（食品科学专业论文）豆腐乳发酵功能菌菌系优化的研究.pdf

、 r 、 1 i； j 西华大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研 究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地 方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其 他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 搿文篇聋俊铲币篇厶尸他 日期： 如7 9 占了 日期 p 厶尸 o 。一” 西华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，在 校攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，西华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。( 保密的 论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者签名：粕俊 日期： 加。6 。7 三心 1 x l 。i j 气、 - 。- 。 西华大学硕士学位论文 摘要 四川大邑唐桥豆腐乳以其独特的风味风靡国内外，但目前整个豆腐乳产业水 平相对落后，仍采用自然发酵进行生产，不安全隐患普遍存在。对于食品安全问 题凸显的食品产业来说，对豆腐乳的安全生产也提出了更高的要求。本文针对该 自然发酵微生物群进行毛霉菌种的分离，筛选出2 株适宜生产发酵的纯种毛霉菌 种m 5 、m 1 6 。 m 5 ：具有不同于其它毛霉的明显生理形态。生长时间3 0 h 菌丝高度可达1 1 1 3m m ，菌落周围颜色则随时间的变化由浅黄色逐渐呈现黄绿色，且培茵时间4 8 h 菌落变得稠密，呈中心微白周围黄绿的状态；m 1 6 ：较强的耐高温性。菌落均呈 白色，培养2 4 h 可见疏松的菌丝生长，而到7 2 h 菌落变的浓密且菌丝高度可达1 4 r a m 以上，而在温度实验中在3 0 的温度下其它菌株的生长均明显受到影响，只有 m 1 6 并未受到影响，只有温度升高到3 2 以后由于水分的快速散失生长受到些许 影响但仍然能够生长。这两株目标菌株均为产中性蛋白酶毛霉，二者最适培菌时 间在5 0 h 左右，且在培菌期间积累大量的糖化酶、q 淀粉酶、脂肪酶，培菌7 2 h 后菌体开始老化，酶活有所下降。整个培菌过程的生化变化是，部分蛋白质水解 成可溶性蛋白质。 对m 1 6 进行最佳培菌条件的探索。在单因素试验基础上，利用响应面法对腐 乳生产的培菌条件进行优化。响应面分析结果表明，培菌最佳条件为：温度2 8 、 时间7 2 7 h 、接种量1 0 2 。 本研究同生产密切结合，对唐桥豆腐乳行业水平提高有很好的指导作用。 关键词：豆腐乳；毛霉；响应面 豆腐乳发酵功能菌菌系优化的研究 a b s t r a c t t a n g q i a os u f uo fs i c h u a nd a y ii sp o p u l a ra th o m ea n da b r o a df o ri t su n i q u ef l a v o r , b u tt h ei n d u s t r i a ll e v e lo ft h es u f up r o d u c t i o ni sl o w e r n a t u r a lf e r m e n t a t i o ni ss t i l lu s e d ， a n de x i s t e n c eo fu n s a f er i s k s f o rf o o ds a f e t yi s s u e sh i g h l i g h t e di nt h ef o o di n d u s t r y , t h e s a f e t yo ft h es u f up r o d u c t i o na l s op u tf o r w a r dh i g h e rr e q u i r e m e n t s i nt h i sp a p e r , t h e n a t u r a lf e r m e n t a t i o no ft h em i c r o o r g a n i s m sm u c o rs t r a i n sw e r ei s o l a t e d ，t w os u i t a b l e f o rf e r m e n t a t i o no f p u r em u c o r s t r a i n sm 一5 ，m - 16w e r es e l e c t e d m - 5 ：w i t ht h eo b v i o u sd i f f e r e n tf r o mo t h e rm u c o rp h y s i o l o g y 30 hm y c e l i u m g r o w t ht i m eh i 曲u pt o11 1 3m m ，c o l o ra r o u n dt h ec o l o n i e sw e r et h ec h a n g e so v e r t i m eb yt h el i g h ty e l l o wt a k e so nay e l l o w i s hg r e e n ，a n dt h eb a c t e r i ac u l t u r et i m eo f4 8 h t ob e c o m ed e n s ec o l o n y , w a sc e n t r a lw h i t i s hy e l l o wa n dg r e e na r o u n dt h es t a t e ；m 一16 t h ： s t r o n gt e m p e r a t u r er e s i s t a n c e c o l o n i e ss h o w e daw h i t e ，l o o s ec u l t u r e d2 4 hv i s i b l e m y c e l i a lg r o w t h ，w h i l et h e7 2 ha n dt h ec o l o n i e sb e c o m et h i c km y c e l i u mh e i g h tu pt o 14 m ma b o v et h et e m p e r a t u r ee x p e r i m e n t si nt h et e m p e r a t u r ea t30 t h eg r o w t ho f o t h e rs t r a i n sw e r es i g n i f i c a n t l ya f f e c t e do n l ym 一16w e r en o ta f f e c t e d ，o n l yt h e t e m p e r a t u r ew a si n c r e a s e dt o3 2 a f t e rt h er a p i dl o s so fw a t e rb e c a u s eg r o w t hw a s s l i g h t l ya f f e c t e db u ts t i l l a b l et og r o w t h i st w ot a r g e ts t r a i n sw e r en e u t r a lp r o t e a s e p r o d u c e db ym u c o r , b o t ho p t i m a la n db a c t e r i ac u l t u r ei n5 0 ht i m ea r o u n d ，a n db a c t e r i a i nc u l t u r ea c c u m u l a t e dd u r i n gt h el a r g ea m o u n to fg l u c o a m y l a s e ，a - a m y l a s e ，l i p a s e ，a n d b a c t e r i ac u l t u r ec e l la f t e r7 2 hb e g i nt oa g e ，a c t i v i t yd e c l i n e d t h ew h o l ep r o c e s so f b i o c h e m i c a lc h a n g e si nt h ec u l t u r ei sp a r to ft _ h ep r o t e i nh y d r o l y s i si n t os o l u b l ep r o t e i n m 一16c a r r i e do u to nt h eb e s tc o n d i t i o n sf o rb a c t e r i ac u l t u r et oe x p l o r e i nt h e s i n g l e - f a c t o rt e s tb a s e do nt h er e s p o n s es u r f a c em e t h o ds u f up r o d u c t i o na n db a c t e r i a c u l t u r ec o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e b a c t e r i ac u l t u r et h eb e s tc o n d i t i o n sa r e ：t e m p e r a t u r e2 8 ，t i m eo f7 2 7 h ，10 2 i n o c u l u m t h i ss t u d yc l o s e l yi n t e g r a t e dw i t ht h ep r o d u c t i o no ft a n g q i a os u f ui n d u s t r y , t h e l e v e lo ft a n gb r i d g ew i l lb er a i s e de f f e c t i v e l y k e y w o r d s ：s u f u ，m u c o r , r e s p o n s es u r f a c e 2 西华大学硕士学位论文 目录 弓i 言。1 1 1 豆腐乳简介1 1 2 国内外豆腐乳的研究状况4 1 3 豆腐乳生产用微生物5 1 4 本课题研究目的与意义1 1 2 豆腐乳中毛霉菌株的初步筛选1 2 2 1 引言1 2 2 2 材料与方法1 3 2 3 结果与分析1 4 2 4 结论18 3m 5 ，m 1 6 培菌期主要生化变化1 9 3 1 引言1 9 3 2 材料与方法1 9 3 3 结果与分析2 6 3 4 结论3 4 4 响应面法优化m 1 6 培菌条件。3 5 4 1 引言3 5 4 2 材料与方法3 5 4 3 结果与分析3 6 4 4 结论4 6 5 总结与展望4 7 5 1 总结4 7 5 2 展望4 7 参考文献。4 8 攻读硕士学位期间学术论文及科研情况。5 1 致谢5 2 豆腐乳发酵功能菌菌系优化的研究 c o n t e n t s l i t e r a t u r er e v i e w 1 1 1s u f up r o f i l e 1 1 2t y p e sa n dc h a r a c t e r i s t i c so fs u f up r o d u c t i o n 4 1 3r e s e a r c ho ns u f ua th o m ea n da b r o a d ! ； 1 4t h ep u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c ei nt h i sr e s e a r c h 1 1 2t h ei n i t i a ld c r e e n i n go fm u c o rs t r a i n si ns u f u 1 2 2 1l i t e r a t u r er e v i e w 1 2 2 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 3 2 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 1 l 2 z ic o n c l u s i o n 。1 ； 3 b i o c h e m i s t r yc h a n g ed u r i n gc u l t i v a t i o no fm - 5a n dm 一1 6 1 9 ：；1l i t e r a t u r er e v i e w 1 9 3 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 9 ：；3r e s u l t sa n da n a l y s i s ：1 6 3 4c o n c l u s i o n ：；z i 4r e s p o n s es u r f a c em e t h o dt oo p t i m i z et h ec o n d i t i o n so fc u l t i v a t i o no fm - 1 6 3 5 4 1 l i t e r a t u r er e v i e w ：；! ； 4 2 m a t e r i a l sa n dm c t h o d s 3 5 4 3 r e s u l t sa n da n a l y s i s ：；6 4 4 c o n c l u s i o n 4 6 5s u m m a r ya n do u t l o o k q 1 7 1 ；1 s u m m a r y 。z 1 7 1 ；2o u t l o o k 4 7 r e f e r e n c e s 4 8 a c h i e v e m e n t s 5 1 a c k n o w l e d g e 5 2 4 西华大学硕士学位论文 引言 1 1 豆腐简介 豆腐乳是中国著名的民族特色微生物发酵豆制品【1 1 ，其以大豆为原料，在制成 的豆坯中接入菌种进行发酵，发酵中由于蛋白酶和肽酶的作用使大豆蛋白水解生 成短肽和游离的氮基酸，这些游离的氨基酸形成了豆腐乳独特的风味【2 】。豆腐乳有 红豆腐乳、青豆腐乳、白豆腐乳、酱豆腐乳、花色豆腐乳等品种。它以其独特的 风味、鲜美的滋味、丰富的营养而深受海内外消费者的喜爱，成为餐桌上一道亮 丽的佐餐食品。 豆腐乳生产历史悠久，可追溯到1 5 0 0 多年前，早在公元5 世纪豆腐乳制作方 法开始有记载，在本草纲目遗拾、蓬栊夜话、食宪鸿秘等古籍里面均有 豆腐乳制作方法的详细记载【3 】。目前，国内许多省份及港澳、台湾、东南亚都有生 产豆腐乳，但各不相同，比如苏州的豆腐乳呈黄白色，口味细腻：北京的豆腐乳， 呈红色，偏甜；而四川的豆腐乳，就比较辣。古今秘苑的四卷中有建宁豆腐乳 的制作方法：“十月将大豆去皮，制成豆腐，压成圆形豆腐。放人竹匾，撒入食盐， 放置一夜，再切成小块，日晒，故入锅中蒸之，再放人竹匾干燥之。用上等酱胞 渍，取出洗净，再干燥之。再加酱油、料酒、胡椒、辣椒，装入坛，密封，放置 数口，味相当好，过几个月更好，且能贮存不坏。” 1 1 1 豆腐乳的营养价值 大豆中的主要成分是蛋白质，其含量为3 6 - 4 0 ，其中水溶性蛋白质含量 为6 8 6 - 8 8 ，而水溶性蛋白质中，球蛋白( 即大豆球蛋白) 占8 4 ，清蛋白( 即 豆清蛋白) 占5 【4 1 。同时大豆中还含有1 8 的脂肪，另外还含有硫胺素、尼克酸、 核黄素、维生素a 等多种维生素及钙、磷、铁矿物质等。大豆的利用形式有发酵 制品和非发酵制品，前者包括豆腐乳、酱油、豆酱、纳豆等；后者包括大豆、豆 腐、豆浆以及大豆粉等。大豆制品因食用方式不同，蛋白质的消化吸收率也不同。 整粒大豆如果加热不足，消化率一般不超过5 0 ，煮得不烂或咀嚼不细，消化率 仅6 5 ，豆浆的吸收率一般为9 0 ，大豆粉的消化率为7 5 ，豆腐、豆腐干的消 化率可达9 4 。而发酵豆制品能在很大程度上提升大豆的营养效价，发酵豆制品 中首推豆腐乳。经微生物发酵后，与豆腐相比豆腐乳中所含的蛋白质和淀粉在多 种酶系作用下发生改变，蛋白质分解成氨基酸和多肽，淀粉转化为单糖和低聚糖， 极易被人体吸收，其生物利用度最大化。近年来大豆的生理活性作用受到越来越 多的重视。大豆的生物活性物质既有天然存在的，如大豆蛋白、异黄酮、大豆磷 豆腐乳发酵功能菌菌系优化的研究 脂或物甾醇、皂苷、植植物凝血素及膳食纤维等，又有来源于发酵豆制品之中， 如大豆多肽、蛋白黑素等。 豆腐中蛋白质含量达1 5 - 2 0 ，与肉类相当，同时含有丰富的钙质。豆腐 乳的原料是豆腐，豆腐“白坯”在微生物的作用下，蛋白质分解成多肽和氨基酸( 尤 其是富含人体不能合成的8 种必需氨基酸) 【5 】。豆腐乳富含水解蛋白质、游离脂肪、 碳水化合物、硫胺素、核黄素、烟酸、钙、磷等营养成分，不含胆固醇；因为微 生物分解了豆类中的植酸，使得大豆中原本吸收率很低的铁、锌等矿物质更容易 被人体吸收。同时，还由于微生物作用，合成了一般植物性食品所没有的维生素 b 1 2 ，素食的人经常吃些豆腐乳，可以预防恶性贫血。 而豆腐乳是我国传统的发酵豆制品，其营养价值由于微生物发酵所含的蛋白 质和淀粉在多种酶系作用下发生了量和质的改变，蛋白质分解成氨基酸和小肽分 子淀粉转化为单糖和低聚糖，而大大得到提升。小分子肽可直接被人体吸收，特 别是2 - - 3 个氨基酸组成的小肽向细胞内传递的速度要比游离氨基酸的速度还快， 其具有降胆固醇作用f 6 1 、降血压作用7 1 、和抗氧化作用【8 1 、此外还可以提高运动员 的肌肉能力【9 1 、提高免疫力【l o 】等作用。如今，豆腐乳在国人日常生活中豆腐乳占有 习惯、认同、诚信、依赖的地位。随之而来的豆腐乳营养价值、工艺特征及其发 展前景也日益引起国内外消费者及食品和医学界的广泛关注。 1 1 2 豆腐乳生产的类型及特点 自古至今，我国豆腐乳生产的类型是依各地环境、条件、生活习性不同而定 的。一般根据豆腐坯是否有微生物繁殖而分为腌制制型和发霉型两大类，发霉型 则又区分为天然接种和纯种培养两种。具体分类如下： ( 1 ) 腌制型 腌制型豆腐乳的特点是，豆腐坯不经过发霉( 长毛) 阶段而直接进人后期发酵。 目前采用这种比较原始豆腐乳生产方法的厂家有：山西省太原市豆腐乳厂。 另外，绍兴豆腐乳少的棋方也是腌制型豆腐乳。它主要是依赖于添加的辅料，如 面糕曲、米酒或黄酒、红曲米等进行生化变化。该工艺所需的厂房设备少，操作 简单。其缺点是：因蛋白酶源不足，发酵周期长，产品不够细腻，氨基酸含量低。 ( 2 ) 发霉型 发霉型豆腐乳是利用有益的菌种，在一定的温度和条件下，在豆腐白坯表面 长满菌丝，同时分泌出大量的酶是豆腐经过培菌和发酵后产品细腻，色、香、味 俱佳。相比于腌制型，发霉型豆腐乳发酵期短，受季节影响小，蛋白酶源充足， 氨基酸含量高【l 。因此，目前国内大部分采用发霉型生产方法。而发霉型生产方 法根据接种方式分为自然发酵和纯种发酵。天然发酵不需添置培菌设备，但是生 产周期长，受季节限制，无法常年生产，且存在诸多安全隐患。随着科技的进步， 西华大学硕士学位论文 我国微生物工作者，致力于豆腐乳上的菌种的分离、纯化培养工作。 依据豆腐坯培菌的菌种不同，还可分为毛霉型、根霉型和细菌型。 ( 1 ) 毛霉型 毛霉型是在前期培菌( 发酵) 过程个，将纯培养毛霉菌袍子所制成的菌悬液和 粉状固体面，喷洒在豆腐坯上，经4 8 - - , 7 2 h 培养后，长满白色毛，菌丝成网状， 形成坚韧的膜，给豆腐乳一个很好的“体”，并只分泌一些蛋白酶分解豆腐中的蛋白 质，以达到良好的品味。 ( 2 ) 根霉型 根霉型是选育一种耐高温根霉曲来生产豆腐乳。在南方，因夏季气温向而不 适应毛霉菌生长。为了全年均能生产豆腐乳，则选育耐高温的根霉菌。日前，南 京、上海一些厂家采用此法生产豆腐乳。根霉作用与毛霉差不多，其优点足能耐 3 7 左右的温度，并生长良好。 ( 3 ) 细菌型 细菌型生产豆腐乳的特点是利用纯细菌接种于豆腐坯上，让其生长繁殖，并 产生大量的酶。操作方法是：将豆腐经4 8 h 腌制，使盐分达6 5 左右，再接人嗜 盐小球菌发酵。因其为细菌发酵，不能赋予豆腐一个好的形体，故在装坛前需加 热烘干水分至4 5 左右，才可以进入下一道工序。该方法生产的产品虽然成形差， 但其口味鲜美，是其他产品所不及的。此法目前只有黑龙江省克东豆腐乳厂采用。 1 1 - 3 豆腐乳生产工艺 豆腐乳酿制是以大豆为原料、经过浸豆、磨浆、滤浆、煮浆、点浆、压榨、。 成型等物理化学变化，再依次完成接种、培菌、腌坯、拌坯、后酵等生物化学变 化。其中以微生物参与的培菌和后酵最为关键。 大豆_ 洗涤_ 加水浸泡一制浆_ 分离浆汁_ 煮浆一点浆一蹲脑_ 成型一发酵 _ 腌坯一拌料_ 装坛_ 贮存_ 成品 现代豆腐乳酿造过程中常常添加酶制可以强化毛霉的酶促反应。在发酵调味 品行业中应用最多、最广的是米曲霉，其产生的孢子多、易繁殖、生长快、活力 高、酶系全，并且制曲不受季节限制。协同毛霉共同发酵，就能强化酶促反应， 克服毛霉夏天培菌难度大、酶活力低、发酵周期长的难题。 酿造豆腐乳包括物理化学过程和生物化学过程。大豆的浸泡、磨浆、煮浆、 点浆，以及压榨成型制成豆腐的工序属于物理化学过程；豆腐前期培茵、腌坯、 拌料后期发酵属于生物化学过程。前期培菌的过程，是菌种在白坯上生长代谢、 分泌酶类，同时生成的菌丝体将坯体包裹成型、蛋白质部分降解成水溶性蛋白质 的过程；后期发酵则是坯体中蛋白质等大分子物质在前期培茵中分泌的酶系与后 期发酵时加入的汤料中的微生物和化学物质的协同参与下降解与酯化成香的过 豆腐乳发酵功能菌菌系优化的研究 程。经过发酵后熟，豆腐乳形成了特有的色、香、味、体，细嫩柔糯、富有营养。 而后发酵过程中参与生化反应的酶类主要是蛋白酶，酶解蛋白质呈氨基酸以及醇、 酯等呈香等风味物质的生成。毛霉的蛋白酶是胞外酶，属于耐中高温型蛋白酶其 最适作用温度为5 0 - 6 0 ，而且具有较好的热稳定性，这对于常规生产中长达6 12 个月的密闭后酵极为有利。呈香物质的生成主要是一些厌气性的芽孢杆菌起作 用，也有酵母菌的协同参与，使代谢产生的各种有机酸和乙醇形成酯，构成产品 特有的香气。 1 2 国内外豆腐乳的研究状况 1 2 1 国内情况 我国豆腐乳的生产历史虽然悠久，但工业化生产发展比较缓慢，长期以来都 处于落后的状态，生产设备简陋，工艺操作繁琐，劳动强度高，环境条件差，生 产率低下。自从解放，豆腐乳生产由小作坊式生产逐步往机械化生产迈进，使这 个中国民族遗产越来越多的受到重视，产品质量、产量、品种、工艺技术和生产 设备不断地进行了更新和改造，同时劳动条件也得到了较大改善，结束了过去那 种小作坊生产豆腐乳的状况。尤其是1 9 7 5 年青岛会议以后，国家为了进一步抓好 豆腐乳生产，提出了豆制品、豆腐乳等产品的质量标准规格和产品检验标准，为 全面提高豆腐乳的产品质量创造了有利的条件。在豆腐乳生产技术方面，改革了 原来传统的豆腐毛坯酿造方法( 即采用稻草附着的毛霉菌生长在豆腐坯表面) ，选择 优良菌种进行纯种培养。采用纯种制成孢子悬浮液或固体菌粉接种到豆腐坯上， 减少了杂茵污染的机会，保证了产品的卫生质量和安全性【1 2 】，也提高了产品的风 味。随着科技的不断进步，我国科技人员又选育出了一些耐高温菌种，这样便结 束了豆腐乳只能依靠季节生产的局面，从而使豆腐乳产量大增，并不断地开发出 适应市场需求的花色品种，豆腐乳生产遍及全国各地。在豆腐乳生产设备方面， 为了能与国际接轨，各企业在设备、厂房、生产环境、人员等方面进行不断地更 新、改造，使我国豆腐乳业基本上步人了工业化和现代化生产的轨道。 目前，国内传统发酵豆制品生产过程中有益与有害微生物共生，使产品具有 独特风味的同时存在着不容忽视的安全隐患。充分发挥优良传统发酵豆制品的优 势，提高其工业化水平，对传统发酵豆制品的微生物进行系统的研究已经成为热 门话题。程昌泽掣1 3 】从贵州各地收集的家庭自制豆腐乳中分离出高产蛋白酶的毛 霉菌株。扩大菌种的选择范围，优选生产菌种，同时根据生产要求对菌种进行改 良或进行多菌种混合发酵，以降低豆腐乳的盐分，提高产品的营养、风味或功能 性。刘会勇等【1 4 】对缩短豆腐乳发酵周期进行了初步探索。由此推断，我国传统发 酵食品进入全世界的餐桌文化已成为必然趋势。 西华大学硕士学位论文 1 2 2 国外情况 国外发酵食品行业已经发展到相当高的水平，纵观发达国家的发酵食品行业， 已彻底告别了自然发酵的历史，基因工程育种、封闭式自动控制发酵、全成分检 测、高效灭菌等先进技术的应用已经相当普遍。加拿大、新加坡等地生产的一种 类似于豆腐乳的产品，其工艺全部实现了标准化和自动化，水溶性蛋白质含量达 1 7 5 9 l o o g 以上，食盐含量仅为4 5 9 l o o g ，保质期在1 8 个月以上5 1 。 1 2 3 与国内外的差距 国内发酵食品行业的技术进步也非常快，包括我省在内，全国酱油、食醋行 业已基本实现了标准化和自动化，技术水平接近国际先进水平，我省泡菜、豆瓣 行业在近一两年内技术上有了飞速的进步。相比之下，豆腐乳仍摆脱不了传统作 坊式的生产模式。 1 3 豆腐乳生产用微生物 目前，我国主要用于发酵豆腐乳的菌种【1 6 。1 7 】有霉菌类，如己分离出的霉菌有 五通桥毛霉、雅稚放射性毛霉、总状毛霉、根霉等；细菌类，如藤黄微球菌、枯 草杆菌和鲁氏酵母等。使用最多的微生物主要为毛霉属，例如：五通桥毛霉、豆 腐乳毛霉、高大毛霉、总状毛霉、雅致放射毛霉、海会寺毛霉、冻土毛霉、布氏 毛霉等。其次是根霉，如江苏地区的溶胶根霉等。而利用细菌发酵的很少只有黑 龙江克东豆腐乳等少数厂家。 现将常用的豆腐乳生产用菌列于表1 【1 8 】。 表1 1 豆腐乳生产用微生物 t a b l e l 2m i c r o o r g a n i s mu s e di ns u f up r o d u c t i o n 微生物豆腐乳产地 五通桥毛霉 豆腐乳毛霉 总状毛霉 雅致放射毛霉 根霉 四川、五通桥 浙江、绍兴、江苏、苏州 台南口用 北京 南京 豆腐乳发酵功能菌菌系优化的研究 表1 2 豆腐乳中分离出的微生物( 不包括生产用菌) t a b l e l 2m i c r o o r g a n i s mi s o l a t e df r o ms u f u 、 微生物豆腐乳产地 紫红曲霉 普雷恩毛霉 黄色毛霉 溶胶根霉 米曲霉 青霉 酵母 芽孢杆菌 枝孢霉 链球菌 棒状杆菌 藤黄小球菌 芽枝霉 粘质沙雷氏菌 裂殖酵母 华根霉 红豆腐生产厂家 台湾口f ， 四川 江苏 江苏四川 江苏 江苏 四川、黑龙江 江苏 江苏 江苏 黑龙江 湖北 浙江 湖北 台湾 1 3 1 毛霉 毛霉是我国豆腐乳生产使用量最大、覆盖面最广的生产菌种，约占豆腐乳菌 种的9 0 9 5 t 1 9 1 。毛霉均为低温毛霉【2 们，具有产蛋白酶的能力【2 1 】【2 2 1 。，广泛分 布于土壤、空气或食品中。用于豆腐乳生产的毛霉有四川的五通桥毛霉、总状毛 霉，浙江绍兴、江苏苏州、镇江等地的豆腐乳毛霉，北京王致和食品厂的雅致发 射毛霉。其中，五通桥毛霉、豆腐乳毛霉、总状毛霉、雅致放射毛霉为我国豆腐 乳培菌最常用的毛霉菌种。以下是对这4 种毛霉的介绍。 五通桥毛霉是我国著名微生物学家方心芳从四川五通桥德昌酱园豆腐乳坯上 分离出来的，菌号a s 3 2 5 。它是目前我国应用最广的优良菌种。其生长温度为1 0 2 5 ，4 勉强可以生长，3 7 不能生长，最适p h 值为5 5 。五通桥毛霉的主要生 理特征：菌丝高1 5 - - 3 0 r a m ，颜色为白色，老后稍黄；孢子梗不分枝，孢子囊呈圆 环、色淡，囊成熟后溶于水，厚垣孢子多【3 1 。 腐乳毛霉是从浙江绍兴等地的豆腐乳中分离得到的。其生长最适温度2 9 ， 最适p h 值为5 5 - 6 2 。主要生理特征：2 0 4 0 生长良好，3 2 - 3 6 时生长受到 西华大学硕士学位论文 抑制，含盐3 时可正常生长，6 时生长受到抑制，不能形成正常菌丝和菌落， 可分泌a 半乳糖苷酶、脂肪酶、葡萄糖淀粉酶、中性蛋白酶等，相同条件下各酶 活性因酶系而异【2 3 1 。 ( 1 ) 主要毛霉类型 总状毛霉是从四川牛华溪等地的豆腐乳中分离得到的，此外台南豆腐乳也是 以总状毛霉为生产菌种的。其最适生长温度为2 3 c ，在4 以下，3 7 以上不能 生长。主要生理特征：菌落质地疏松，高度一般在l c m 以内，颜色为灰色或浅褐 色，具有6 b 、9 a 、1 0 a 羟化能力。 雅致放射毛霉是从北京王致和食品厂的豆腐乳中分离得到的1 2 4 】。菌号 a s 3 2 7 7 8 。其最适生长温度为3 0 ，最适p h 值为5 5 。此外台湾许多豆腐乳也是 以雅致放射毛霉为生长菌种的。主要生理特征：能分泌a - 淀粉酶、 半乳糖酶和脂 肪酶等酶类，茵丝高约1 0 m m ，颜色为白色或浅黄色，在2 5 3 0 ，湿度为9 7 ， 可较好生长并产酶。 ( 2 ) 毛霉在豆腐乳生产中的作用 毛霉可释放出大量的蛋白水解酶及其他有益酶系。它所含a - 淀粉酶能使豆腐 中少量淀粉糖化，蛋白酶、肽酶分解原料中的蛋白质，生成多肽、胨和氨基酸， 赋予豆腐乳特有的营养和风味。由于毛霉分泌的蛋白酶是含有内肽酶和端肽酶的 复合酶，因而水解蛋白质没有苦味。菌丝可在豆腐坯表层均匀覆盖o 1 0 2 c m 的 嫩滑皮膜，赋予豆腐乳良好的外形及独特的柔糯、细腻、润滑的质感，气味纯正 清香。毛霉能分泌儿茶酚氧化酶，催化乳坯中无色的黄酮和异黄酮成为黄色的羟 基化合物，使产品呈现金黄色。此外，豆腐乳还含有大豆异黄酮、大豆多肽、大 豆皂苷和蛋白黑素等生理活性物质，它们具有降胆固醇、降血压、抗氧化性和防 癌的功效。 ( 3 ) 豆腐乳毛霉菌种选育方法 酿造豆腐乳的质量与菌种有着密切关系【2 5 1 ，因此，菌种的选育非常重要。豆 腐乳在前期培菌中主要是依靠微生物的作用，菌丝布满豆腐坯，分泌大量酶系。 微生物不仅关系到豆腐乳的形状、色泽、滋味还关系到豆腐乳的理化性质。因此， 豆腐乳酿造中，就要不断改良现有菌株和选育新菌株。无论哪种菌种，在自然条 件下，由于环境中的物理化学的因素，群体中个有的基因就会发生变异，菌种的 生产能力就会下降。为防止菌种退化，除了控制传代数，还必须对生产的菌种进 行分离、复壮以及育种。 豆腐乳发酵功能菌菌系优化的研究 采样( 菌种的收集、引进) l 增值培养 l 第一次平板分离 j ， 第二次平板分离 l 初筛 上 复筛 l 诱变或原生质体融合 i 离心洗涤 l 震荡打散获得单孢子 l 过滤 l 单孢子悬浮液 、l 诱变 l 分离 l 第一次斜面 上 第二次斜面 上 第三次斜面 l 小型生产试验 l 成品理化分析 l 菌种鉴定 图1 1 豆腐乳毛霉选育工艺流程图 t i g 1 1p r o c e s so fm o c r os e l e c t i o n 1 3 2 根霉 根霉是一种较毛霉耐高温的微生物【2 6 1 ，在豆腐乳生产中广泛采用。例如：南 京豆腐乳即是采用根霉菌种进行发酵的。用于豆腐乳生产的根霉主要有米根霉、 西华大学硕士学位论文 华根霉、无根根霉等。 ( 1 ) 3 z 要根霉类型 米根霉常用于我国酒药和酒曲中。3 7 - - - 4 0 c 能生长，菌落疏松或黏稠，最初 为白色，后变为褐灰色或黑褐色。米根霉所产淀粉酶活力很强，除糖化作用外， 可产生少量反丁烯二酸、乙醇、乳酸和大量的丁烯二酸。 华根霉耐高温，主要生理特征：4 5 还能生长，菌落疏松或稠密，最初为白 色，后变为褐色或黑色。能产生乳酸，对淄族化合物骨架一6 b 和一1 1a 位起羟化作 用。 无根根霉，其适温为2 8 。茵落最初为白色、后为褐色。主要生理特征：2 0 4 0 时生长良好，3 2 3 6 时生长受到抑制，含盐4 生长正常，含盐6 生长异 常，不能形成正常菌丝和菌落。它可产生乳酸和反丁烯二酸以及大量丁烯二酸， 能对淄族化合物骨架一6 b 和1 l a 位起羟化作用。 ( 2 ) 根霉在豆腐乳生产中的作用 根霉与毛霉同属毛霉科，亲缘较近，形态相似，分泌酶系也类似。因此，这 两种微生物在豆腐乳中的作用相似，不同的是，相比于毛霉生长温度偏低、受季 节性限制，现用的些根霉能耐高温、在3 7 的高温下生长良好。 1 3 3 细菌 根据生产用菌可分为微球菌豆腐乳和枯草杆菌豆腐乳。国内豆腐乳生产中很 少使用细菌进行前期培菌，只有黑龙江和武汉的一些豆腐乳采用藤黄微球菌作为 发酵菌种，其中以黑龙江克东豆腐乳最为著名。山东豆腐乳是国内唯一一家采用 藤黄微球菌技术酿造的豆腐乳。其豆腐乳特点是前后酿造两次需要1 8 0 d ，所以味 道醇厚，后味绵长，营养丰富。 ( 1 ) 主要细菌类型 藤黄微球菌属于微球菌科中的微球菌属，g + ，专性好氧菌，最适生长温度为 2 5 - - 2 7 ，嗜中温菌。主要生理特征：能在5 n a c l 生长，但不常在1 0 或1 5 的n a c l 中生长，具有糖酵解和单磷酸己糖途径及柠檬酸循环的酶系及n a d h 苹 果酸，琥珀酸去氧酶，可水解蛋白质、脂肪和多肽【2 7 】。藤黄微球菌在4 5 c 、p h1 0 、 0 0 9 ln a c l 生长或微弱生长，1 5 0 9 mn a c i 不生长，尿素酶试验呈阳性，分解蔗 糖、葡萄糖、甘露糖产酸。 枯草杆菌菌种多使用枯草芽胞杆菌。武汉一些豆腐乳厂家的生产菌种。其最 适生长温度为3 0 ，最适p h 值为6 ，主要生理特征：g + ，生长温度最高达4 5 - - 5 5 c ，最低为5 - - 2 0 c ，可在7 n a c i 中生长，可水解淀粉【2 8 1 。 ( 2 ) 细菌在豆腐乳生产中的作用 细菌在豆腐乳中的作用与毛霉类似，即利用发酵菌种产生的酶类使蛋白质分 豆腐乳发酵功能菌菌系优化的研究 解，淀粉糖化，最终赋予了豆腐乳独特的营养和风味。不同的是细菌产生的茵丝 不像毛霉的菌丝细长可以在豆腐坯表面形成坚韧的菌膜，因此，细菌型豆腐乳成 熟后外形较差，但是由于其氨基酸生成率较高，所以味道鲜美。 除这三大类菌种外，鲁氏酵母等也可以作为豆腐乳发酵菌种。微生物生长所 需要的营养物质 1 3 4 豆腐乳生产中有害微生物 豆腐乳酿造过程中，造成污染的微生物主要是细菌、霉菌、酵母三大类【3 2 1 。 在制浆的过程中，容易滋生乳酸茵【3 3 】、枯草杆菌，这些茵体繁殖可致使豆浆的p h 值下降，出现酸浆。在豆腐坯生产过程中生长的杂菌主要是耐热性细菌例如：乳 酸菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、醋酸菌、变形肥大杆菌等好养和微好氧菌。在培菌 期，常见的微生物污染有嗜温性芽孢杆菌及粘质沙雷氏茵。腌制、装坛、灌汤储 存和运输过程中污染的微生物主要是细菌和酵母，例如：球菌、枯草杆菌、乳酸 菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母、青霉、曲霉等。 1 3 5 我国豆腐乳菌种的研究进展 我国近代豆腐乳研究工作始于2 0 世纪2 0 年代。1 9 2 8 年，魏延寿、祝汝估首 先对生产豆腐乳所用毛霉进行研究。随后，凌世升对广东、浙江、江苏、福建、 云南等省所产名特豆腐乳进行了初步分析。直至1 9 4 2 年，著名微生物学家方心芳 对几种霉菌进行了分离鉴定。他从豆腐乳坯上分离出4 种毛霉即高大毛霉、总 状毛霉、黄色毛霉以及五通桥毛霉其中。五通桥毛霉是他从四川五通桥德昌酱园 豆腐乳坯上分离的新品种，从而为豆腐乳纯种培养前期发酵的科学化、规范化奠 定了基础。此后，国内各大厂家开始陆续分离和使用纯种发酵，使豆腐乳的生产 向科学化的道路迈进。 2 0 世纪8 0 年代以来，广大科研工作者及技术人员将豆腐乳研究重点集中在生 产菌种的分纯、选育及对菌种特性的研究上。上海奉贤鼎丰酿造厂的王瑞芝等人 从各地采集收集菌种，从中筛选，并利用紫外照射诱变获得了一株优良生产菌株 【2 9 1 。此后又研究应用多种菌株发酵毛霉、米曲霉、酵母缩短豆腐乳成熟周期的方 法【3 0 1 。 近年来，赵玉莲、郑学翔【3 l 】等人对豆腐乳生产用的菌种进行了研究，也从各 地的豆腐乳中分离出了一些微生物。此后，豆腐乳生产者和研究者不断深入研究， 逐渐形成了一个日趋成熟的生产理论体系，但仍有许多方面的工作有待开展。近 期。豆腐乳生产的工作和研究人员又选育了耐高温菌种。结束了豆腐乳只能季节 性生产的局面，使豆腐乳产量大增，并不断开发出适应市场需求的花色品种以满足 市场需要。 西华大学硕士学位论文 四川大邑唐场豆腐乳有1 0 0 多年的历史。豆腐乳色泽红褐而有光泽，味鲜可 1 2 1 ，清香回甜，辣味较浓。唐桥豆腐乳生产工艺采用唐场得天独厚的天然“高巷古 井”之泉水，利用祖传秘方，结合现代工艺酿造技术，精制而成的“唐桥