（食品科学专业论文）中华麒麟桑桑叶蛋白的分离提取与酶促水解.pdf

摘要植物叶蛋白来源广泛，是世界上最丰富的蛋白资源之一。目前有关研究主要集中在畜牧方面，而其特有的青草味，难溶性使之在食品方面应用较少。本文以桑叶为原料，分离提取其中的叶蛋白，并利用其自身的特性，加以酶解，克服与改善叶蛋白在食品加工上的部分不利因素，并进行高f 值低聚肽制备。桑叶蛋白溶出率试验中，最佳条件为料液比1 ：2 0 ，打浆时间2 0r a i n ，p h 值为9 0 ，叶蛋白最大溶出率为6 5 7 。而叶蛋白提取方法中，酸沉法效果优于加热法，酸热法以及盐析法，其最适口h 值为3 , 0 ，提取率为2 6 7 3 ，经真空冷冻干燥成粉粗蛋白含量为3 4 1 5 ，加热与酸沉结合不能提高提取率。盐析法晟适( n 出) 2 s o 。饱和度为5 0 ，最大提取率3 0 4 3 。叶蛋白干燥宜选用冷冻干燥法，蛋白品质高，气味芳香，易于使用。试验对三种蛋白酶水解叶蛋白的工艺进行了优化：a l c a l a s e 最适水解条件为底物浓度2 ，酶浓度5 0 u m l ，p n 值7 0 ，温度5 5 ，叶蛋白的水解度为1 1 5 3 7 ；f l a v o 唧e 分别对应1 、2 5 u m l 、6 5 、4 0 。c ，叶蛋白的水解度为1 1 0 1 9 ：p a p a i n 为2 、1 0 0u m l 、6 0 、3 5 c ，叶蛋白的水解度为8 6 8 5 。蛋白酶能够彻底水解叶蛋白的部分组分，降低叶蛋白多肽的分子量。三种酶解产物都有浓郁的茶香味。无苦味。p a p a i n 水解物的蛋白回收率晟高，达9 0 7 7 ，但f l a v o u r z y m e 水解液色泽清亮。使用盐析蛋白进行高f 值低聚肽制备，a l c a l a s e 和p a p a i n 双酶水解液后溶液的水解度达到1 2 5 7 。活性炭脱芳优化试验可使得o d 2 2 0 保留1 2 6 3 ，o d 2 6 0 脱除将近1 0 0 ，经测试，f值高达1 7 4 5 2 8 ，平均肽链长度为3 1 6 。活性炭脱芳后的水解液为透明清亮的液体，无气味。关键词：桑叶，叶蛋白，提取，酶解，活性肽ua b s t r a c tl e a f p r o t e i nc o n c e n t r a t e s ( l p c s lh a v eb e e nr e c o g n i z e da s ap o t e n t i a ls o u r c eo f h i 【g hq u a l i t yp r o t e i n ，b e c a u s ei tc o n s t i t u t e st h ec h e a p e s ta n dm o s ta b u n d a n tp r o t e i ns o u r c ei nt h ew o r l d s e v e r a lp i l o tp l a n tp r o c e s s e $ h a v eb e e nd e v e l o p e df o rt h ee x t r a c t i o no fp r o t e i nc o n c e n t r a t e sw h i c ha r ec u r r e n t l yu s e di na n i m a lf e e d s h o w e v e r , i t su s ei nh a m a nf o o da sp r o t e i na d d i t i v ei sl i m i t e dd u et ot h e i rn e g a t i v es e n s o r yp r o p e r t i e s ，i n c l u d i n gg r e e nc o l o r g r a s s yf i a v o r ，p o o rs o l u b i l i t ya n da n t i n u t r i t i o n a lf a c t o r si ns o m es p e c i e s t h ep r e s e n te x p e r i m e n t sw e r eu n d e r t a k e nt oi m p r o v et h eu t i l i z a t i o no fp r o t e i no fm o r u sa l b aa n dd e v e l o p i n gn e ws o u r c eo fb i o a e t i v ep e p t i d e sf r o mp l a n tm a t e r i a l ，e s p e c i a l l yt op r o d u c es m i l eb i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e sf r o ml p c so fm o r u sa l b a ( m l p c s ) ，w h i c hc o u l db ea p p l i e di nf o o do rm e d i c i n ei n d u s t r y t h es t u d ys h o w e dt h a tu n d e rt h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n so fp h 9 o e x t r a c t i n gt i m e2 0 m i na n dt h ee x t r a c t i n gm e d i u mt ow a t e r1 ：2 0 ，t h ep r o t e i no f l e a v e sd i s s o l v e di nt h ee x t r a c t i n gf i l t r a t em a d eu pt o6 5 7 t h ed i f f e r e n te x t r a c t i n gm e t h o d so fl p cw e r ep r o b e da n dt h ea c i d i f i c a t i o nm e t h o dw a sp r o v e dt ob eb e t t e rt h a nh e a t i n gd i r e c t l y , h e a t i n gb ya c i d i f i c a t i o na n ds a l t i n go u t t h eo p t i m u mp hf o re x t r a c t i o nw a s3 0a n dt h ee x t r a c t i n gr a t i oo fl p cm a d eu pt 02 6 7 3 ，i nw h i c ht h ee r o d ep r o t e i nr a t i oo fl p cw a s3 4 1 5 a f t e rv a c u u n af r e e z e - d r y i n g a d d i n gn a c ia n dc o m b i n gt h eh e a t i n ga n da c i d i f i c a t i o nh a dn op o s i t i v ee f f e c tt ot h ee x t r a c t i n gr a t i o v a c u u mf r e e z e - d r y i n gw a st h eb e s tm e t h o dt od r yl p c ，w h i c hb r i n g sh i g h e rq u a l i t y , b a l m ys e n s o r ya n dc o n v e n i e n c et ot h ep r o d u c t e f f e c t so f t h r e ep r o t e i n a s e s ( a l c a l a s e ，f l a v o u r z y m ea n dp a p a i n ) o i lh y d r o l y s i so f l p cw e r es t u d i e d t h eb e s tc o m b i n a t i o no f h y d r o l y s i sp a r a m e t e r sf o ra l c a l a s ei sp h7 0 ，5 5 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n2 a n de n z y m ec o n c e n t r a t i o n5 0 u m l ，u n d e rw h i c ht h ed hi si1 5 3 7 t h ep a r a m e t e r so ff l a v o u r z y m ea n d p a p a i n h y d r o l y s i sa r e p h6 5 ，4 0 c ，1 、2 5 u m l ，1 1 0 1 9 a n d p h6 0 ，3 5 ，2 ，1 0 0 u m l ，8 6 8 5 ，r e s p e c t i v e l y s d s - p a g ei n d i c a t e dt h eh y d r o l y s a t e sm o l e c u l a rw e i g h td e c r e a s e dg r e a t l yc o m p a r i n gw i t hl p c t h r e eh y d r o l y s a t e sa l lb e a r e df u l lb o d i e ds e n s o r yo ft e aa n dh a v en ob i t t e m e s sb r i n g e db yh y d r o l y s i s o f w h i c hp a p a i n - h y d r o l y s a t et a k e st h eh i g h e s tr e c o v e r yr a t i oo f p r o t e i nu pt o9 0 7 7 a n dt h ef l a v o u r z y m eh y d r o l y s a t es h o w e db r i g h tb r o w n n e s s c o m p a r e dt od a r kb r o w n n e s so fo t h e r s t h es a l t o u t l p cw a sh y d r o l y z e db ya l c a l a s ea n dp a p a l no r d e r l yt op r o d u c eh f o p o w e r e da e t i v e dc a r b o nw a ss t u d i e da st h ea a aa d s o r b e n t u n d e rt h eo p t i m u mp a r a m e t e r s t h er e s e r v a t i o nr a t i oo fo d 2 2 0i s1 2 6 3 a n dt h ea d s o r p t i o nr a t i oo f o d 2 6 0n e a r e du p o n1 0 0 a n df i s c h e rr a t i ow a s1 7 4 5 2 8 t h ea v e r a g ec h a i nl e n g t ho f p e p t i d e si s3 1 6 t h ef i n a lp e p f i d e ss o l u t i o ni sl i m p i da n df l a v o r l e s s k e yw o r d s ：l e a f o f m o r u sa l b a ，l p c ，e x t r a c t i o n ，h y d r o l y s i s ，b i o a c f i v ep e p t i d e1 1 1图表清单表1 - 1 桑叶蛋白提取技术路线1 5表1 - 2 高f 值低聚肽的制备1 5表2 1 料液比配比1 6表2 - 2 ( n h 4 ) 2 s 0 4 饱和溶液配比1 7表2 3 干桑叶蛋白及水分含量1 8图2 1 料液比对桑叶蛋白溶出率的影响1 8图2 - 2 打浆时间对桑叶蛋白溶出率的影响1 9图2 - 3 加盐量对桑叶蛋白溶出率的影响1 9表2 _ 4 正交实验法确定桑叶蛋白的最佳溶出条件2 0图2 _ 4 温度对桑叶蛋白提取率的影响2 0图2 - 5p h 值对桑叶蛋白提取率的影响2 l表2 - 5 正交实验法确定桑叶蛋白的最佳提取条件2 1图2 - 6 硫酸铵饱和度对桑叶蛋白提取率的影响2 2表3 1 不同底物浓度下其他水解条件2 6表3 - 2 不同酶浓度下其他水解条件2 7表3 - 3 不同p h 值条件下其他水解条件2 7表3 _ 4 不同温度下其他水解条件2 7表3 - 5s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶配比2 8表3 - 6 蛋白酶活力2 8图3 1 底物浓度对叶蛋白水解度的影响2 9图3 2 酶浓度对叶蛋白水解度的影响2 9图3 - 3p h 对叶蛋白水解度的影响3 0图3 _ 4 温度对叶蛋白水解度的影响3 0表3 - 7 正交实验法确定a l c a l a s e 最佳水解条件f 3 1表3 8 正交实验法确定f l a v o u r z y m e 最佳水解条件3 1表3 - 9 正交实验法确定p a p a i n 最佳水解条件3 2图3 - 5 水解度与时间关系曲线一3 3袁3 - 1 0 水解产物评价3 3图3 - 6 电泳图谱3 3图4 - 1 水解度与时间关系曲线一3 8表4 - 1 不同活性炭吸附效果3 8表4 - 2 正交实验法确定活性炭最佳最佳吸附条件一3 9图4 - 2 活性炭吸附水解液紫外扫描结果3 9表4 - 3 水解液的氨基酸组成4 0v i i独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：蜀良段时间：驴莎年莎月二- 2 日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：旋段时间：如三年6 月3 爻日导师时间：0 多年易月孩日中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述l第一章文献综述绿色植物叶片是地球上最大的一种可再生资源，除含有维生素、纤维素、叶黄素、叶绿素、矿物质和脂肪等多种营养成分外，还含有丰富的蛋白质，是世界上最丰富的蛋白质资源( d a n i s en v , l a m b e r t c l b a z u s a f 等，2 0 0 3 ) 。从绿色植物叶片中提取出的叶蛋白来源广泛，成本低廉，其中的氮及氨基酸含量完全可与肉、蛋、鱼、坚果、大豆等高质蛋白食品媲美( d a n i s e n p l a m b e r tc l ，b a z u s a f , f e r t i n b ，d h u l s t e r p 等，2 0 0 3 ；吴小楠，汪家梨，林忠宁等，1 9 9 6 ：s z y m c z y k b ，g w i a z d as h a n c z a k o w s k ip ，1 9 9 6 ) ，比例协调合理，接近或超过f a o w h o 推荐的必需氨基酸需要模式( d i j k s t r a d s ，l i n n e m a n n a r 。b o e k e l t j s ，2 0 0 3 ) ，而且含有丰富的s e 、z n 、c u 、f e 、m n 等微量元素( 沈小燕，2 0 0 2 ) 。应用胰蛋白酶水解叶蛋白进行体外消化的结果远高于大豆1 l s 球蛋白( 周瑞宝，周兵，瞿水忠，1 9 9 9 ) 、其最适水解条件与动物体内环境条件相近( 邱业先，汪金莲，邹长媛等，1 9 9 8 ) 。证明植物叶蛋白易被动物体内的蛋白酶分解，是一种易消化、高品质的食品和饲料蛋白( a l v i s ed ，l a m b e r t n l ，f e r t i nc 等2 0 0 3 ) 。1 1 叶蛋白研究历史叶蛋白( l e a f p r o t e i nc o n c e n t r a t e s ，简称l p c s ) 是指将植物的茎叶破碎压榨后从汁液中分离出的蛋白质。叶蛋白的提取历史最早可追溯到1 7 7 3 年，当时r o u l l e 用酒精从绿色植物中提取了有色絮凝物质即叶蛋白，此后叶蛋白的研究一直未有多大的进展。1 9 2 4 1 9 2 5 年间匈牙利开始从牧草中提取叶蛋白，随后英国于1 9 3 6 1 9 3 9 年间也开始利用牧草提取叶蛋白。但大规模的饲料叶蛋白工业始于2 0 世纪6 0 年代，美国人a l b n y 建立了叶蛋白生产工业设备，为植物叶蛋白饲料供应规模生产奠定了基础；法国、新西兰、印度、俄罗斯等国家也都有一定规模的叶蛋白生产厂，他们主要是应用加热法沉淀叶蛋白，其中以法国成效最为显著。目前法国苜蓿公司是世界上商业性生产饲用叶蛋白规模最大企业，其所属的奥尔奈( a u l n a y - - a u x - - p l a n c h e s ) 合作厂从事叶蛋白的生产，1 9 7 2 年时生产能力已达1 2 0 吨每小时( 处理鲜草) ，每小时叶蛋白产量为2 吨，每年5 0 0 0 吨。1 9 8 8年，该厂的叶蛋白浓缩物产量为1 2 0 0 0 吨，产品的商品名为p x ( 蛋白质加叶黄素) 远销欧共体各个国家( 郭佩玉，2 0 0 3 ；李立人，1 9 9 5 ；杨丽娥，胡雪华，安渊，徐莹等，2 0 0 3 ) 。上世纪8 0 年代初，国际上专门成立了“绿色植物研究协会”( 简称s g v r ) ，负责协调及交流叶蛋白的研究与开发。1 9 8 2 年在印度召开了第1 届国际叶蛋白研究会议；1 9 8 4 年和1 9 8 9 年分别在日本和意大利召开了第2 和第3 届叶蛋白国际会议；1 9 9 3 年又在新西兰和澳大利弧两个国家联合召开了第4 届国际会议；1 9 9 6 年在俄罗斯罗斯托夫召开了第5 届国际叶蛋白会议。我国叶蛋白的研究工作起步较晚，主要集中在上世纪9 0 年代，主要用在饲料上作为代替鱼粉的新蛋白资源，近年来在食品中的应用研究发展迅速( 郑建仙。1 9 9 6 ) 。1 2 叶蛋白资源目前，国内外研究较多的是含粗蛋白质高而又广泛栽培的紫花苜蓿仰l 批卿j d 细) 。经过研究的豆科植物有红三叶( 丹扣，f “m p m 枷均、白三叶( 乃印s ) 、皿历山大三叶草( f “n d中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述r i n u m ) 、白花草木樨( m e l i l o t u sa l b a ) 、具角葫芦e ( r n g o n e l l ac o n r l a t a ) 、葫芦f 9 ( t f a c n u m g r a c e u m ) 、豇豆( v i g n as i n e n s i s ) 、有刺田菁( s e s b a n i aa c u l e a t a ) 、木田菁( s g r a n di f l o r a ) 、银合欢( l e u c a e n al e u c o c e ph a l a ) 和t a t r a k a l a i 等。禾本科植物也可用作生产叶蛋白的原料。已经研究过的有紫色狼尾草( p a n ni s e t u mp u r t m r u m ) 、御谷( p 苦l a u c u m ) 、杂种紫色狼尾草( p p u r p u r u m p g l a u c u m ) 、玉米( z e a m a y s ) 、甜高梁( s o r g h u mv u l g a r e ) 、甘蔗( s a c c h amo f f i c i n a r u m ) 、燕麦( a r e n as a 盯v a ) 、多花黑麦草( l o l i u mm u l 盯f l o r u m ) 等。另外，十字花科的萝h ( r a p h a n u ss a t i v u s ) 、芸苔( b r a s s i e an a p u s ) 、甘蓝( b o l e r a c e a ) 、藜科的甜菜( b e t a v a l g a r i s ) 、昆诺阿藜( c h e n o p o d i u mq u i n o a ) ；茄科的马铃薯( s o l a r i u mt u b e r o s u m ) 、烟草( n i c o a a n at a b a c u m1 ：桑科的桑( m o r u sa t b a ) 等植物的茎叶都曾被用以进行叶蛋白生产的研究。刘克武等分析了四川主产烤烟( 3 2 8 、9 1 5 、n c 8 2 、k 3 2 6 、黔所2 号、8 6 1 1 、红大1 2 号的叶蛋白含量及氨基酸( a a ) 组成，对每种烟叶的必需氨基酸f e a a ) 、半必需氨基酸( s e a a ) 、非必需氨基酸( n e a a ) 、氨基酸分数( a a s ) l = 匕较分析，结果7 个烤烟品种叶蛋白的a a s 均高于玉米和芝麻，是一类较优质的蛋白质资源( 支n 克武，赵欣平，文晓雯，刘鑫，喻东等，2 0 0 0 ；吴小楠，汪家梨，戚薇等，1 9 9 5 ) 。吴小楠等通过动物试验对黄豆和豌豆等9 种农作物的叶蛋白营养价值进行的评价表明，黄豆和豌豆的氨基酸评分( a a s ) 分别为9 8 和9 4 ，其营养指标评价与大豆蛋白相似，可作为叶蛋白提取的重要来源；而且绿叶蛋白对小鼠的体重和血红蛋白的改善作用与鲜牛乳相似( 吴小楠，汪家梨，戚薇等，1 9 9 6 ；吴小楠，汪家梨，林忠宁等，1 9 9 5 ) 。翁德宝、徐颖洁对3 种鸡冠花叶蛋白质营养价值进行了全面评价，结果表明。3 种鸡通花叶( 干品) 蛋白质含量为2 3 7 2 7 4 。蛋白质中氨基酸种类齐全，其含量为8 3 4 7 8 6 9 4 ，必需氨基酸0 认a ) 占总氨基酸量的4 0 2 4 1 7 ，第一限制性氨基酸为含硫氨基酸( m e t + c y s ) ；叶蛋白营养价值优于1 0 种叶菜，是一种值得开发利用的优质蔬菜( 翁德宝徐颖洁1 9 9 9 ) 。吴建华等对高冰草( r e l l wh e a tg r a s s ) 、草原牧草( p r a i r i eg r a s s ) 、狐茅草( d e m e t e rf e s c u e ) 、黑麦草( l o i i u “p e r e r m e ) 、白三叶( w h i t ec l o v e r ) 、紫花苜蓿饵u n t e r f i e l d ) 叶蛋白的提取及氨基酸分析表明，这六种南澳牧草氨基酸成分组成齐全、含量丰富，特别是必需氨基酸如赖氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸等含量都很高，是很理想的优质蛋白资源。尤其是紫花苜蓿叶蛋白中必需氨基酸含量丰富，比例协调合理，与f a o w h o 推荐的必需氨基酸需要模式极为接近，与进1 2 1 秘鲁鱼粉相似，优于豆饼，可开发利用作为人类食占矗添加剂和畜禽饲料添加剂( 吴建华，王敬华，沈冰等，1 9 9 9 ) 。1 3 叶蛋白的特性及组成1 3 1 叶蛋白的组成绿色植物茎叶中的蛋白质可以分为两类。一类为固态蛋白，它存在于经粉碎、压榨后分离出的绿色沉淀物中，主要包括不溶性的叶绿体及线粒体构造蛋白、核蛋白、细胞壁蛋白，一般难溶于水。另一类蛋白为可溶性蛋白，它存在于经离心分离出的上清液中，包括细胞质蛋白、线粒体蛋白的可溶性部分，以及叶绿体基质蛋白。叶蛋白就是可溶性蛋白的凝集物。在叶蛋白生产过程2中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述中，经粉碎( 捣烂) 、压榨过滤后。固态蛋白随同残渣被分离出去，其余的可溶性蛋白质分散在上清液中，对上清液加热或溶剂抽提、加酸、加碱，使可溶性蛋白质由溶解状态变为凝集状态，成为叶蛋白，主要由细胞质蛋白与叶绿体基质蛋白组成。叶蛋白的氨基酸组成几乎完全一样，天冬和谷氨酸残基与碱性的组氨酸、精氨酸和赖氨酸的比例趋于1 2 5 ：1 0 ，使叶蛋白具有微酸性。这种特性使叶蛋白在食品工业，特别是饮料开发等方面有特殊用途。另外叶蛋白在p h 值接近中性时仍具有较高的可分散特性。叶蛋白分子结构图显示极性氨基酸残基都分布在蛋白质的表面，而非极性氨基酸的侧链掩埋在分子内部，是叶蛋白可溶性高的理论依据之一( 周瑞宝，周兵，瞿水忠，1 9 9 9 ) 。可溶性蛋白质可以进一步分为大分子量和小分子量两种蛋白质。前者经分析确认是核酮糖一1 ，5 二磷酸羧化酶，分子量为5 2 - 5 6 万，仅存在于含有叶绿素的组织中。小分子量蛋白质是由脱氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶组成的蛋白复合体( 强莉2 0 0 2 ) 。1 3 2 白色叶蛋白( 1 | i h i t el e a fp r o t e i np r o d u c t ，w l p p )白色叶蛋白是来自植物细胞的叶绿体或细胞质的一类脱色素蛋白产物，将苜蓿压榨得到的绿色汁液加热至4 8 5 5 ，绿蛋白首先絮凝。将绿蛋白分离除去之后，褐色汁液再加热到8 0 ，或者用p h 4 0 的酸进行处理，就可得到白蛋白絮凝物，然后经沉淀、薄膜提纯、干燥、就得到白色粉末状的白蛋白( 郭佩玉，2 0 0 3 ) ，已知提取白色叶蛋白的植物涉及黎科( c h e n o p o c e i a c e a e ) 、十字花科( c m c i f e r a e ) 、豆科( l e g u m e m o s a e ) 和茄科( s o l a n a c e a e ) 植物( 罗曼，蒋立科，杨永年，1 9 9 9 ) 。如籽粒苋叶蛋白中自蛋白和叶绿体蛋白分剐占总蛋白质的3 0 1 l 和6 9 8 9 ( 邓勇，涂海根，沈群，1 9 9 8 ) 。白色叶蛋白的主要成分是r u b i s e o ( r i b u l o s el i s p h o s p h a t ee a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ，e c4 1 1 3 9 ) ，即核酮糖一1 ，5 - 二磷酸羧化酶加氧酶，也有人称之为“部分i 蛋白”以区别于其他各种可溶性蛋白( 总称为“部分i i 蛋白”) ( 李立人，1 9 9 5 ) ，依提取方法又可称为酸性蛋白。r u b i s c o 是世界上最丰富的蛋白质，在苜蓿叶中约占可溶性蛋白的5 0 6 5 的，它存在于叶绿体的基质中，是所有光合生物进行光合碳同化的关键性酶。酸沉淀法制名a - l p c 过程中调节p h 为4 8 ，此状态下r u b i s c o 以亚单位的形式存在( 刘晓颖，姚红谊，张嫒嫒，1 9 9 4 ) ，植物r u b i s e o 的分子量为5 5 0 k d ，由8 个大亚基和8 个小亚基组成f t , s s 8 ) ，外型呈桶状圆柱体，尽管各种植物绿叶的遗传基因不同，但叶蛋白都具有上述共性( 周瑞宝。周兵，瞿水忠，1 9 9 9 ) 。大亚基一般由4 7 5 个氨基酸残基组成，氨基酸序列在不同种之间的同源性大于8 0 ，特别在含有与催化和活化过程有关区域在不同有机体中几乎完全一致：大多数小亚基由1 2 3 个氨基酸残基组成，氨基酸序列在不同种之间的同源性仅2 0 左右，然而具有重要功能的残基1 0 - 2 1$ n 6 1 7 6 的两个区域是非常保守的( 李卫芳，王忠，顾蕴洁，2 0 0 2 ) 。r u b i s c o 的成膜能力、乳化能力和稳定乳状能力均高于禽蛋，市场定位在精炼蛋白质与利息蛋白质之间，在饮食和医药的应用上有巨大的潜在优势，此外还含有丰富的赖氨酸( l y s ) 和蛋氨酸( m 由，有较高的营养价值和特殊生理功能。目前已有7 3 个国家将白色叶蛋白产物作为食物添加品，特别是意大利、美国、法国、印度和保加利亚还把烟草白色叶蛋白的研究和开发列入食品生产发展规划之中( 罗曼，蒋立科，杨永年，1 9 9 9 ) 。1 4 叶蛋白的营养利用1 4 1 食品添加剂叶蛋白具有特殊的功能特性，如乳化性、发泡性、凝胶性以及吸水保油性( o a l e t o r ，a a o s h o d i ki p i n m o r o t i ，2 0 0 2 ) ，是一种具有潜在应用前景和可观经济效益的蛋白质添加剂。添加很少量就可达到大豆分离蛋白的功能效果( 周瑞宝，周兵，瞿水忠，1 9 9 9 ) ，而叶蛋白中蛋白质含量高，各类氨基酸含量接近动物蛋白。与鸡蛋蛋白质标准相当，是一种很好的食品蛋白添腩j 。叶蛋白的副产品还可制取高活性的膳食纤维添加剂( 古燕翔，王代军，2 0 0 2 ) 。英国利用超声波从草叶种分离叶蛋白添加到饼干、面包、面粉、饺子、油饼中销售：日本、前苏联用叶蛋白酿造酱油( 刘晓颖，姚红谊，张嫒嫒，1 9 9 4 ) 。郑建仙将苜蓿叶蛋白( a 1 脚f al e a fp r o t e i n ，a l p ) 应用到面条及面包中，可同时提高面条和面包的膳食纤维和品质，而且a 的氨基酸配比比较合理，生理价高，可作为良好的营养强化剂。但其工艺特性差，添加量不宣超过4 ，否则会对面团流变学特性、面包焙烤品质、面条强度和烹煮品质产生不良影响，但可通过面条中加入1 3 的活性面筋粉时，面包中加入复合品质改良剂来弥补( 郑建仙，1 9 9 6 ：郑建仙，温步渊，耿立萍，1 9 9 7 ) 。1 4 2 抗衰老动物体内脂质过氧化作用是自由基介导的连锁反应，形成的腊质过氧化物最终被降解成丙二醛( m d a ) 、烷烃等终末产物。m d a 的浓度直接反映了组织细胞脂质过氧化物作用的速度和强度。动物机体抵抗自由基损伤的防御系统包括酶系统：s o d 、g s h - - p x 、过氧化氢酶( c a t ) ：非酶系统：维生素a 、维生素c 、维生素e 、半胱氨酸和谷胱甘肽等，其中s o d 是机体抵抗自由基损害的主要防御性酶，g s h - - p x 具有清除过氧化物和保护细胞膜免受损伤的作用，同时对内皮细胞防御氧化低密度脂蛋白( u ) l ) 损伤起熏要作用。叶蛋白抵抗脂质过氧化的作用同其所含有的大量维生素a 、维生素c 、维生素e 、卢胡萝h 素及丰富的微量元素有密切关系。动物试验证明，植物叶蛋白可提高动物谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - - p x ) 及超氧化物歧化酶( s o t s 的活力) ，降低脂质过氧化产物丙二醛( m d a ) 的浓度，具有抗脂质过氧化的作用，并认为植物叶蛋白富含硒、铁、铜、锰、锌等多种微量元素，能提高机体抗脂质过氧化物作用酶系统的功能，同时促进动物的生长发育( 傅晓，2 0 0 3 ；沈小燕，2 0 0 2 ) ，调节血脂和提高血色素含量的作用，显著提高3 一碘甲腺原氨酸水平( 沈小燕，2 0 0 2 ) 。乌桕叶含有一种以多糖成分为主的中性杂多糖蛋白复合体，且具有较强的清除羟自由基活性。多糖蛋白复合体平均分子量为5 3 0 0 0 ，含有o 型糖肽键和a 糖苷键；多糖与蛋白质组成比为9 4 ：6 ：含有半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖，单糖摩尔组成比为2 5 ：2 4 ：1 8 ：3 1 ：2 ：蛋白质部分以甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等中性氨基酸为主( 高荫榆，霍光华，何小立，2 0 0 3 ) 。鲜烟叶经喷施亚硒酸钠，提取得到硒蛋白质，其溶液制剂可使老年小鼠淋巴细胞增殖反应、n n k 细胞活性、血清凝集素水平、吞噬率和吞噬指数显著提高；大鼠血清g s h p x 活性显著提高、血清m d a 含量显著降低，具有免疫调节和抗氧化的作用( 张劲松，商学云，邵玉芬等1 9 9 8 ) 。4中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述提前补充该蛋白，可降低c c l 4 对肝的损伤，并呈现除剂量效应关系在抗脂质过氧化方面，明显优于亚硒酸钠组和对照组( 陈春英，张劲松，黄开勋等，1 9 9 6 ) 。b o n d a d a a n d a l l u 笔；的试验证明桑叶可有效控制糖尿病模型大鼠的高血糖症和糖尿，清除0 - 2并提高机体抗氧化酶活性以抵抗脂质过氧化，认为可能是叶中的黄酮类物质和桑素发挥作用，但有待进一步验证( a n d a l l u b ，v a r a d a c h a r y u l u n c ，2 0 0 3 ) 。1 4 3 其他1 9 4 0 年，美国康奈尔大学教授ms c o t t 发现饲料中缺乏某种“未明生长因子”时，畜禽生长缓慢，而当其存在时，畜禽生长加快，但脂类物质结构复杂，不知具体为何化合物。1 9 9 3 年王芳发现苜蓿中含有较多的未明生长因子，可能会使白色沉淀物蛋白质含量降低，但尚未经饲养试验证实。郑恰等从1 7 种蕨类植物中检测出1 2 种蕨类植物叶组织中存在着能够凝集一种或多种类型红细胞的凝集素( 一类与糖专一结合的蛋白质或糖蛋白，其生物学和化学特征使之在细胞生物学、生物化学、免疫学等许多研究领域有着广泛的用途) ( 郑怡，卢海声，余萍，2 0 0 1 ) 。罗曼等通过动物试验对豆腐柴叶蛋白营养及安全性进行了研究，结果表明叶提取物不但安全，还具有促进生长、抗疲劳、增加耐力、降低胆固醇并阻止脂肪积累的功效( 罗曼，蒋立科，杨永年，1 9 9 9 ) 。1 9 9 6 1 9 9 7 年，中国农业大学曾两次从法国进口了苜蓿叶蛋白，经国家食品质量监督检验中心测定，该叶蛋白无毒无害，符合国家规定的标准，用作儿童、孕妇、老人和贫血病人的食品强化剂是安全可靠的( 刘向阳，李道娥，1 9 9 7 ) 。试验表明，用该叶蛋白强化膳食，可提高大学生血液中血红蛋白的水平。缓解由于蛋白质摄入不足而引起的贫血( 邓勇，沈群，李道娥，1 9 9 7 ) 。山东省莱阳心里康复医院进行的叶蛋白食用试验表明试验组的血色素增量处在显著水平。而对照组则为不显著水平( 刘向阳，李道娥，1 9 9 7 ) 。肖志剑、董尚勇用低热量甜味剂阿斯巴甜( a p m ) 代替蔗糖，用l i t e s s e 代替脂肪，用叶蛋白强化营养，并添加黑米丰富产品花色，研制出低糖低脂且蛋白质营养得到强化的新型保健冰淇淋，具有预防心血管等疾病的特殊生理功效( 肖志剑，董尚勇，2 0 0 1 ) 。1 5 叶蛋白的提取方法绿色植物茎叶均可作为生产l p c 的原料，但为了保证叶蛋白的产量与品质，选择的原料应具备叶片多、叶中蛋白质含量高、不含毒性成分以及含粘性成分少等条件。一般叶蛋白的提取应包含以下步骤：1 5 1 粉碎或打浆叶蛋白提取率的高低主要决定于细胞的破碎程度。因而在叶蛋白的提取中，采取有效的办法破坏细胞壁并施以一定的压力进行压榨取汁尤为重要。榨取汁前要进行打浆，打浆的方法和效果对叶蛋白的提取率有较大的影响。打浆的方法有碰撞、切割或应用不同的压力装置。虽然以碰撞中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述为主的锤片式粉碎能耗效率比切割式低，但它对细胞的破碎程度大，因而多数叶蛋白生产厂使用以碰撞为主的锤片式粉碎机。从已定型生产的打浆机来看，食品机械中的打浆机尚不能满足提取叶蛋白生产工艺的要求。饲料机械中的青饲料打浆机虽可用于叶蛋白生产，但因其对物料的剪切次数与打击搓揉程度不够，故细胞壁的破碎率不高，影响叶蛋白的提取率( 王昌志，王丽梅，罗翠兰，1 9 9 6 ；秦春兰，武华，汪春，1 9 9 8 ) 。因此，对叶蛋白专用打浆机的特殊技术要求是：1 ) 比一般打浆机打得更碎，其浆液的含浆率应大于7 5 ：2 ) 适应多种作物在不同生长期的打浆要求；3 )打浆后浆液温度不得高于4 56 c ；4 ) 生产率符合建厂规模与生产工艺的要求，并且生产率高，能耗低。王昌志等从提取叶蛋白专用打浆机的特殊要求出发，提出叶蛋白专用打浆机的工作原理，研制出9 d y - 5 0 型叶蛋白专用打浆机( 王昌志，王丽梅，罗翠兰，1 9 9 6 ) ，秦春兰等设计了提取叶蛋白的的9 3 r j - - 4 0 型打浆机( 秦春兰，涂海根，李英顺，1 9 9 8 ) 。对含水量低、老化程度较高的青绿物料打浆时，湿法打浆叶蛋白产出率高( 秦春兰，武华。汪春，1 9 9 8 ；秦春兰，1 9 9 7 ) ，但在榨汁、絮凝、离心等处理过程费工费时，能耗增加很快，且加水后提取的叶蛋白浓缩物干基的租蛋白质含量较不加水时低6 ( 施正香，孙建华，李道娥等1 9 9 7 ) ，相比下千打浆增大了物料比重、节省压榨处理电耗，降低了生产成本。因此，打浆时应依据具体情况确定打浆方式。新鲜叶片打浆时会破坏细胞的细胞壁，致使细胞中的蛋白质在自溶酶的作用下发生分解，结果导致叶蛋白的提取率降低( 刘鹏，黄虎，罗翠兰等，1 9 9 9 ) 。叶蛋白汁液中酶的组成复杂，除含有植物细胞中释放的酶外，还含有附着于植物体的微生物所分泌的酶，而其蛋白酶的适宜p h值多为中型至偏酸性。冯立志试验结果表明，用幼嫩苦卖菜生产叶蛋白饲料时，用调整汁液至p n 4和p i l l 0 5 的方法钝化酶，可抑制蛋白酶的水解作用，提高汁液的叶蛋白饲料产品率和叶蛋白饲料中的粗蛋白含量。p h l 0 ，5 比p h 4 0 效果更好，未经钝化酶处理的比调整至p h l o 5 的方法钝化酶的产品率低2 0 7 ( 冯立志，1 9 9 4 ) 。叶启腾等用亲和层析技术从丝兰叶子中获得了两个蛋白酶成分，等电点p h 值分别为9 7 7 和9 6 1 ( 叶启腾，陈强，李春香，1 9 9 5 ) 。但汪良驹等经过对银杏叶片可溶性蛋白质测定非直线性的原因分析，认为蛋白水解酶活性是次要的原因，真正原因可能是蛋白质本身的碱溶性( 叶启腾，陈强，李春香，2 0 0 2 ) 。1 5 2 榨取汁液通过压榨机从粉碎或打浆后的植物茎叶中挤压出绿色液汁( 生产中有时将粉碎与压榨在同一机械内完成) 。为了榨取充分，压榨前可加水5 1 0 进行稀释后再挤压。第一次榨取后，加入适量水搅拌，再进行第二次压榨。目前我国所用的小型加工机具大多采用生产蔗糖用的压力机，大量生产则采用褐藻酸脱水用的h x - 5 0 0 型螺旋压榨机等( 刘信宝，沈益新，2 0 0 2 ) 。虽然加水洗汁提取量较高，但手续繁多，不适于工厂化生产；直接压汁工艺简单，但提取蛋白产品量太少，经济效益低，不易于推广；浸泡再直接压汁、振荡后加水洗汁、浸泡后加水洗汁需要时间长，生产工艺多，而且提取蛋白产品量也低于振荡后直接压汁。不适于大规模生产，振荡后直接压汁，其工艺简单，提取蛋白产品量高，此法也适用于大规模生产( 周志宇，付华。张洪荣1 9 9 9 ) 。61 5 3 絮凝分离天然蛋白质一般在溶液中保持稳定的亲水胶体状态，有两个原因，一是水化作用，即蛋白质分子表面附有能有效防止蛋白质分子沉淀析出的一层水化膜；二是电荷排斥作用，即蛋白质分子周围除水化膜外还有电荷层，能有效地防止蛋白质分子的凝聚。加入任何影响这些因素的物质都会破坏其稳定性，使其聚积而沉淀。另外，还有一些因素使氢键、盐键结构破坏，致使蛋白质生物学性质和理化性质改变，这种蛋白质的变性可引起溶解度降低。叶蛋白提取即利用以上原理，或改变条件破坏水化膜，或改变表面电荷而使蛋白质变性而沉淀( 昝林森，杨明明，陈玉林，1 9 9 7 ) 。榨取出来的液汁中所含的叶蛋白可用多种措施将其分离出来。分离技术与叶蛋白的分离率和分离质量有很大的关系。国内外叶蛋白生产中一般采用如下絮凝技术使蛋白质絮凝成絮结物，然后进行离心过滤，分离出叶蛋白浓缩物( 刘信宝，沈益新，2 0 0 2 ) 。1 5 3 1 加热法蛋白质是一种由多种氨基酸构成多肽，再由多肽链按一定规律排列成具有三级结构的物质，易溶解或分散于水中，受热时而变性，三级结构破坏，使蛋白分子间互相缠绕而沉淀。根据这一原理，将富含蛋白的植物榨汁液在一定温度下使溶解、分散于水中的蛋白质变性而凝结，再经过滤、干燥而形成蛋白质产品。加热法是应用最早、晟普遍的一种絮凝技术。其做法是加热液汁，使其迅速升温至7 0 8 0 ，几分钟内便可絮凝成较大的团聚物。为使叶蛋白从液汁中尽量絮凝分离出来，可分次加热，第一次将汁液加热至6 0 7 0 c ，再迅速将其冷却至4 0 c ，滤出的絮凝物主要是绿色叶蛋白，但也有试验认为温度在4 5 c 以上时，上清液较混浊，会影响胞质蛋白的品质，提取温度5 5 可获得更多而纯的胞质蛋白；第二次将汁液加热至8 0 9 0 c ，并持续2 4 m i n ，絮凝分离出来的主要是白色的细胞质蛋白。植株的幼嫩程度在加热提取法提取叶蛋白中有重要作用，处理温度相同时，同种植物越幼嫩，叶蛋白絮凝沉淀越容易，叶蛋白提取率越高( 施正香，孙建华，李道娥等，1 9 9 6 ) 。加热法的优点一是能形成紧密而稳定的絮结物，易过滤收集；二是能迅速钝化酶，既可中止蛋白质水解从而提高蛋白质提取率，又能中止脱镁叶绿素的形成而避免动物食用后产生过敏反应。其缺点是能耗高，且引起蛋白质的热变性，致使叶蛋白的吸水性、溶解性及乳化性较差( 邓勇，沈群，卢山，涂海根，1 9 9 7 ) 。1 5 3 2 酸碱度法利用蛋白质在等电点条件下或强酸碱作用下的变性沉淀。其中酸法是用盐酸将汁液的p h 值调节至4 0 左右直至产生叶蛋白沉淀( 静置1 0m i n ，让叶蛋白充分絮凝) 。它操作方便，节省能耗，成本低，沉淀快。可减少生物碱含量。但此类絮凝物结构疏松，不易过滤分离，还加速不饱和脂肪酸的氧化，胡萝h 素的损失增多；碱法则是将p h 值调节至强碱条件( 大3 1 0 ) ，以产生较好的絮凝效果，其优点基本上与酸法相同，并可破坏多种不利因子，如某些酶类、植物雌激素和皂素等；但不如酸法使用方便和普遍( 邓勇，沈群，卢山，涂海根，1 9 9 7 ) 。碱一热法