（食品科学专业论文）酰化大豆分离蛋白功能与结构特性的研究.pdf

摘要 摘要 本文系统研究了乙酞化和玻拍酞化对大豆分离蛋白( s p i ) 功能性质和结构特 征的影响，主要研究结果如下: 1 .随酞化试剂用量的增大， 酞化程度不断提高， 在相同酞化试剂用量的条件 下，乙酞化程度高于唬拍酸化，但唬拍酞化对大豆分离蛋白功能性质的影响均大 于乙酞化。 2 .在低于 4 . 3的 p h范围内，酞化降低了 s p i的溶解性，在中性和弱碱性 c p h 5 . 0 - 8 . 0 )范围内，酞化可显著地提高s p i 的溶解性，酞化还可导致大豆蛋 白质的等电点向酸性区域迁移。酞化对大豆分离蛋白的持水性能有改善作用，其 中玻拍酸化更为显著。 在低于s p i 等电点的p h 范围内， 酞化对s p i 的乳化活性指 数和乳化稳定性影响均不大。 在p h 5 . 0 -9 . 0 范围内， 酞化能够大幅提高s p i 的乳 化活性指数和乳化稳定性，唬拍酞化的影响大于乙酞化。s p i的发泡性经酞化改 性后也得到明显改善，且随酞化程度的增大而逐步提高，唬拍酞化的作用更较乙 酸化突出。 但是酞化不利于s p i 的泡沫稳定性， 且随酞化程度的增大而不断下降， 墟拍酞化的下降趋势更显著。 4 .乙酞化和琉拍酞化都阻止了s p i 热致凝胶的形成。s p i 凝胶体的硬度在 p h 6 . 0 时最大。 离子强度对大豆蛋白凝胶的质构曲线有很大影响， 随着氯化钠或氯 化钙浓度的增加，凝胶硬度先上升后下降。随酞化程度增大，大豆分离蛋白液的 粘度不断增大。 5 . u v光谱结果显示酞化处理后s p i 多肤链展开。 i r光谱显示酸配首先选择 蛋白质赖氨酸上 -n h 2 残基反应， 当 -n h z 残基被大量修饰后， 赖氨酸、 丝氨 酸和苏氨酸的轻基的酞基修饰程度增加。另一方面，蛋白多肤链的二级结构发生 较大变化，即s p i 中二级结构由d一折叠为主变化为以无规卷曲为主。 6 . s d s - p a g e 电泳结果显示改性后蛋白的 1 1 s 酸性亚基和 7 s 含量大大减少， 说明s p i 经酞化处理后分子发生了降解，随着酸配添加量的增大，l l s 球蛋白分 子逐步分解为亚基- 唬拍酞化的电泳图谱预示着可能存在一个唬拍酸化的临界点， 在这一点上，解离的蛋白亚基突然展开。 7 . d s c图谱显示s p i 经过玻拍酞化处理后热稳定性得到显著改善， 乙酸化处 理对大豆蛋白的热稳定性影响不大。 关键词:大豆分离蛋白，乙酞化，唬拍酞化，功能特性，结构 华南理工大学工学硕士学位论文 ab s t r a c t t h e e f f e c t s o f a c e t y l a t i o n a n d s u c c i n y l a t i o n o n t h e f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s a n d s t r u c t u r e c h a r a c t e r i s t i c s o f s o y p r o t e i n i s o l a t e ( s p i ) w e r e s t u d i e d s y s t e m a t i c a l l y i n t h i s p a p e r . t h e r e s e a r c h r e s u l t s a r e a s f o l l o w s : 1 .t h e m o d i fi c a t i o n d e g r e e i n c r e a s e d a s t h e l e v e l s o f s u c c i n i c a n h y d r i d e o r a c e t i c a n h y d r i d e a d d e d t o t h e p r o t e i n i n c r e a s e d . t h e m o d i f i c a t i o n r a t e w i t h a c e t i c a n h y d r i d e w a s g r e a t e r t h a n w i t h s u c c i n i c a n h y d r i d e a t a l l l e v e l s u s e d . h o w e v e r , t h e e f f e c t o f s u c c i n y l a t i o n o n t h e f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f s p i w a s g r e a t e r t h a n t h a t o f a c e t y l a t i o n . 2 .i n t h e r a n g e o f p h g4 . 3 , a c y l a t i o n d e c r e a s e d t h e s o l u b i l i t y o f s p i . i n t h e r a n g e o f n e u t r a l a n d w e a k a l k a l i n e p h ( 5 . 0 - 8 . 0 ) , a c y l a t i o n c a u s e d a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n p r o t e i n s o l u b i l i t y . a l s o , t h e i s o e l e c t r i c p o i n t o f a c y l a t e d s p i s h i f t e d t o w a r d s t h e a c i d r e g i o n . a c e t y l a t i o n i n c r e a s e d t h e w a t e r h o l d i n g c a p a c i t y o f s p i , a n d t h i s i n c r e a s e w a s n o t a s p r o n o u n c e d a s w i t h s u c c i n y l a t e d s a m p l e s . 3 . i n t h e r a n g e o f p h 7 5 %下，卵清蛋白与右旋糖普 ( d e x t r a n )混合物反应3 周以上制得的卵清蛋白 一右旋糖营共扼物，具有优越的 乳化性能。溶菌酶与右旋糖昔所得的共扼物乳化性更佳。而溶菌酶与瓜尔胶的甘 露聚糖酶水解物反应所得的化合物也具有优良的乳化性能， 可应用很多食品当中。 所得的共0 9- 物不仅能稳定乳状液， 而且也能显示一定的抗菌效果( 主要对g 一 细菌) 1 4 7 1 目前， 有关糖基化作用对蛋白质功能特性的影响仍在不断深入之中。 a o k i 等 ( 1 9 9 9 ) 14 1 1 研究了 葡萄糖醛酸 g l u u a ) 与卵清蛋白( o v a ) 之间的美拉德反应， 发现这种反应可快速进行，制得的 o v a - g l c u a共骊物除较佳的乳化性能之外， 还具有很高的热稳定性 ( 9 5 下加热 1 0 m i n仍可溶，而o v a于9 0 下已完全沉 淀) 。 麻建国等 ( 1 9 9 9 ) 14 9 1 报道了大豆分离蛋白 与魔芋多糖共价键合反应对其乳 化性能的影响，结果显示6 0 0c , 7 9 % r h下制得的美拉德反就产物具有比大豆分 离蛋白更优的乳化性能，而且发现磷酸盐以及醋酸盐对这一反应具有催化作用。 他还指出这类大分子复合物作为乳化剂具有广泛的应用前景。b a b i k e r 等 ( 1 9 9 8 ) 1 5 0 通过美拉德反应制得的大豆蛋白一半乳甘露聚糖共辘物可显著地降解大豆蛋 白的过敏性， 特别是具有很高过敏性的分子量为3 4 k 1 7 a 的蛋白质。 所得的这种共 扼物在所有 p h范围内都具有很高的溶解性，而且这种共辘作用还显著地提高了 大豆蛋白的热稳定性以及乳化性能。糖基化反应除了改善乳化性能以及溶解度之 外，还可显著地改善蛋白质的凝胶性能。许多研究进一步显示，这种反应的凝胶 化作用是蛋白质之间形成共价或者非共价链接的结果。mi t c h e l l 等人 ( 1 9 9 5 )比 较了美拉德反应凝胶和使用葡萄糖一 6 一 内酷 ( g d l ) 形成的凝胶，结果显示采用还 原糖形成的凝胶的破裂强度比采用 g d l的要高得多。而且形成凝胶所需要的最低 浓 度也 要 低得多 14 7 1 由此可见，美拉德共价健合的蛋白质一 多糖复合物既保留了蛋白质的表面活 性，而且还具有多糖的亲水性能，因而可作为 “ 绿色”乳化剂和稳定剂有着广泛 的应用前景。 1 . 3 . 5化学共价交联 通过一定的化学试剂或催化剂，使蛋白质的分子内或分子间产生交联反应 ( c r o s s - l i n k i n g ) ，从而起到一定的改善蛋白质功能特性的目的。目前，有关蛋白 质化学交联的报道还甚少，仍以美拉德反应交联为主。众所周知，蛋白质与糖类 华南理工大学工学硕士学位论文 相反应经常会导致前者溶解度的下降。现在己知，这是由于发生美拉德反应导 致 蛋白质分子的聚合的缘故。h i l l 等人证实以干粉状态存在的卵清蛋白与一系列糖 类共存会发生交联反应5 1 1 。 经过美拉德反应交联之后，蛋白质的凝胶特性以及凝 胶的保水性得到显著的提高，而且在还原糖的存在下可使较低浓度的蛋白溶液发 生交凝， 有关这一点 对于食品 凝胶体系显得非常重要。 最近， l e d e r e r 研究组5 2 .5 3 1 分别检讨了几个蛋白质. 糖体系， 分离并鉴定到蛋白质与糖类的共价单位， 这为美 拉德反应化学共价交联提供了理论基础。 f a y l e 等( 2 0 0 0 ) 5 4 1 研究了 采用去 氢抗坏血酸 ( d h a ) 以 及其降 解产物对蛋 白质进行交联，以r n a s e a作为模型蛋白， 结果显示在类似食品加工的温度范围 内，该交联反应可很快地进行，而且 d h a的降解产物的交联活性比其本身更强。 进一步研究显示，蛋白交联反应主要涉及赖氨酸，他们还指出它些分子在食品加 工过程可用于蛋白质功能特性的改性。 1 . 3 .6其它化学改性方法 除了以 上 所述的 几种化学改 性方法之外， 还有 酸胺化 19 1 、 酸水解6 1氧化5 5 1 等。 蛋白质的水解可扩宽其应用范围， 采用酸水解可用于加工一些廉价的粗原料。 酸水解还会引起一些氨基酸 ( 如色氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及一些含硫氨基酸) 的异构化以及破坏。 s r i n i v a s a n等 5 6 ,5 7 1 研究显示，限制性 ( 或可控) 氧化可以改 善蛋白 质的许多功能特性， 特别是胶凝作用。 l i u 等 ( 2 0 0 0 ) (5 5 1 采用d s c以及动 态流变分析研究了氧化作用对肌球蛋白、0 一 乳球蛋白、大豆 7 s球蛋白以及复合 体系的影响，结果显示肌球蛋白比其它蛋白更易受氧化，尽管氧化的 7 s球蛋白 显示一种较强的凝胶形成能力 ( 与未氧化相比) ，然而对其它蛋白的效果却相反。 作者指出添加外源的氧化剂来提高肌肉蛋白的功能特性不是一种可取的方法。 1 . 4 研究意义及内容 1 .4 . 1 研究意义 大豆蛋白食品在我国虽然己有二千多年的历史， 但在质量、 数量和品种上均较 落后，这使得我国人民的蛋白 质消费量远远低于世界先进水平1 5 8 1 。虽然 8 0年代 我国引进了国外技术和设备来生产大豆蛋白，但有关大豆蛋白改性和深度加工过 程中的关键 “ 软件”技术，国外作为绝密高新知识产权加以保护。九十年代中期 以来， 我国相继建成了超过3 0 条不同规模的大豆分离蛋白生产线， 设计产量己 超过 1 0 万吨。但是由于在大豆蛋白改性研究方面的投入严重不足以及工艺稳定性不佳，除用 作肉制品添加剂的高凝胶值大豆分离蛋白外，其它专用功能性大豆分离蛋白，如用 于我国普遍食用的面米制品的低凝胶值大豆蛋白，用于婴儿配方奶粉及冰激淋的 高速溶、高乳化、低抗原大豆蛋白等一直未形成生产能力，重要的特殊功能性大 第一章 绪论 豆蛋白仍依赖进口。由于产品品种单一，应用于食品的范围有限，导致国产大豆 分离蛋白的价格大幅下滑，市场严重萎缩。因此，为了长期战略发展的需要，开 发新型大豆蛋白产品并拓宽其应用范围，己经成为目前食品工业高度重视的问 题。 另一方面，随着自动化生产和产品配方的日趋精确化，食品工业对食品成分 和蛋白质组分的功能规范也提出更高的要求，需要有标准方法来定量描述蛋白质 功能特性，阐明蛋白质结构功能间的关系。所以，有必要深入了解不同条件下， 蛋白质结构特性与其功能性的关系，阐明蛋白质功能与结构在应用中的一一对应 关系，以便在具体的应用中，我们可以自主选择适合的蛋白质，或是为了改善某 种功能，知道应采取怎样的改性措施。因此，本课题的研究意义有以下两方面: 利用化学改性改善大豆分离蛋白的功能特性，拓宽其应用领域;以及探索其内在 结构和物化性质对功能性质的影响。 1 .4 .2 研究内容 本论文所进行的研究工作属于广东省 “ 十五”科技攻关农产品加工重大专项 ( 编号a 2 0 3 0 1 ) 的一部分。本论文的研究工作主要从以下几个方面开展: 1 、确定酞化反应的条件，制得样品。 2 、 研究酞化对 s p i 溶解性、持水性、乳化性、发泡性、粘度、凝胶性等功能 性质的影响，并探讨p h 、离子强度等因素对酸化s p i 功能性质的影响3 、研究酞 化对 s p i 结构特征，包括分子量大小，侧链基团等的影响，阐明s p i 酞化后功能 性质变化的内在结构因素 华南理工大学工学硕士学位论文 第二章 酞化对蛋白质水合性质的影响 2 . ，引言 食品中蛋白质的功能特性一般可分为三大类:水合性质，表面性质，和蛋白 质和蛋白质的相互作用。这三类性质不是完全独立的，例如，溶解性和粘度不仅 取决于蛋白质和水的相互作用，而且也涉及到蛋白质和蛋白质的相互作用。 将大豆蛋白质用于液态食品生产时，其溶解性与分散性，即在各种条件下的 溶解程度和溶解稳定性，便理所当然地成为加工中的首要问题。但大豆蛋白质溶 解特性的重要性还不只限于此，当发挥蛋白质所具有的各种物理机能，例如:乳 化性、起泡性、粘稠性及其它功能，或制作所谓肉糜状食品所特有的咀嚼性及至 固体状食品时，首先也多以蛋白质溶解操作为前提。所以说溶解性是发挥大豆蛋 白质功能的共同前提条件。由此可见，研究大豆蛋白质的溶解特性，对于大豆食 品的加工和大豆蛋白质的利用是非常有意义的。 本章的主要内容是通过对大豆分离蛋白进行不同程度的乙酞化和唬拍酞化改 性来研究其改性前后的溶解性、持水性和粘度的变化。 2 . 2实验材料与方法 2 . 2 . 1实验材料与仪器 2 . 2 . 1 . 1主要材料 大豆分离蛋白 ( s p i ) :哈尔滨黎明a 型，蛋白质含量 9 0 . 8 %，水分5 . 9 7 %, 灰分 2 . 8 3 ，脂肪 0 . 9 0 %. 2 . 2 . 1 . 2主要试剂 表2 - 1实验试剂 t a b l e 2 - 1 e x p e r i m e n t r e a g e n t s 试剂名称规格一产地和产家 唬拍酸配c . r .中国医药 ( 集团)上海化学试剂公司 乙酸醉a . r .广州化学试剂厂 硫酸a . r .广州市东红化工厂 酒石酸钠a . r .广州化学试剂厂 无水硫酸铜a . r .广州化学试剂厂 氯化亚锡a . r .广州化学试剂厂 柠檬酸a . r .汕头市光华化学厂 氢氧化钠a . r天津市天新精科化工开发中心 盐酸a . r 。广州市东红化工厂 缓血酸钱生化试剂上海伯奥生物科技有限公司 氯化钠a . r .汕头市光华化学厂 2 . 2 . 1 . 3主要仪器与设备 第二章 酞化对蛋白 质水合性质的影响 表2 一2实验仪器与设备 t a b l e t - 2 e x p e r i m e n t i n s t r u m e n t s a n d e q u i p m e n t s 仪器/ 设备名称 l g j - 1 0 冷冻干燥机 p h s - 2 5 型酸度计 真空旋转浓缩器 s p e a t r u m l,a b 2 2 p c 分光分度仪 k d n - 0 4 消化炉 k d n -0 4 a定氮仪 d f - 1 型集热式磁力搅拌器 j b - 3 型定时恒温磁力搅拌器 强力电动搅拌机 j a 2 0 0 3 型上2 . 电子天平 j j 5 0 0 型精密电子天平 z 3 2 3 k 台式冷冻高速离心机 d vi 型b r o o k fi e l d 旋转粘度计 产地和产家 北京四环科学仪器厂 上海虹益仪器厂 上海医械专机厂 上海凌光科技 上海新嘉电子有限公司 上海新嘉电:f 有限公司 金坛市新一佳仪器厂 上海雷磁新径仪器有限公司 上海标本模型厂制造 上海精科仪器厂 常熟双杰测试仪器厂 德国 美国 2 . 2 . 2方法 2 . 2 . 2 . 1乙酞化或玻拍酞化 5 9 6 i % ( w / v ) 大豆分离蛋白溶液在搅拌条件下分多次加入 0 . l g h g , 0 . 3 g / 8 , 0 . h g / g , 0 . 9 g / g 蛋白的乙酸配或墟拍酸配。反应过程中以i m o l / i n a o h 调节溶液 p h 在7 . 5 -8 . 5 范围， 反应结束后用去离子水透析(wc , 2 4 h ) , 然后冷冻干燥备用。 2 . 2 . 2 . 2酞基化程度的测定1 6 0 1 本实验采用p a i k 等( 1 9 7 2 ) 的苟三酮比色法测定蛋白质的酞化程度， 测定原理 是赖氨酸的 一 氨纂在碱性溶液中能与茹三酮作用， 生成蓝紫色化合物， 其颜色深 浅与氨基酸含量成正比， 可用吸光光度法测定。 测定方法为吸取浓度为 l % ( w / v ) 的蛋白液 l m l ， 加入2 % ( w / v ) m e酮溶液 1 m 1 , 混合液于 1 0 0 水浴上加热5 m i n , 迅速冷至2 5 0c ,加入 5 m 1 蒸馏水，在5 8 0 n m 波长下，测定溶液的吸光度，以2 % ( w 八) 荀三酮溶液为参比液。 2 % ( w 八) 荀三酮溶液的配置16 0 1 : 3 0 m 1 柠橡酸缓冲液 ( 0 . 2 m , p h 5 )与 3 0 m 1 的苟三酮溶液 ( 浓度为4 %,溶剂为2 一乙氧基乙醇)混合，加入 5 0 m g 氯化亚锡 ( s n c l z h 2 0 )， 搅拌过滤备用。 2 . 2 . 2 . 3蛋白质含量测定:凯氏定氮法 ( g 8 5 0 0 9 . 5 - 8 5 ) 2 . 2 . 2 . 4溶解性的测定 一一一 上 壑1二 芝 璧壑翌 羹 里鳖 滋 一 一盛一一 采用v缩 脉法 6 i ， 将l g 蛋白 质溶于蒸 馏水， 配成一定p h 值( 用l m o l / 1 n a o h 和l m o l / i h g i 调节) 和一定盐浓 度的 溶液1 0 0 m 1 ， 搅拌 器搅拌1 0 m i n , 然后4 0 0 0 r p m 离心1 o m i n ， 取上 清液l m l ， 加蒸馏水至3 m 1 ， 再 加入3 m l 双缩脉试剂， 静置3 0 m i n 后于5 4 0 n 二 波长下 测其吸光 度，以 蒸 馏水为参比 液。 测定己 知浓度的 牛血清 清蛋 白( b s a ) 在 同 样 条 件 下 的 吸 光 度， 绘 制 标 准曲 线 ， 上 清 液 中 蛋 白 质 含 量 ( m g / m l) 可以通过标准曲线来推算。 双 缩 脉 试 剂的 配 置: 将3 g 酒 石 酸钠 和。 . 7 5 g 硫 酸 铜 溶 于2 5 0 m l 蒸 馏 水。 在 搅 拌下加入1 5 0 m l 1 0 o n a o h ，最后定容至5 0 0 m 1 . 2 . 2 . 2 . 5持水性的测定6 2 1 2 g蛋白 质 样品( w ) 分多 次 加入一 定体 积的去离 子水， 直至搅拌至浆状。 静置 3 0 m i n 后置于已 知重量的离心管 w ,) 中， 8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ， 除去上清液， 再次 称量离心管( w o ,以( w 2- w i- 司/ w即 样品 增重占 原 重的百 分数( %)作为持水 性的 指 标。 2 . 2 . 2 . 6粘度的测定 6 3 采用d vi 型b r o o k fi e l d 旋转粘度计。 说明:各测定过程除特别说明外，均在室温下进行，重复三次，以平均值作 为实验结果。 2 . :3结果与讨论 2 . 3 . 1改性程度的测定 本实验中控制酞化反应在 p h 7 . 5 - 8 . 5 的弱碱条件下进行， 蛋白质浓度 6 -7 % ( w / v ) ，分批等量加入酸醉试剂。缓慢加入o . l g / g , 0 . 3 g / g , 0 . 6 g / g , 0 . 9 g / g 蛋 白的乙酸醉或唬拍酸配，测定相应的改性程度。不同酸醉添加量对 s p i 赖氨酸上 e -n h 2 残基的改性程度的影响如图 2 - 1 所示。 结果表明， 随着添加酸配比例 的增 大，s p i 的改性程度也逐步增大。在同样的酸配添加量下，乙酞化对 s p i 的改性 程度都大于唬mor化。添加量为0 . i g l g 蛋白时，乙酞化蛋白中s p i 的改性程度达 到7 5 .4 9 ，而墟拍酞化的仅为5 1 .6 2 。当酸af添加量超过0 .3 g / g 蛋白时，s p i 赖氨酸上大部分的 -n h : 残基被修饰。从本实验结果还可以看出，乙酸配对大 豆分离蛋白的酞化程度较剧烈。 第二章 酸化对蛋白 质水合性质的影响 2 . 4本章小结 i . 采用乙酸ff f 和唬拍酸ff f 对大豆分离蛋白进行酞化改性，随着酞化试剂用量 的增大，大豆蛋白的酚化程度不断提高，相同酞化试剂用量下，乙酸化程度高于 玻拍酞化。 z . 研究了改性程度和p h 对s p i 溶解性能的影响， 结果显示: 在中性和弱碱性 c p h 5 . 0 r 8 . 0 )的环境中，酸化明显提高了蛋白质的溶解性，玻拍酞化的作用比 乙酞化显著;在低于大豆蛋白等电点的p h 环境中，酞化降低了蛋白质的溶解性。 3 . 酞化可导致大豆蛋白的等电点向酸性方向漂移，且唬拍酞化更明显。唬拍 酸配添加量为0 .6 g / g 蛋白 时， 大豆蛋白的 等电点从4 . 3 迁移至3 . 9 . 4 . 乙酞化和玻拍酞化对大豆分离蛋白的持水性能均有改善作用，其中玻拍酞 化更为显著。 5 随改性程度的增大，s p i的粘度不断增大，唬拍酞化的影响大于乙酞化， 表明酞化改变了蛋白质的结构。 华南理工大学工学硕士学位论文 第三章 酞化对蛋白质表面性质的影响 3 . 1引言 蛋白质的乳化性和发泡性都是其表面特性的一种表现。蛋白质是典型的两性 分子，它们在液液或气液界面的吸附作用很大程度上与蛋白质分子的疏水性及其 表面电荷有关。而疏水性的改变和蛋白表面活性的提高都可以由蛋白质的化学修 饰来实现。有报道指出乙酞化和唬拍酞化通过引入负电荷，增大了蛋白质分子内 和分子间的静电排斥力，溶液的乳化性和起泡性都得到改善。并且酞化产物使蛋 白 质分子膨胀， 可提高其功能性质【6 7 1 。 乳化性的这种提高亦可见于乙酞化大豆球 蛋白、乙酞化鹰嘴豆蛋白、玻拍酞化 b s a和酞化翼豆粉等，它们的起泡性能也能 得 到 提 高 6 8,6 2 ,69 ,6 4 1 酞化对蛋白质的乳化性能和起泡性能的改善作用己经得到大量验证。本章的 主要内容是研究不同酸配添加量、 p h 值和离子强度对大豆分离蛋白乳化性能和发 泡性能的影响。 3 . 2实验材料与方法 3 . 2 ,. 1实验材料与仪器 3 . 2 . 1 . 1主要材料 大豆分离蛋白 ( s p 工 ) :哈尔滨黎明a 型，蛋白质含量9 0 . 8 %，水分5 . 9 7 %, 灰分2 . 8 3 %，脂肪0 . 9 0 %o 3 . 2 . 1 . 2主要试剂 表 3 一1实验试剂 t a 6 1 e 3 - 1 e x p e r i m e n t r e a g e n t s 团厂科有学学学科科科工学 集剂物脂化化化物物精化化 试生油华华华生生新红华 药学奥兴光光光奥奥天东光 医化伯合市市市伯伯市市市 国州海禺头头头海海津州头 中广上番汕汕汕上上天广汕 c a. 剂剂剂 试试试 化售r.r.r.化化r.凡r. 生市凡九a.生生凡a.a* 名-酸配酸油酸二氢甲烷化 剂一拍酸血米檬酸酸轻二氧酸化 试-唬乙缓粟柠磷磷三十氢盐氯 3 . 2 . 1 .3主要仪器与设备 第三章 酸化对蛋白质表面性质的影响 表 3 -2实验仪器与设备 t a b l e 3 - 2 e x p e r i m e n t i n s t r u m e n t s a n d e q u i p m e n t s 仪器/ 设备名称 高速分散均质机f j - 2 0 0 p h s - 2 5 型酸度计 s p e e t ru m l a b 2 2 p c分光分度仪 家庭搅拌机 p 工 p e t t e 取液枪 l g j - 1 0 冷冻干燥机 k d n - 0 4 消化炉 k d n -0 4 a 定氮仪 真空旋转浓缩器 微型旋蜗混合仪 j a 2 0 0 3 型上皿电子天平 d f - 1 型集热式磁力搅拌器 j b - 3 型定时恒温磁力搅拌器 j j 5 0 0 型精密电子天平 产地和产家 上海标本模型厂 上海虹益仪器厂 上海凌光科技 白马电器 北京青云航空仪表有限公司 北京四环科学仪器厂 上海新嘉电子有限公司 上海新嘉电子有限公司 上海医械专机厂 上海沪西分析仪器厂 上海精科仪器厂 金坛市新一佳仪器厂 上海雷磁新ial 仪器有限公司 常熟双杰测试仪器厂 3 . 2 . 2实验方法 3 . 2 . 2 . 1乙酸化或玻拍酸化 同 2 . 2 . 2 . 1 3 . 2 . 2 . 2酞荃化程度的测定 同2 . 2 . 2 . 2 3 . 2 . 2 . 3蛋白质含量测定:凯氏定氮法 ( g b 5 0 0 9 . 5 -8 5 ) 3 . 2 . 2 . 4蛋白质乳化性和乳化稳定性的测定7 0 1 用0 .0 5 m o l / l t r i s - h c i 缓冲液 ( p h 7 . 5 ) 配制1 % 的蛋白 液，取1 m i 色拉油与 3 m l 待测溶液于均质机中均质 1 m i n ， 分别于0 和 1 0 m i n 时从底部取5 0 p 1 ， 用2 5 m l 0 . 1 %s d s稀释后测 o d 5 o o . 乳化活力指数( e a i ) = ( 2 . 3 0 3 x 2 x o d 5 o 0 ) / ( c x 4 ) x l ) x 稀释倍数 乳状液稳定指数( e s ) 二 o d 5 oo x a t / a o d 5 oo 其中: e a i 一每克蛋白 质的乳化面 积， m 2 / g ; 。一油相所占的分数，本实验中油相占1 / 4 : c 一蛋白质的浓度，1 %; 华南理工大学工学硕士学位论文 3 . 3 , 2 . 4讨论 蛋白质分子酞化后，起泡性明显升高，与其结构和电化学性质有关: ( 1 )溶解性增加，可利用的蛋白质浓度增大; ( 2 )酞化反应后， 分子带电荷增多，结构略为松弛， 有利于开链， 使泡沫容 易生成。结构的松弛，使亲水亲油性基团暴露较多，可利用性提高，有利于分子 在液膜上定向; ( 3 )双电层电位升高， 有利于阻止液膜变薄， 也有助于阻止不同液膜间的相 互靠近，形成盐键和氢键，造成絮凝。 ( 4 )溶液粘度升高，在同样毛细管力作用下液体从膜中流失的速率减慢。 可见增加粘度、疏水性和溶解性可改善蛋白的发泡性，但随着酸配添加量的 加大，蛋白分子表面的负电荷逐渐增加，于是产生了静电斥力，这一斥力阻碍了 膜和泡沫的形成，从而降低了泡沫的稳定性。这一结果与前人对其它一些蛋白质 的研究结果相一致，如b - l g 、蚕豆、豌豆浓缩蛋白、棉籽浓缩蛋白、燕麦浓缩蛋 白的泡沫稳定性都随着酞化程度的增加而降低( 7 2 . 7 6 3 . 4本章小结 1 .在低于大豆分离蛋白等电点的p h 范围内，酸化对s p i 的乳化活性指数和 乳化稳定性影响均不大。在中性和弱碱性 ( p h s . 0 - 9 . 0 )范围内，酞化明显提高 了s p 工 的乳化活性指数和乳化稳定性，玻拍酞化的影响大于乙酞化。 2 . n a c l 降低了s p i 的乳化活性指数和乳化稳定性。 3 .酞化明显改善了s p i 的发泡性，且随酞化程度的增大，s p i 的发泡性逐步 提高，玻泊酸化的作用更较乙酸化突出。 4 酞化降低了s p i 的泡沫稳定性，珑拍酸化的下降趋势更显著。 5 .高离子强度对 s p i 的发泡性和泡沫稳定性有改善作用，但变化不明显。 第四章 酸化对蛋白质凝胶性质的影响 第四章 酞化对蛋白质凝胶性质的影响 4 . 1引言 凝胶作用是大豆蛋白重要的功能特性之一。近年来，人们己做了许多工 作来探讨大豆蛋白的凝胶机理及稳定凝胶体分子间的作用力，结果发现，蛋 白质的胶凝过程分为两步，首先是构象的变化 ( 通常热处理导致)或蛋白质 分子发生部分变性，随着变性的继续，解离蛋白质分子扩展开，于是溶液的 粘度增加;接着变性的蛋白质个体间逐步聚集，当它们聚集形成连续的网络 结构时，溶液的粘度按指数增长。第二步相对前一步缓慢，以便形成结构完 好的网络凝胶。要得到良好的网络结构和稳定性，还需要吸引力和排斥力相 平衡。如果吸引力为主，就会形成凝块，水会被挤出凝胶网络。如果排斥力 为主，网络结构将无法产生。 宏观研究方面，进行了胶体结构与质构特性及持水性关系的研究，研究 发现，二硫键、氢键及疏水交互作用是稳定胶体结构的主要作用力，胶体的 质构特性主要是与网络的交联程度有关，并且胶体的力学强度的增加也伴随 着持水性的增加。 本章主要以大豆分离蛋白及其酞化改性蛋白为研究对象，探讨酞化程 度、p h 、盐效应等对其质构性质的影响。 4 . 2实验材料与方法 4 . 2 . 1实验材料与仪器 4 . 2 . 1 . 1主要材料 大豆分离蛋白 ( s p i ; %，灰分 2 , 8 3 %，脂肪 0 . 4 . 2 . 1 . 2主要试剂 哈尔滨黎明a型，蛋白质含量 9 0 . 8 ，水分 5 . 9 7 9 0。 表 4 一1实验试剂 一一一一一里垫塑盛鹉之吐望丝二一一一一 一一 t a b l e 4 - 1 e x p e r i m e n t r e a g e n t s 试剂名称 唬泊酸ff f 乙酸配 硫酸 酒石酸钠 无水硫酸铜 氯化亚锡 柠檬酸 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 盐酸 氯化钠 规格 c . r . a . r . a . r . a . r . a . r . a . r . a . r a . r . a . r . a . r a. r . 产地和产家 中国医药 ( 集团)上海化学试剂公司 广州化学试剂厂 广州市东红化工厂 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 汕头市光华化学厂 汕头市光华化学厂 汕头市光华化学厂 广州市东红化工厂 汕头市光华化学厂 4 . 2 . 1 . 3主要仪器与设备 表 4 -2实验仪器与设备 t a b l e 4 - 2 e x p e r i m e n t i n s t r u m e n t s a n d e q u i p m e n t s 仪器/ 设备名称 l g j - 1 0 冷冻干燥机 p h s - 2 5型酸度计 质构分析仪 s p e c t r u m l a b 2 2 p c 分光分度仪 d f - 1 型集热式磁力搅拌器 j b - 3 型定时恒温磁力搅拌器 强力电动搅拌机 j j 5 0 0型精密电子天平 z 3 2 3 k台式冷冻高速离心机 旋转式数字粘度计 产地和产家 北京四环科学仪器厂 上海虹益仪器厂 t a - x r i公司 上海凌光科技 金坛市新一佳仪器厂 上海雷磁新径仪器有限公司 上海标本模型厂制造 常熟双杰测试仪器厂 德 国 美 国 4 . 2 . 2实验方法 4 . 2 . 2 . ， 乙酸化或玻拍酞化 同 2 . 2 . 2 . 1 a 2 . 2 .2 酞基化程度的测定 第四章 酞化对蛋白质凝胶性质的影响 同 2 . 2 . 2 . 2 4 . 2 . 2 . 3凝胶体的制备 一定量的大豆蛋白用去离子水溶解后倒入铝盒中，置于水浴锅内，升温 至 9 0 加热处理 4 5 m i n ，室温下冷却， 最后所有样品置于冰箱中4 下过夜。 4 . 2 . 2 . 4质构特性测定 7 7 1 用于质构分析的凝胶体厚度为 2 0 m m ,测定仪器为 t a - x r i公司的质构分 析仪 ( t e x t u r e a n a l y s e r ) .测定采用压缩模式，压缩变形为样品高度的 3 0 %，探头使用 p / 0 . 2 5 s s ，检测速度为 1 ， 二 / s ，检测温度为室温。 说明:各测定过程除特别说明外，均在室温下进行，重复三次，以平均 值作为实验结果。 4 . 3结果与讨论 4 .3 . 1 酞化程度的影响 本实验采用 1 2 %的大豆分离蛋白制备凝胶体，发现唬拍酸化和乙酞化 s p 工 在 p h 7 . 0 和 8 . 0时都不能形成凝胶体，在 p h 5 . 0和 p h 6 . 0时有微弱凝胶 体形成，但脱水现象很明显。如图 4 - 1 和图 4 - 2所示，乙酸醉添加量和玻拍 酸配添加量为0 . 1 g / g 和 0 . 3 g / g 蛋白时都不能形成凝胶体，说明酞化处理妨 碍了s p 工 形成凝胶体。 分析原因可能在于酸化改变了蛋白质分子的疏水性质，且减少了蛋白质 分子的带电基团， 相邻分子间的离子键减弱， 从而阻止了s p i 形成热致凝胶。 图4 - 1 乙酸化程度对大豆分离蛋白凝胶体质构特性的影响( p h 6 .0 ) f i g . 4 - 1 . t h e e f f e c t o f t h e a c e t y l a t e d d e g r e e o n t h e t e x t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f s p i g e l ( p h 6 . 0 ) 华南理工大学工学硕士学位论文 f o r c e 1 口( g 1 翩娜咖 晒2 s . 0 t i m e ( s e c .) 图4 - 2 唬拍酞化程度对大豆分离蛋白凝胶体质构特性的影响( p h 6 . 0 ) f i g .4 - 2 . t h e e f f e c t o f t h e s u c c i n y l a t e d d e g r e e o n t h e t e x t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o # s p i g e l ( p h 6 . 0 ) 4 . 3 . 2 p h的影响 由表 4 - 3可得，凝胶体的硬度在 p h 6 . 0时最大，可以形成较好的凝胶 在 p h 7 . 0 时不能形成凝胶，其它 p h 下只能形成比较弱的凝胶。 表 4 - 3 p h 对 1 0 %大豆分离蛋白凝胶体的质构参数的影响 t a b l e 4 - 3 t h e e f f e c t o f p h v a l u e o n t h e t e x t u r e p r o f i l e p a r a m e t e r s o f s p i g e l 6 . 5 7 . 0 硬度 0 . 0 9 6 0 . 2 4 4 0 . 1 6 3 不 形 成 凝 胶 0 . 0 9 4 0 . 1 7 4 弹性 0 . 8 3 6 0 . 9 0 2 1 . 5 3 6 内聚性 0 . 3 7 3 . 4 6 6 0 4 5 胶粘性 0 . 0 3 6 0 . 1 1 3 0 . 1 7 0 耐咀性 0 . 0 3 0 0 . 1 0 3 0 . 2 6 2 8 . 5 9 . 0 0 . 9 5 6 0 . 81 4 0 . 5 1 2 0 . 7 5 2 0 . 0 4 8 0 . 1 3 1 0 . 0 4 6 0 . 1 0 6 3 2 第四章 酸化对蛋白质凝胶性质的影响 4 . 3 . 3 离子强度的影响 胶体由于盐离子的存在，质构特性会发生很大的变化。实验中采用了氯 化钠和氯化钙，其质构结果分别如图 4 - 3 和图 4 - 4 所示。 f o r c e ( b ) t i m e ( s e a ) 图4 - 3氯化钠浓度对 1 0 %大豆分离蛋白凝胶体质构特性的影响 f i g . 4 - 3 . t h e e f f e c t o f v a r i o u s n a c i c o n c e n t r a t i o n s o n t h e t e x t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f s p i g e l 表 4 - 4 n a c i 浓度对 1 0 %大豆分离蛋白凝胶体的质构参数的影响 t a b l e 4 - 4 t h e e f f e c t o f v a r i o u s n a c l c o n c e n t r a t i o n s o n t h e t e x t u r e p r o f i l e p a r a m e t e r s o f s p i g e l 氯化钠浓度 ( m ) o 硬度 不形成 凝胶 0 . 1 5 1 0 . 1 9 9 0 . 2 3 6 0 . 1 9 7 弹性内聚性胶粘性耐咀性 o 2 0 . 3 0， 4 0. 5 0 . 9 1 1 0 . 9 0 3 0 . 8 9 0 0. 8 9 4 0 ， 4 5 9 0 . 4 5 3 0 4 3 2 0 . 4 1 2 0 . 0 6 9 0 . 0 9 0 0 . 1 0 2 0 . 0 8 1 0 . 0 6 3 0 . 0 8 1 0 . 0 9 1 0 . 0 7 2 离子强度对凝胶质构曲线有很大影响，随着氯化钠浓度的增加，凝胶硬度先 上升后下降，其中浓度达到 0 . 4 m 时硬度值最大。弹性和内聚性由于氯化钠的增 华南理工大学工学硕士学位论文 加而降低。胶粘性和耐咀性在氯化钠 。 .4 m 浓度时达到最大值。二价离子对于凝 胶体的质构性质也产生了显著影响，如图4 - 4和表 4 - 5所示。低浓度的氯化钙增 加了胶体的硬度，但添加高浓度的氯化钙时，硬度降低，说明盐离子强度较高会 妨碍胶体形成良好结构。弹性在氯化钙 0 . 2 m 浓度时达到最大值。内聚性、胶粘 性和耐咀性在氯化钙 0 . 3 m 浓度时达到最大值。 f o r c e 1 0 . 0 0 f g ) 图4 - 4氯化钙浓度对 1 0 %大豆分离蛋白凝胶体质构特性的影响 f i g . 4 - 4 . t h e e f f e c t o f v a r i o u s c a c l 2 c o n c e n t r a t i o n s o n t h e t e x t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f s p i g e l 表 4 - 5 c a c 1 2 浓度对 1 0 %大豆分离蛋白凝胶体的质构参数的影响 t a b l e 4 - 5 t h e e f f e c t o f v a r i o u s c a c 1 2 c o n c e n t r a t i o n s o n t h e t e x t u r e p r o f i l e p a r a m e t e r s o f s p i g e l 氯 化 钙 浓 度硬度弹性内聚性胶粘性耐咀性 ( m )一 0 0 . 8 6 5 0 . 9 0 2 0 . 5 9 5 0 . 5 7 5 0 . 5 1 8 0 . 2 0 . 8 9 0 1 . 0 4 8 0 . 6 4 5 0 . 5 7 4 0 . 6 0 2 0 . 3 0 . 9 4 5 1 . 0 2 5 0 . 6 8 7 0 . 6 4 9 0 . 6 6 5 0 . 4 0 . 8 9 1 0 . 8 7 2 0 . 5 3 5 0 . 4 7 6 0 . 4 1 5 3 4 第四章 酞化对蛋白质凝胶性质的影响 4 . 4本章小结 i . 实验结果显示乙酞化和唬拍酞化都妨碍了s p i 形成热致凝胶。 分析原因可 能在于酞化处理改变了蛋白质分子的疏水性质，而且酞化导致了蛋白质中带电基 团的减少，相邻分子间的离子键减弱，从而妨碍了s p i 凝胶体的形成。 2 . s p i 凝胶体的硬度在 p h 6 . 0时最大，可以形成较好的凝胶，在其它p h 值 下只能形成比较弱的凝胶。 3 . 离子强度对 s p i 凝胶的质构曲线有很大影响。 随着氯化钠或氯化钙浓度的 增加，凝