（食品科学专业论文）鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶内源性抑制剂的研究.pdf

学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：翟、逼、昴 时间：a 蚪o 占、枷 j 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作者( 签名) ：琢、百、扁 曼师( 签名) 枷f 声 时f 日- - j ：沪协j l l 。 鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶内源性抑制剂的研究 摘要 鱼糜加工过程中发生的凝胶劣化现象是影响鱼糜品质的重要因素。与海水鱼相比，淡 水鱼鱼糜加工更容易产生凝胶劣化。目前研究表明，鱼肌肉中含有的肌原纤维结合型丝氨 酸蛋白酶( m b s p ) 降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因。因此，寻找一种 天然有效的m b s p 抑制剂来防止鱼糜的凝胶劣化，成为目前鱼糜加工技术的另一方向。近 年，从白姑鱼肌肉中分离出一种内源性的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶抑制剂 ( m y o f i b r i l - b o u n ds e r i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o r , m b s p i ) ，且与猪的g p i 具有高度的同源性。关 于淡水鱼m b s p i 的研究尚未见报道，本研究以鲫鱼为材料，研究其肌肉中m b s p 的天然 内源性抑制剂，并尝试初步解释二者之间的作用机理。 本试验通过缓冲液抽提、酸沉淀、离子交换色谱、亲和层析等方法从鲫鱼肌肉肌原纤 维中纯化得到m b s p ，并对其性质进行分析。纯化m b s p 的回收率为2 4 ，纯化倍数为 6 0 0 倍，m b s p 对胰蛋白酶类底物都有不同程度降解，其中对b o c g l n - a r g - a r g m c a 降解 最为显著，对组织蛋白酶底物z p h e - a r g m c a 、氨肽酶底物a r g m c a 以及胰凝乳蛋白酶 底物s u e l e u l e u - v a l t r y m c a 与s u c - a i a - 砧a - p r o p h e m c a 均不分解作用。抑制剂试验 结果显示，丝氨酸蛋白酶抑制剂对m b s p 有强烈抑制，e 6 4 对m b s p 有部分抑制。以上 结果说明m b s p 属于胰蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶。 本试验通过硫酸铵分级沉淀、q s e p h a r o s e 离子交换层析、s u p e r d e x2 0 0 凝胶过滤层析 得到纯化，回收率为8 0 ，纯化倍数为4 6 8 倍。通过凝胶过滤测定的分子量为1 2 0k d a ， 而在s d s p a g e 中，则检测到2 个不同的亚基( 5 5k d a ，6 5k d a ) ，推测其为异源二聚体结 构。通过l c m s m s 高效液相串联质谱进行的肽指纹图谱鉴定结果显示，得到的肽段与 斑马鱼g p i a 的同源性为9 1 7 ，与g p i b 的同源性为9 7 5 。以果糖6 磷酸( f 6 d ) 为底 物时，g p i 的k m = 0 3 6m r n o l l ，g p i 的最适p h 与温度分别为8 5 与5 0 ，且在p h 8 0 9 5 与4 0 以下较稳定。鲫鱼g p i 能特异抑制鲫鱼m b s p 活性，而对其它类型的丝氨酸蛋白 酶以及白姑鱼的m b s p 没有抑制作用。动力学实验表明g p i 对m b s p 属于可逆竞争型抑制， 其蜀为0 0 7 5t t m o l l 。g p i 对m b s p 降解肌原纤维蛋白酶的抑制试验显示，g p i 对肌原纤 维的降解有较明显的抑制作用，其中肌球蛋白重链( m h c ) 、肌动蛋白( a c t i n ) 、原肌球 蛋白( t r o p o m y o s i n ) 的降解都得到了有效抑制。本研究结果提示，多功能蛋白质g p i 作为 一种内源性的m b s p 抑制剂可能对鱼体肌肉的新陈代谢起着重要的调节作用。g p i 也可作 为添加剂应用于鱼糜制品生产，有效抑制由m b s p 引起的肌原纤维蛋白分解。 关键词鲫鱼，肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶抑制剂，纯化，性质研究 s t u d y o fae n d o g e n o u si n h i b i t o rt om y o f i b r i l - b o u n ds e r i n e p r o t e i n a s eo fc r u c i a nc a r p ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) a b s t r a c t t h e 刀劬如一p h e n o m e n o n ( t h e r m a lg e ld e g r a d a t i o no ff i s hj e l l yp r o d u c t s ) d u r i n gt h es u r i m i p r o d u c t i o ni sa ni m p o r t a n tf a c t o rf o rt h eq u a l i t yo fs u r i m i c o m p a r e dw i t hm a r i n ef i s h ，舭s h w a t e rf i s hs u r i m ig e lw a sp r o n et od e g r a d a t i o nm o r ee a s i l y t h ee v i d e n c eo ft h ed e g r a d a t i o no f m y o f i b r i l l a rp r o t e i nb ym y o f i b r i l b o u n ds e r i n ep r o t e i n a s e ( m b s p ) w a st h em a j o rr e a s o nf o r m o d o r p h e n o m e n o n t h e r e f o r e ，t h es e a r c hf o ran a t u r a li n h i b i t o rt om b s pb e c o m ea n o t h e r d i r e c t i o ni nt h es t u d i e so fs u r i m ip r o c e s s i n g r e c e n t l y , w eh a v ei d e n t i f i e dt h a tas p e c i f c e n d o g e n o u si n h i b i t o rt o w a r dm 哈s pi nt h es k e l e t a lm u s c l eo fm a r i n ef i s hw h i t ec r o a k e r ( a r g y r o s o m u sa r g e n t a t u s ) h a dah i g hd e g r e eo fh o m o l o g yw i t hp o r c i n eg l u c o s e 6 - p h o s p h a t e i s o m e r a s e ( g p i ) h o w e v e r , t h em b s p io n 舶s hf i s hh a sn o tb e e nr e p o r t e d ，i nt h ep r e s e n t , w e d e s c r i b e dad e t a i l e ds t u d yo nt h em b s p if r o mt h es k e l e t a lm u s c l eo fc r u c i a nc a r pw i t ha n a t t e m p tt oc l a r i f yt h ei n h i b i t i o nm e c h a n i s mb e t w e e ng p ia n dm b s p m b s pw a sp u r i f i e df r o mt h es k e l e t a lm u s c l eo fc r u c i a nc a r pb yb u f f e re x t r a c t i o n ，a c i d p r e c i p i t a t i o n ，q - s e p h a r o s ei o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , a n db e n _ z a m i d i n es e p h a r o s ea f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yw i t hay i e l do f2 4 a n dp u r i f i c a t i o no ff o l d so f6 0 0 s u b s t r a t es p e c i f i c i t y a n a l y s i ss h o w e dt h a tm b s pc a ns p e c i f i c a l l yd e g r a d e dt r y p s i nt y p es u b s t r a t e s ，a n dt h ei n h i b i t o r s u s c e p t i l i b i l i t ya n a l y s i sr e v e a l e dt h a tm b s pw a si n h i b i t e de f f e c t i v e l yb ys e r i n ep r o t e i n a s e i n h i b i t o r , t h ec y s t e i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o re 一6 4h a ds o m ed e g r e ei n h i b i t i o no nm b s p , i n d i c a t e d m b s pi sa t r y p s i nl i k es e r i n ep r o t e i n a s e g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t ei s o m e r a s ew a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yf r o mt h es k e l e t a lm u s c l eo f c r u c i a nc a r pb ya m m o n i u ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o n ，c o l u m nc h r o m a t o g r a p h i e so fq - s e p h a r o s e ， s p - s e p h a r o s ea n ds u p e r d e x2 0 0 诵t 1 1ay i e l do f8 0 a n dp u r i f i c a t i o nf o l d so f4 6 8 t h e m o l e c u l a rm a s so fg p iw a s12 0k d a 嬲e s t i m a t e db yg e lf i l t r a t i o nu s i n gs u p e r d e x2 0 0c o l u m n ， w h i l eo ns d s - p a g e ，t w os u b u n i t s ( 5 5k d aa n d6 5k d a ) w e r ei d e n t i f i e d ，s u g g e s t i n gi ti sq u i t e p o s s i b l yah e t e r o d i m e r t h eg p ia l s od i g e s t e db yt r y p s i na n da n a l y z e db yl c m s m s ，t h er e s u l t s h o w e dt h a ti th a da91 7 a n d9 7 5 h o m o l o g yw i t hz e b r af i s hg p i aa n dg p i b ，r e s p e c t i v e l y i n t e r e s t i n g l y , g p ir e v e a l e ds p e c i f i ci n h i b i t o r ya c t i v i t yt o w a r dm y o f i b r i l - b o u n ds e r i n ep r o t e i n a s e ( m b s p ) f r o mc r u c i a nc a r pw h i l en oi n h i b i t o r ya c t i v i t yw a si d e n t i f i e dt o w a r do t h e rs e r i n e p r o t e i n a s e ss u c h 嬲w h i t ec r o a k e rm b s pa n dc r u c i a nc a r pt r y p s i n k i n e t i ca n a l y s i s 。s h o w e dt h a t g p ii sac o m p e t i t i v ei n h i b i t o rt o w a r dm b s pa n dt h e 墨w a s0 0 7 5p m o l l o u rp r e s e n tr e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h em u l t i f u n c t i o n a lp r o t e i ng p ii sa ne n d o g e n o u si n h i b i t o rt om b s pa n dm a y p l a y as i g n i f i c a n t r o l ei nt h er e g u l a t i o no fm u s c u l a r p r o t e i nm e t a b o l i s mi nv i v o t h ep o s s i b l e a p p l i c a t i o no fg p la sa ni n h i b i t o rt om b s pi ns u r i m ip r e p a r a t i o nw a sa l s od i s c u s s e d k e y w o r d s ：c r u c i a nc a r p ，m y o f i b r i l - b o u n ds e r i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o r , p u r i f i c a t i o i l c h a r a c t e r i z a t i o n 目录 第一章引言l 1 1 肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶l 1 2 丝氨酸蛋白酶抑制剂2 l - 3 葡萄糖6 磷酸异构酶3 1 4 本文研究目的与内容6 1 4 1 研究目的与意义。6 1 4 2 研究内容、技术路线一6 第二章材料与方法8 2 1 实验动物8 2 2 试剂8 2 2 1 层析树脂8 2 2 2 荧光底物8 2 2 3 蛋白酶抑制剂- 。8 2 2 as d s - p a g e ，n a t i v e p a g e 等所用试剂8 2 2 5w e s t e r nb l o t 所用试剂8 2 2 6g p i 活性测定所用试剂。8 2 3 实验所用溶液及其配制9 2 3 1 鲫鱼肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶( m b s p ) 纯化所用溶液9 2 3 2 鲫鱼肌肉葡萄糖6 磷酸异构酶的分离纯化9 2 3 3s d s p a g e 所用溶液9 2 3 4 银染色所用溶液1 0 2 3 5w e s t e r nb l o t 所用溶液1 0 2 4 仪器10 2 5 实验方法：1 1 2 5 1 蛋白质浓度测定1 l 2 5 2s d s p a ( 遢及n a t i v e p a g e 1 1 2 5 3 免疫交叉反应1 3 2 5 4m b s p 活力测定1 4 2 5 5 肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶m b s p 的分离纯化15 2 5 6 鲫鱼肌肉m b s p 的性质分析15 2 5 7 鲫鱼葡萄糖一6 - 磷酸异构酶( g p i ) 的纯化方案1 6 2 5 8 鲫鱼g p i 的性质分析l8 2 5 9g p i 对m b s p 的抑制作用2 0 第三章结果与分析2 2 3 1 鲫鱼m b s p 的分离纯化与性质研究2 2 3 1 1 鲫鱼m b s p 的分离纯化结果2 2 3 1 2 鲫鱼m b s p 的底物特异性2 4 3 1 3 不同抑制剂对m b s p 的影响2 4 3 2 鲫鱼g p i 的分离纯化与性质研究2 6 3 2 1g p i 酶活测定方法的确定2 6 3 2 2g p i 纯化及分子量鉴定2 7 3 2 3 鲫鱼g p i 的性质研究3 3 3 3 鲫鱼g p i 对m b s p 的抑制作用3 4 3 3 1 ( 琅i 对各种丝氨酸蛋白酶的抑制作用3 4 3 3 2g p i 对鲫鱼m b s p 的抑制类型研究3 5 3 3 2g p i 对鲫鱼m b s p 降解鲫鱼肌原纤维的抑制作用3 9 第四章结论与展望4 1 4 1 结论4 l 4 2 展望4 l 致谢z i ：! 参考文献4 3 在学期间发表的学术论文4 8 v 主要缩略词对照表 v i 第一章引言 我国拥有丰富的淡水鱼资源，淡水鱼类约有7 0 0 多种，主要经济鱼类大约5 0 种，常 见的有青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲤鱼等，其中青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼为我国的 四大家鱼，产量占水产淡水养殖总产量的7 0 以上【l 】。在我国水产品总产量中，以前是以 海洋捕捞为主，从1 9 9 3 年起，养殖产量己占到总产量的5 2 ，也标志着我国渔业从天然 捕捞向人工养殖转变，现如今我国养殖鱼的产量已远远超过天然捕捞鱼产量。9 0 年代以来， 我国的水产业，特别是淡水渔业，进入高速发展的时期。据统计，到2 0 0 7 年我国渔业总 产量已达4 7 4 8 万吨，比2 0 0 6 年同期增长3 6 。其中海洋捕捞产量为1 2 4 4 万吨，同比下 降1 6 ，海水养殖产量为1 3 0 7 万吨，同比增长3 4 ；内陆捕捞产量为2 2 6 万吨，同比 增长2 4 ，内陆养殖产量则更高达1 9 7 1 万吨，同比增长6 1 嘣2 1 。 另一方面，养殖业的发展也加速了我国水产品加工业的发展。在水产品精深加工和加 工副产物综合利用的技术及研究方面，相比于发达国家，我国的水产品加工水平处于相当 落后的水平，主要表现在水产品加工的科技含量低，技术装备落后，对加工的理论水平研 究不够深入，导致大部分水产品加工只停留在粗加工水平，难于从根本上提高我国主要低 值鱼类的价值【4 5 】。 因此，重视水产品精深加工的技术创新，提高水产品综合利用水平和效益，仍然是今 后相当长一段时间内我国水产品加工业的主要发展方向【6 】。 本实验以我国常见的经济淡水鱼类鲫鱼为研究对象，研究其肌肉中的肌原纤维结 合型丝氨酸蛋白酶内源性抑制剂( m b s p i ) ，为淡水鱼鱼糜加工品的品质提升提供理论参考。 1 1 肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 鱼糜制品是淡水鱼加工利用的一个主要的方向。而凝胶劣化现象是影响鱼糜制品质量 的最主要因素【7 以0 1 。目前普遍认为鱼肉中内在蛋白酶分解肌球蛋白重链( m y o s i nh e a v yc h a i n ， m h c ) 是凝胶劣化的主要因素 1 l j ，而m h c 的分解主要是由肌肉中内源性蛋白酶引起的，如 组织蛋白酶 1 2 】或丝氨酸蛋白酣1 3 】。尽管先前已有研究表明在凝胶劣化作用中组织蛋白酶 ( 组织蛋白酶l ) 有参与，但是在实际生产鱼糜制品时需要用水或者用弱碱水反复清洗， 在最后的成品中水溶性的溶酶体蛋白酶( 组织蛋白酶) 的存在量已相当低。另外，组织蛋 白酶l 只在酸性条件下有活力，并且在温度5 5 6 0 下快速失活。由此推测组织蛋白酶l 对 鱼糜制品的凝胶弹性影响较小。1 9 9 7 年，o s a t o m i 等j k 1 4 】从淡水鲤鱼( o 矽锄螂c a r p i o ) 肌肉 中纯化得到一种肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶( m y o f i b r i l b o u n ds e d n ep r o t e i n a s e ，m b s p ) ，且 发现其在5 5 下对m h c 有明显的降解作用。1 9 9 9 年，c a o 等人【1 5 】对鲤鱼中所得到的这种新 型的丝氨酸蛋白酶进行了n 端测序，发现m b s p 是一种类胰蛋白酶类的蛋白酶。2 0 0 0 年， c a o 等【l6 j 在海水鱼狗母鱼肌肉中也分离得到了m b s p ；同年s a n g o n 曲等【1 7 】在老鼠骨骼肌中也 1 发现了一种与肌原纤维蛋白结合的丝氨酸蛋白酶；随后，本研究小组在白鲢鱼与鲫鱼的肌 肉中也发现了s p 【i s , 1 9 ，并克隆得到了鲫鱼m b s p 的全序列。越来越多的结果表明，m b s p 可能普遍存在于动物肌肉之中，且可能在肌肉蛋白的生理代谢中起着重要的调控作用。 1 2 丝氨酸蛋白酶抑制剂 酶的本质是蛋白质，凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为失活作用 ( i n a c t i v a t i o n ) 。在酶未变性条件下，由于酶必需基团化学性质的改变，而引起酶活力的降低 或者丧失的作用称为抑制作用( i n h i b i t i o n ) 。通常情况下，变性剂对酶的变性作用无选择性。 但是，一种抑制剂只能使一种酶或者一类酶产生抑制作用。因此，抑制剂对酶的抑制作用 是有选择性的，且相比于变性剂来说有更重要的生理生化功能【2 0 1 。 天然的蛋白酶抑制剂广泛存在于动物、植物以及微生物之中，是自然界含量最丰富的 蛋白质之一田2 5 i 。天然蛋白酶抑制剂在体内的主要功能是防止不必要的蛋白降解，与蛋白 酶一起调节着生物体内的蛋白质代谢平衡。根据抑制蛋白酶的种类不同，可以将这些天然 蛋白酶抑制剂分为四大类：抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂；抑制木 瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的巯基蛋白酶抑制剂；抑制胶原蛋白酶、氨肽酶的金属蛋白酶抑制 剂和抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶的羧基蛋白酶抑制剂【1 6 筇】。 与其它动物一样，在鱼体中同样存在着丰富的天然蛋白酶抑制剂。在鱼糜制品生产过 程中，蛋白酶抑制剂特别是丝氨酸蛋白酶抑制剂的使用对防止鱼糜的凝胶劣化具有重要作 用【l 引。丝氨酸蛋白酶抑制剂( s c r i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o r ) 是一类结构、序列同源有高度相 似性的蛋白酶抑制剂，是体内许多蛋白水解反应的调节因子【2 7 1 。天然丝氨酸蛋白酶抑制剂 大多为单一肽蛋白质，各种丝氨酸蛋白酶抑制剂大约有3 0 的序列同源性，其疏水区同源 性高达7 0 。目前己在许多哺乳动物、植物和微生物中发现此类抑制剂的存在【2 s2 9 3 。在鱼 类中，已有报道从白姑鱼1 3 0 和鲤鱼1 3 l 】的骨骼肌中纯化得到丝氨酸蛋白酶抑制剂。另外，在 鳕鱼中也发现了一种胰岛素样的丝氨酸蛋白酶抑制剂1 3 2 1 。 同样，在植物体内，丝氨酸蛋白酶抑制剂也已有较多报道，蒋欣静等 3 3 , 3 4 从大豆中提 取得到的大豆胰蛋白酶抑制剂( s o y b e a nt r y p s i ni n h i b i t o r , s t l ) 并对其做为天然m b s p 的抑制 剂进行探索性研究，结果表明添加s t i 能有效抑制鲢鱼肌肉肌原纤维的降解。进一步的研 究发现，s t i 对m b s p 的作用属于k u n i t z 型抑制。绿豆中还含有一类b o w m a n b i r k 型的丝氨酸 蛋白酶抑制剂( m u n gb e a nt r y p s i ni n h i b i t o r , m a x l ) ，此类蛋白相比于s t i 有更高的稳定性，且 不易被其他蛋白酶所降解 3 5 - 3 7 1 。虽然来源于植物的丝氨酸蛋白酶抑制剂对鱼肌肉肌原纤维 的降解有明显的抑制作用，但是，此类稳定性特别好的抑制剂往往也由于难以被消化酶降 解而成为一种抗营养因子【了7 1 。 2 虽然对于丝氨酸蛋白酶的研究已有较多报道，但大多数天然丝氨酸蛋白酶抑制剂都是 针对整个丝氨酸蛋白酶家族，相对于某一种特定的丝氨酸蛋白酶的抑制剂却少见报道。 2 0 0 0 年，c a o 等【3 8 1 从白姑鱼肌肉中发现一种新型的特异抑制白姑鱼m b s p 的抑制剂 ( m b s p i ) ，并通过分析m b s p i 内部的氨基酸序列发现白姑鱼m b s p i 与葡萄糖6 磷酸异构 酶( g l u c o s ep h o s p h a t ei s o m e r a s e ，g p i ) 有很高的同源性，且m b s p i 也表现出明显的g p i 生物活性。随后他们在海水狗母鱼肌肉中也发现了m b s p i 的存在，但狗母鱼m b s p i 对鲤 鱼的m b s p 没有抑制作用，这也暗示着该抑制剂具有种属特异性口9 j 。 1 3 葡萄糖一6 磷酸异构酶 葡萄糖6 磷酸异构酶( g l u c o s ep h o s p h a t ei s o m e r a s e ，g p i ) ( e c5 3 1 9 ) 在生理上主要参 与糖类代谢中的糖酵解作用( g l y c o l y s i s ) ，催化其第二步的可逆反应，即葡萄糖- 6 - 磷酸 ( g 6 p ) 转换为果糖6 磷酸( f 6 p ) ，而糖酵解途径在所有动植物和微生物体内均普遍存 在m 。g p i 与人体中许多的代谢病密切相关，如：人体内g p i 的缺乏会直接导致球型血红 细胞贫血症以及神经功能紊乱的产生【柏】。除了参与糖酵解过程外，g p i 还具有很多重要的 功能。在大多数细胞内，g p i 表现出细胞因子和生长因子的活性，并对类风湿关节炎患者 的血管增生、骨膜增殖和骨破坏起重要作用【4 h 2 】；g p i 能刺激鼠肿瘤细胞的活力并增强神 经元的神经外突【4 3 1 。有关研究表明，g p i 与神经白介素( n e u r o l e u k i n ，n l k ) 有可能为同 一种物质，主要表现在二者的氨基酸序列有9 0 以上的同源性，并且末端的7 5 9 个核苷酸 完全相同；除此之外，g p i 还表现出n l k 的生理功能 4 3 - 4 5 】。另外，由于许多恶性疾病如急 性肝炎、恶性肿瘤、急性心肌梗塞等均会引起患者血清中g p i 活性明显增高，并且升高程 度与病程呈正相关性，因此g p i 活性对于上述疾病有一定的诊断价值【4 丌。除此之外， h a n s e n 等人于2 0 0 4 年发现一些古细菌( a e r o p y r u m p e r n i x ) 和细菌体内的g p i 不仅能异构 化葡萄糖6 磷酸，而且能异构甘露糖6 异构酶【4 引。r i c h a r d s 等人从v i b r i ov u l n i f i c u s 中得到 异构体g p i 被发现具有氨基肽酶的活性【4 9 】。而y a k i r e v i c h 等人从大鼠体内得到的精子抗原 也被发现与g p i 具有很高的同源性，提示g p i 可能会引起精子聚剿5 0 j 。 自从n o l t m a n n 等人【”1 在1 9 6 4 年第一次从兔肌中分离得到g p i 后，关于g p i 的研究也 逐渐增多，主要集中在陆生动物、植物以及微生物中，如：人【5 2 1 、牛【5 3 1 、猪【5 4 1 、大鼠【5 5 1 、 克拉克花( c l a r l c i al e w i s i i ) 5 6 】以及一些细菌【57 - 6 0 等。国内外对鱼类g p i 的研究则相对较少， 少量针对鱼类g p i 的研究也仅限于对其异构酶方面以及遗传等方面 6 1 , 6 2 j 。对g p i 进行的分 子结构研究显示在真核生物中g p i 通常为同源二聚体蛋白，分子量由于物种的差异分布在 1 1 0 - - 1 3 0k d a 之间 5 2 - 5 6 】。相比之下，细菌g p i 的分子量相差较大，分布在6 0 - 2 0 0k d a 之间 1 5 7 6 0 1 。从v i b r i ov u l n i 汐e u s 中得到的g p i 则是异源二聚体形式，由两个分子量为6 0 8k d a 和 2 3 4k d a 的亚基组成【4 9 1 ，一些古细菌中得到的g p l 分子量约为4 3k d a l 6 3 1 和4 9k d a t 枷。 表1 1 真核生物、细茵和古细菌中g p i 的分子结构 t a b l e 1 - 1m o l e c u l a rp r o p e r t i e so f g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t ei s o m e r a s e s 鼬 垒垒垡鲤璺2 丝璺型塾垫垒坐曼曼墨堡垒曼塑： m o l e c u l a rm a s s ( x d a ) g p i r e f e r e n c e s i s o l a t e df r o m n a t i v es u b u n i t e u k a r y o t e r a b b i t1 2 50 26 4 2 、3 h u m a n1 3 4u 26 14 p o r c i n e 1 3 0 a 2 6 65 ， b o v i n e 1 1 8 a 2 5 96 m o u s e 1 2 0 啦 6 2 7 y e a s t 1 1 9 毗 6 18 b a c t e r i a b c a m o t e n a x 2 0 2 蛳 5 09 l a c t o b a c i l l u sc a s e i 6 7 啦 3 41 0 b s t e a r o t h e r m o p h i l u s 1 7 20 l i5 0ll 、1 2 v i b r i ov u l n 莎c u s8 4 ap 6 0 8 ；2 3 4 13 a r c h a e a p f u r i o s u s 4 9o t 22 31 4 1 ：! 塑2 翌坐箜生2 11 兰 g p i 在不同生物体乃至于同一生物体中的分子量的不同也表明g p i 存在同功酶形式。 对鱼类遗传学研究表明，大多数高等硬骨鱼类比陆生脊椎动物拥有更多的g p i 遗传位点【6 1 1 ， 这也暗示着鱼体内可能普遍存在g p i 的多种同工酶的形式。此外，在人【6 3 】和牛【5 3 】肌肉中也 发现了g p i 的同工酶。不过也有学者指出，这种同功酶是g p i 在纯化过程中被低程度的降 解或修饰形成的人为现象【4 0 4 1 5 2 1 。 随着对g p i 研究的不断深入以及实验仪器设备快飞速更新与发展，特别是1 9 8 8 年报 道g p i 是一种多功能蛋白质h 孓47 j 后，人们对g p i 的研究不断深入。晶体结构学研究表明， g p i 的葡萄糖磷酸异构酶的活性依赖于二聚体结构，其中每个亚基都包含大、小的结构域， 而每个结构域都由几个伍螺旋围绕着一个p 折叠中心组成【4 0 4 1 1 。两个亚基又以非对称的方 式团抱，最终形成具有异构酶活性的g p i 二聚体结构，两个亚基中的大小域所形成的口袋 状的空隙即为g p i 的活性中心( 图1 1 ) 【引，其中g l u 3 5 7 位点催化底物间的质子转移过程， 而h i s 3 8 8 或l y s 5 1 8 位点则负责底物的开环过程，h i s 3 8 8 位点则来自另一个亚基【羽。 4 有趣的是，对zt h e r m o p h i l u sh b 8 嗜热菌g p i 的晶体结构分析发现，g p i 各亚基延伸的c 端会似手臂一般环抱住另一个亚基( 图1 2 ) ，而这种“相互拥抱”的结构无疑增进了g p i 二聚 体的结构稳定性i 6 7 1 。 图1 - 1 ( a ) 人g p l 的双聚体结构；( b ) 双聚体表面的活性中心( 图片来源于参考文献6 7 ) f i g u r e 1 1 ( a ) i n t e r l o c k i n go f h u m a nc r p id i m e r s ( b ) o p e n i n go f t h ei n t e r p r o t o m e ra c t i v es i t ep o c k e t 图1 - 2 嗜热细菌g p i 的晶体结构。( a ) 双聚体结构( b ) 单聚体结构 f i g u r el 2t h ec r y s t a ls t m e t u r eo fg p if r o mt t h e r m o p h i l u sh b 8 6 7 1 ( a ) r i b b o nr e p r e s e n t a t i o no f t h ed i m e r ( b ) ar i b b o nr e p r e s e n t a t i o no fp r o t o m e r 塞差太堂亟堂僮j 佥塞鲤鱼匦厦红维绪盒型丝氢酸重自鹜凼遢丝控制剂的硒究 1 4 本文研究目的与内容 1 4 1 研究目的与意义 早期的研究发现，从海水鱼白姑鱼中分离得到的m b s p i 对鲤鱼m b s p 无法产生有效 的抑制，根据蛋白质内部氨基酸测序也表明从白姑鱼肌肉中纯化得到的m b s p i 与g p i 有 高度的同源性，此外还发现兔肌肉的g p i 与白姑鱼m b s p i 一样具有抑制m b s p 的特性【删。 以上这些有趣的结果使我们更急迫的希望弄清淡水鱼中的是否也存在这样一种的多功能 蛋白g p i 且具有m b s p i 的活性? 它对海水鱼的m b s p 是否存在抑制作用? 这些抑制作用 的机理又是什么? 因此，本文以淡水鲫鱼为研究对象，从鲫鱼肌肉中分离纯化出m b s p 与g p i ，并研究 鲫鱼g p i 对m b s p 的抑制作用，以及二者的作用机理，以期为淡水鱼糜制品的加工提供 理论依据。 1 4 2 研究内容、技术路线 ( 1 鲫鱼肌肉m b s p 的分离纯化 鲫鱼肌肉m b s p 分离纯化的基本流程图如下： 四 含0 5 l l j 工r j 尹肌浆部分孚白 j 【 s d s p a g l ：l 的磷酸缓冲液( p h6 o ) 【 性屈 l 每液 i 鲫鱼肌肉g p i 的分离纯化 6 鲫鱼肌肉g p l 分离纯化的基本流程图如下： 上 上 取肌? 分蛋白 上 透析过夜 q & 土a m s e 土 1 l 上 7 2 1 实验动物 第二章材料与方法 本实验所使用的鲫鱼( c a r a s s i u s a u r a t u s ) 购于厦门集美区菜市场，每尾重约2 0 0g 左右。 2 2 试剂 2 2 1 层析树脂 q s e p h a r o s e 、s p s e p h a r o s e 、b e n z a m i d i n es e p h a r o s e 为a m e r s h a mb i o s c i e n c e s 公司产 品( 瑞典) ；h y d r o x y a p a t i t e 为b i o r a d 公司( 美国) ；s u p e r d e xg - 2 0 0 为g eh e a l t h c a r e 公司( 美 国) 产品。 2 2 2 荧光底物 b o c - p h e - s e r - a r g - m c a ， b o c - v a l - p r o - a r g m c a ，b o c g i n a r g - a r g - m c a ， b o c - l e u l y s - a r g - m c a ，b o c - g l u - l y s - l y s - m c a ，b o c v a l - l e u l y s m c a ， b o c l e u - a r g - a r g m c a ，z - p h e - a r g m c a ，a r g - m c a ，s u c - l e u l e u v a l t y r - m c a ， s u c a l a - a l a - p r o p h e - m c a 为p e p t i d ei n s t i t u t e ( o s a k a , 日本) 公司产品。 2 2 3 蛋白酶抑制剂 b e n z a m i d i n e ，e g t a ，l i m ab e a nt r y p s i ni n h i b i t o r ( l s t i ) ，e d t a ，c h y m o s t a t i n ， p h e n y l m e t h a n e s u f o n y lf l u o r i d e ( p m s f ) 、e 一6 4 、l ，10 - p h e n a n t h r o l i n em o n o h y r d r a t e 为s i g m a ( s t 1 0 u i s ，m o ) 公司产品；p e p s t a t i n 和p e f a b