 年起，特别是1 9 6 4 - 1 9 7 4 年的全国范围内薯蓣资源普查工作。发现该种分布于东经9 8 。5 3 - 1 1 2 。5 0 ，北纬2 3 。4 2 - 3 4 1 0 的范围内，含量变幅为1 0 1 1 6 1 5 嘲。盾叶薯蓣( 英文名c h i n 口ey a m “，拉丁名：d i o s c o r e s z i n g i b e r e n s i sc x w r i g h t ) 是我国特有种，又名火头( 藤) 根，苦良姜，属薯蓣科薯蓣属根状茎 组，是双子叶植物纲( d i c o t y l e d o n e a e ) ，合瓣花植物亚纲( a r c h i c h l a m y d e a e ) ，是一种多年生的 草质藤本中药材”其根茎中含有一定量的薯蓣皂苷( d i o s c ；) 及其水解物薯蓣皂苷元 ( d i o s g e n i n ) 。 1 1 2 薯蓣皂苷元含量的影响因素 影响盾叶薯蓣皂苷元含量的有关因子：不同地区的盾叶薯蓣皂苷元的含量不同；不同单 株问皂苷元含量不同；根茎年龄、根茎含水量均与盾叶薯蓣皂苷元含量成正相关；另外还进 行了土壤因素与含量的研究，最后综合而得结论：影响皂苷元含量的因素多而复杂0 1 早在1 9 7 5 年j ogm a r s h a l la n de j o h ns t a b a 就报道激素对薯蓣皂苷元的生物合成与生长有影响。通过研 究乙烯对薯蓣皂苷元产量及两种抗氧化剂酶( 过氧化氢酶，过氧化物酶) 活性的影响，我们 知道：尽管乙烯浓度( 诱导产生以上两种酶活性) 与薯蓣皂苷元产量之间有一定关系，但是 乙烯对薯蓣皂苷元产量的影响不是必需的 1 1 3 薯蓣的功能 中国是世界上最早利用薯蓣植物作为中草药治病的国家之一中国第一部医药专著神 农本草经 中就有薯蓣。补赢虚，除寒热邪气，补中益气力。长肌肉，久服耳目聪明”的记 载金匮要略、本草纲目、农政全书、植物名实图考等古代文献中都有关 于薯蓣植物的药用价值及人工栽培方法的记载 盾叶薯蓣苦，凉。具有解毒消肿功能，主治关节痛，阑尾炎，胃气痛、跌打损伤、蜂螯 虫咬。同时具有治疗皮肤急性化脓性感染、软组织损伤、调血脂等功效，也有降低胆固醇、 1 西南大学硕十学位论文 抗炎、抗肿瘤等药理作用“1 。中国科学院武汉植物研究所所长摩留西教授还发现用盾叶薯蓣 茎叶处理河道池塘，可杀死河道池塘中的钉螺，是治血吸虫的理想药物。 此外，盾叶薯蓣还含有4 5 - 5 0 的淀粉，可用于酿造工业生产酒精、酵母粉、葡萄糖等； 含有4 0 - 4 5 的纤维素，可生产羧甲基纤维素；提取皂苷元的废液可提取核酸，在医药、食 品、高级化妆品等行业中用途广泛。 目前，郧西县利源新型墙材有限公司成功研制出用盾叶薯蓣废渣作为一种填料生产免烧 轻型砖的新产品“盾叶薯蓣砖”，具有重量轻，强度高、耐抗压、耐腐蚀、耐高温、不脱落、 无毒害等优点 1 1 4 盾叶薯蓣面临的挑战 皂苷元价格一路狂跌，从2 0 0 2 年春季起，由年初的5 3 万元吨下跌到2 0 0 4 年元月初的2 9 万 元吨左右，以后大约每周下跌1 万元，到3 月底跌至2 0 万元吨；盾叶薯蓣价格也随之不断下 跌，从2 0 0 2 年秋冬企业收购鲜姜价格2 5 元吨跌到2 0 0 4 年2 - 3 月5 0 0 - 6 0 0 元吨左右，并且存在 严重的卖姜难问题。盾叶薯蓣面临巨大的困难，分析原因如下： 一是市场问题。盾叶薯蓣产量远远超过市场需求，使盾叶薯蓣产品跌人愈贱愈抛、愈抛 愈贱的恶性态势“”。其次。从国际市场看，一方面，墨西哥正着手解决薯蓣类植物的大面积 人工种植问题。以增强其供给能力。另一方面，德国先令公司已掌握合成双烯的技术，这势 必大大减少其对皂苷元、双烯等激素类药中间体原料的需求量，从而影响国际盾叶薯蓣市场 的供求关系。我国激素类药对国际市场依赖性较重，产品外销占4 0 以上，主要出口欧、美、 日等发达国家。随着这些国家对激素药物消费观念的改变，性激素类药物需求大大下降，导 致出口减少 二是产业链问题。盾叶薯蓣产业的一个显著特点是具有很长的产业链产业链每延伸一 节，附加值即可大幅度增加。产业链条太短，加工企业多。规模小，且均为上游中间体原料 产品，下游激素类药物品种几乎空白。产业化链条中，技工贸、技农贸、产学研还没有形成 有机结合体。因此，资源综合利用程度比较低。 三是环境污染，由于受利益的驱动，各地竞相上马、重复建设、粗放加工的现象比较严 重。每生产1 t 皂苷元，仅污水处理费一项，就在万元左右。 四是薯蓣皂苷元还将面临蓍麻皂苷元的冲击。特别是由于提取蓍麻皂苷元的新工艺已获 得成功，产品纯度大幅度提高，并有效地降低了生产成本，其工艺技术已具备了产业化生产 条件，目前有些企业正在积极开展蕃麻皂苷元产业化生产 五是盾叶薯蓣种植业本身存在的问题也是造成其价格下跌的一个重要因素片面追求高 产成为影响盾叶薯蓣质量的重要因素。 2 第1 章文献综述 1 2 皂苷及皂苷元 1 2 1 理化性质 盾叶薯蓣中的皂苷为胆固醇类苷中的薯蓣皂苷，薯蓣皂苷( 如图1 - 1 ) 的成苷糖类为1 个葡萄糖，2 个鼠李塘，成苷配基为薯蓣皂苷元薯蓣皂苷在酸性条件下，加压水解，分解为 薯蓣皂苷元和1 个葡萄糖及2 个鼠李糖“ ，削t 图1 - 1 薯蓣皂苷c c 4 5 1 1 7 2 0 m ) f i g l 1n * 啦唧i e o fd i o s c i n 薯蓣皂苷元( d i g e n i ) 为白色晶体或粉末，有刺激味，难溶于水，易溶于苯、氯仿等有机 溶剂。化学式及分子量：c 玉i i | 2 0 3 ，4 1 4 6 1 。化学名称： 8 2 ， 明显高于汽油提取的得率。王俊等嘲以野生穿龙薯蓣为原料，用超临界提取器提取样品葛 发欢等人以个别薯蓣料植物黄山药为原科，用超临界瞅取薯蓣皂苷元，结果与汽油提取 法比较，收率提高了l ，5 倍，生产周期大大缩短。而租产品中薯蓣皂营元含量在7 5 - 9 5 9 之 问。超临界c 0 2 萃取薯蓣皂苷元虽然还未实现工业化生产，但这种方法与有机溶剂法相比更经 济、更安全，在实现工业化生产方面具有很大的潜力国外已开始了这方面的研究，结果显 示其萃取的收率在8 2 以上 1 3 6 超声波提取薯蓣皂苷元 王昌利。”等根据超声波的热效应，机械粉碎和空化作用，对以穿山龙为原料提取薯蓣皂 苷的提取工艺进行了多因素的研究，证明超声提取方法具有省时，节能、提取率高等优点。 可以作为实验室和大生产的模拟工艺。超声提取工艺与回流提取工艺对比分析得知：前者比 后者可节约原药材2 7 1 3 7 逆流萃取法提取薯蓣皂苷元 刘锡葵等1 根据植物原料的特性，采用连续回流与萃取相结台的方法提取皂苷元结果 缩短了提取时间，提取率在9 8 以上，平均可提高率6 1 。黄亚辉“4 比较了连续逆流萃取法 和间断逆流萃取法。研究认为连续逆流萃取法回收率高，且操作时间较短 1 3 8 酶解法提取法提取薯蓣皂苷元 薯蓣皂苷元在植物体内主要以墓蓣皂苷的形式与纤维紊结合存在于细胞壁中，由于植物 细胞壁比较坚韧，因此经典的直接酸水解法提取薯蓣皂苷元很难将薯蓣皂苷元提取完全：为 了提高薯蓣皂苷元的产率。国内的科研人员对此进行了比较系统的研究：除了预发酵法以外， 加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、苦杏仁酶以及葡萄糖苷酶等酶液先进行酶解，使薯蓣皂苷 暴露出来。在酸水解时可以与催化剂更好地发生作用，而提高薯蓣皂苷元的提取率“1 7 西南大学硕士学位论文 酶预处理法与自然发酵法类似，即在酸水解前进行酶解淀粉、纤维素的处理工序。采用 酶法，专一性更强。李国富”1 等认为，薯蓣皂苷的c 3 位上结合的支链糖存在着位阻及薯蓣原 料中存在的大量淀粉对薯蓣皂苷的“包裹”与。屏蔽”作用，对皂苷水解产生干扰作用，敌 在酸水解前对原料进行了预处理一淀粉酶酶解淀粉，后酸水解，用此法皂苷元得率提高了3 5 以上，同时使分离的淀粉得到回收利用。向纪明等在发酵中进行自然发酵或加入1 的淀粉酶 或者苦杏仁酶可以提高薯蓣皂苷元收率1 0 - 2 0 。充分利用了纤维素和淀粉，达到综合利 用的目的，节约水资源，减少环境污染，同时可以减少劳动强度，提高劳动生产率。 纤维素酶是一类将纤维素水解成水溶性耱的复合酶类，它可使以1 ，4 8 葡萄糖苷键连接 而成的纤维索酶解而破坏。由于多数植物的细胞壁主要由纤维素组成，纤维素酶破坏f l - d 葡萄 塘苷键后。使植物细胞的致密细胞壁破坏，有利于胞内有效成分的提取“”张彩霞等将纤 维素酶应用于穿山龙提取薯蓣皂苷元，其工艺只比原工艺多了一步，但在纤维素酶的作用下， 提高了薯蓣皂苷的收率1 9 9 7 年陈四发”1 通过试验分析建议以鲜盾叶薯蓣为原料生产皂苷元 的生产厂家。在进行发酵时除加人合适的纤维素酶和淀耪酶外还要加人合适的脂肪酶以提高 皂苷元的收率和皂苷元的质量 1 4 盾叶薯蓣中皂苷元纯化研究概况 谌芳”1 在研究中发现，采用柱层析法可以达到理想的纯化效果。通常选用青岛海洋化工 厂生产的硅胶柱，以1 0 h 2 0 - c h 2 0 h 作溶剂重结晶，以c h c l 3 m e o h ( 体积比为6 5 ：3 0 ) 作冲洗 剂洗柱，以1 1 法带标样鉴别，合并相同组份，经熔点测定后即可得皂苷元的纯品，但是溶剂 消耗量大，成本较高。还有一种方法是将盾叶薯蓣的甲醇提取物悬浮于水，依次选用不同的 有机溶剂进行萃取，分另g 得到不同的极性部分，所采用的有机溶剂有己烷、乙醚、氯仿、乙 酸乙酯和正丁醇。根据相似相溶原理，极性较大的薯蓣皂苷元大部分集中在正丁酵部位，然 后对备部位再进行硅胶柱层析分离( 一般采用c h c k h 3 0 h - o h 系统) ，必要时结合凝胶 s e p h a d c xl h - 2 0 柱层析、大孔树脂柱层析或d c c c 法进行分离。高纯度样品在上述分离基础上 还需借助反相柱中低压l o b a r 柱，反相制备性h p l c 或1 r i c 等手段进行分离 张猛”1 分别选用了硅胶和氧化铝( 酸性) 作为薯蓣皂苷元分离纯化的层析介质，实验结 果表明，氧化铝( 酸性) 效果最佳。以氧化铝( 酸性) 为吸附剂，分别选用了三种洗脱剂。 结果表明，用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱对薯蓣皂苷元纯化效果最佳，其收率为1 1 9 ，纯度 为8 7 6 6 。经薄层层析和高效液相色谱确定均为薯蓣皂苷元。 张肇煜1 称取1 o o o g 经上述方法提取的薯蓣皂苷元，用氯仿溶解，并定容至1 0 0 m l ，吸取 姬氧化铝层析柱中，以0 1 m i j m i n 的速度用苯洗脱，每2 m l 收集一管，用硫酸比色法测定吸 光度，至没有物质流出后，换用乙醚作洗脱剂，以同样流速洗脱，每2 n l 瞰集一管，硫酸比色 法测吸光度，以吸光值对管数作图，绘制出洗脱曲线。根据以上洗脱曲线。收集乙醚洗脱液， 将乙醚蒸干，得白色物质，即为纯薯蓣皂苷元。从盾叶薯蓣中提取的皂苷元经氧化铝柱层析 8 第1 章文献综述 纯化后，经薄层层析和高效液相色谱分析，均为一个组份。 大孔树脂吸附特别适合水溶性化合物纯化分离。该法具有吸附容量大，选择性好，易于 解吸。机械强度高，再生处理简单，吸附速度快，操作简单，得率恒定，产品质量稳定，生 产成本低等特点，且吸附法仅用少量溶媒洗脱树脂就能达到浓缩目的，但耗用时间长。吸附 树脂清洗困难聂纯等o 采用树脂法进行纯化研究，将a d s - 7 吸附树脂使用前先用丙酮、甲 醇浸泡、加热回流，以除去未聚合单体与致孔剂等。树脂以水浸泡膨胀后倒入小玻璃柱内。 等树脂沉降，覆盖少许脱脂棉。轻压取盾叶薯蓣供试品溶液适量加入净化柱，用蒸馏水1 0 m l 洗去糖与无机盐等水溶性杂质。弃去水洗液，随即用与水相混溶的有机溶剂洗脱皂苷，比较 了7 0 ，9 5 乙醇与甲醇3 种溶剂，结果9 5 乙醇或者甲醇均可将皂苷洗尽。因甲醇用量少， 更加利于皂苷的洗脱。故选用了甲醇为皂苷洗脱液洗脱液分部收集，每份5 m l ，按样品含 量测定方法测定各流份皂苷含量结果共收集流份1 0 份第2 份开始有皂苷流出。从第2 - 6 份皂苷含量依次为1 2 1 9 、6 8 2 、2 2 1 、0 5 2 ，0 1 9m g ，从第7 份开始无皂苷检出 1 5 现行工艺存在的问题 目前国内皂苷元生产大多数厂家仍沿用传统直接酸水解工艺进行盾叶薯蓣水解物生产， 该工艺主要存在如下问题： 一是在自然发酵条件下，原料盾叶薯蓣直接水解不彻底，大量的纤维素和淀粉的存在对 水解有干扰作用，因而水解物中皂苷元含量低，一般在3 6 左右。国内生产较好企业也只能 达到5 6 左右 二是原料在水解过程中，多数厂家选择用硫酸进行水解易形成大量泡沫，致使部分薯 蓣随泡沫流失，水解后又直接用水反复洗涤，水消耗大，在水洗过程中半成品流失严重，废 水捧放量大，