（分析化学专业论文）压电生物传感器在微生物代谢产物检测的应用研究.pdf

硕十学位论文 摘要 压电传感器具有适用对象宽，测定灵敏度高，操作简单方便，可用于实时或 在位检测等优点，其应用涉及到分析化学、生命科学、环境监测等众多领域。本 文充分利用压电传感器的响应特性，并和微生物的新陈代谢特征相结合，拓宽了 压电体声波传感器在环境检测和生命科学中的应用，使信息的提取更加准确容易， 测定更加快速方便。鉴于此开展了以下研究工作： 1 采用一种新的透气膜压电石英晶体q c m 传感器，用于硫化氢阳性菌的检 测。在硫化氢阳性菌代谢过程中呼出的h 2 s 在晶体银电极表面的吸附可引起晶体 的灵敏响应。本实验详细讨论了检测池中水汽、氨气、二氧化碳以及培养基中半 胱氨酸浓度对检测的影响。最后通过对奇异变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、伤寒沙 门氏菌、迟缓爱德华菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌的快速准 确的检出，证明了该方法的可行性。 2 提出用一种新型c 0 2 压电传感器用于结核杆菌的检测。其响应机理是细菌 代谢放出的二氧化碳与b a ( o h ) 2 反应，引起b a ( o h ) 2 溶液电导变化，这种变化 能引起压电晶体频率的响应。实验结果表明，当b a ( o h ) 2 浓度为3 8 m m o l l 时， 灵敏度最高。实验详细比较了以聚四氟乙烯膜和硅橡胶膜两种透气膜的性能以 及它们对检测的影响。最后运用该装置对结核杆菌进行检测，证明了该方法的 可行性。 3 将c 0 2 压电传感器成功应用于结核杆菌的代谢研究。本实验结合丙酮酸、 乳酸、甘油、口酮戊二酸、谷氨酸以及天门冬素各自在生物体内的代谢方式， 对以上物质在结核杆菌呼吸作用的影响进行讨论，得出丙酮酸和谷氨酸能够更 有效地促进结核杆菌的呼吸作用的结论。 关键词：q c m 传感器；硫化氢：硫化氢阳性菌；透气膜；结核杆菌；c 0 2 压电 传感器；碳源；氮源；呼吸作用 压 乜生物传感器在微生物代谢产物检测的应用研究 a b s t r a c t p i e z o e l e c t r i cs e n s o rh a sm a n ya d v a n t a g e s ，s u c ha sb r o a ds e n s i n gs p e c t r u m ，h i g h s e n s i t i v i t y ，e a s yt oo p e r a t e ，r e a l t i m ea n do n - l i n em e a s u r e m e n te t ca n dc a nb ew i d e l y u s e di n m a n ya r e a s ，s u c h a s a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , l i f es c i e n c e ，e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n ge t c i nt h i st h e s i s ，n e wm i c r o b i a ls e n s i n gm e t h o d sw e r ep r e s e n t e db a s eo n t h es p e c i a lr e s p o n s eo fp i e z o e l e c t r i cs e n s o rw h i c hr e l a t e dt os o m ec h a r a c t e r i s t i c so f m i c r o b i a lg r o w t ha n dm e t a b o l i s m t h e s en e wm e t h o d sw e r es i m p l et oo p e r a t ea n d b r o a d e nt h e i ra p p l i c a t i o ni ne n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n ga n dl i f es c i e n c e t h ed e t e c t i o n w a sr a p i da n da c c u r a t e t h em a i nw o r ko ft h i st h e s i sc o u l db es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 an o v e lp i e z o e l e c t r i cq u a r t z c r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c m ) d e v i c ew i t hg a s p e r m e a b l em e m b r a n ei sp r o p o s e df o rd e t e c t i o no fm i c r o o r g a n i s m sp r o d u c i n gn 2 s t h e d e t e c t i o nt h e o r yi sb a s e do nt h ea d s o r p t i o no fh y d r o g e ns u l f i d eo n t ot h es i l v e r e l e c t r o d eo ft h ep i e z o e l e c t r i cc r y s t a ls e n s o ra n dc a u s e dad r a m a t i cd e c r e a s ei nt h e r e s o n a n tf r e q u e n c yo fq c m f a c t o r sa f f e c t i n gd e t e c t i o ns u c ha sh u m i d i t y , a m m o n i a ， c a r b o nd i o x i d ea n dl c y s t e i n eh c ic o n c e n t r a t i o ni nc u l t u r em e d i u mw e r ei n v e s t i g a t e d 只m i r a b i l i s ，s t y p h i ，e t a r d a ，c f r e u n d i i , e c o l i ，pa e r u g i n o s aa n ds a u r e u sw e r e d e t e r m i n e di nt h i sp a p e r ，w h i c hp r o v e dt h ef e a s i b i l i t yo ft h ep r o p o s e dm e t h o d 2 an e wg a sp e r m e a b l em e m b r a n ed e v i c ea s s o c i a t e dw i t hs e r i e sp i e z o e l e c t r i cq u a r t z c r y s t a lw a sd e v e l o p e dt od e t e c tm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sr e s p i r a t i o n t h er e s p o n s e m e c h a n i s mi sb a r i u mh y d r o x i d e ( b a ( o h ) 2 ) r e a c t i n gw i t hc a r b o nd i o x i d e ，w h i c hc a u s e s t h ec h a n g e so fc o n d u c t a n c ei nb a ( o h ) 2s o l u t i o n ，a n dt h e nt h ec h a n g e so fc o n d u c t a n c e c a nb em o n i t o r e db ys p q c t h ee f f e c to fb a ( o h ) 2c o n c e n t r a t i o no ns e n s i t i v i t yw a s d i s c u s s e d t h ei n f l u e n c eo fg a sp e r m e a b l em e m b r a n ep r o p e r t i e so nd e t e c t i o nw a s d i s c u s s e di nd e t a i l t h em e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e c tm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s h 3 7 r aw h i c hg o o dr e s u l tw a so b t a i n e d 3 t h ec a r b o nd i o x i d ep i e z o e l e c t r i cs e n s o rw a sp r o p o s e dt os t u d yt h ee f f e c to f d i f f e r e n tc a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e ns o u r c eo nb a c t e r i am e t a b o l i s m c o m b i n i n gw i t h t h em e t a b o l i cp a t h w a y so fp y r u v i ca c i d ，l a c t i ca c i d ，口k e t o g l u t a r i ca c i d ，g l y c e r o l ， l - a s p a r a g i n ea n dg l u t a m i ca c i di no r g a n i s m s ，t h ef u n c t i o no fd i f f e r e n tn u t r i m e n to nt h e r a t eo fb a c t e r i ab r e a t h i n go u tc 0 2w e r ei n v e s t i g a t e d i tc a m et ot h ec o n c l u s i o nt h a t p y r u v i ca c i da n dg l u t a m i ca c i dc a na c c e l e r a t et h er e s p i r a t i o no fm y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i sm o s te f f e c t i v e l y i i i 硕士学位论文 k e yw o r d s ：q c m ；h y d r o g e ns u l f i d e ；h 2 s - p r o d u c i n gb a c t e r i a ；g a sp e r m e a b l e m e m b r a n e ；m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ；c a r b o nd i o x i d ep i e z o e l e c t r i c q u a r t zc r y s t a ls e n s o r ；c a r b o ns o u r c e ；n i t r o g e ns o u r c e ；r e s p i r a t i o n i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 务、矗 日期：j 一年7 月昱日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：和坩、 导师签名：气曩、司沪 日期：叫砖年7 月譬日 日期：砷喀年) 月譬日 硕十学位论文 第1 章绪论 2 0 世纪8 0 年代以来，随着生命科学与环境科学的迅猛发展，对分析化学提出 了许多亟待解决的新问题。为了适应新情况，解决新问题，需要在多学科交叉的 基础上建立新的分析方法。由于生物体系和环境体系的表征和生物过程的监测的 需要，促进了生物传感技术的发展和应用。以压电石英晶体为信号转换器的压电 化学与生物化学体声波传感技术，与光、电或热等传统传感技术相比，它具有响 应谱广、灵敏度高、结构简单、易实现数字化等独特优点【1 1 。它是利用以压电材料 为基底的体声波器件在厚度剪切模式振荡过程中与周边环境的相互作用，由器件 超高频声波的声电阻抗谱、频谱或相位等参量的变化来对环境介质，包括质量、 粘弹性、导纳、介电或流变特性、离子溶剂传输等物化性能做出相关应答并转换 为响应传感检测信号，从而获取有关目标组分或多元组分体系的成分、性状的一 维或多维信息，以求得到对象的全面、动态、实时或在位描述，用于化学、生命 科学、生物学、药学、临床医学和环境科学等领域的传感检测。今年来，压电化 学与生物体声波传感技术在生物体系和环境体系的分析表征、生物和微生物过程 监测表征等方面，显示出了许多优势。 结合本论文的研究方向，本章就微生物新陈代谢发面的研究进展，微生物的 检测研究和压电传感器的研究进展做一简述。 1 1 微生物的新陈代谢概述 1 1 1 新陈代谢理论 新陈代谢【2 】，简称代谢，广义的代谢是指生命体进行的一切化学反应，是发生 在活细胞中的各种分解代谢与合成代谢的总和。 其中，分解代谢是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单 分子、腺苷三磷酸( a t p ) 形式的能量或还原力( 或称还原当量，以【h 】表示) 的作用。 一般可分为三个阶段：第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解 成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质；第二阶段是将第一阶段的分解产物进一 步降解成更为简单的乙酰辅酶a 、丙酮酸等中间产物，在此阶段还可以产生一些 a t p 、n a d h 及f a d h 2 等；第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产生的乙酰辅 酶a 、丙酮酸等中间产物完全降解生成c 0 2 ，并产生a t p 、n a d h 及f a d h 2 。 合成代谢则与分解代谢相反，是指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、 a t p 形式的能量与【h 1 形式的还原力一起合成大分子的过程，在这个过程中要消耗 压电生物传感器打! 微生物代谢产物枪测的应用研究 能量。合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中产生的中间产物或环 境中的小分子营养物质。 无论是分解代谢还是合成代谢，代谢途径都是由一系列连续的酶促反应构成 的，前一步反应的产物往往是后一步反应的底物。细胞通过各种方式有效地调节 相关的代谢反应，从而保证整个代谢途径的协调性与完整性，使细胞的生命活动 得以正常进行。 1 1 2 微生物代谢特异性研究 各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物 也不同。用细菌生物化学实验方法测定这些代谢产物，可以用于测定细菌，也可 用来区别和鉴定细菌的种类。主要介绍以下几类： ( 1 ) 糖( 醇、苷) 类发酵试验 不同种类细菌含有发酵不同糖( 醇、苷) 类的酶，因而对各种糖( 醇、苷) 类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖( 醇、苷) 类，其代谢产物可因菌 种而异。如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖 和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺 菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气。 ( 2 ) v - p 试验 测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产 生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇 被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。 大肠埃希菌和产气肠杆菌均能分解葡萄糖产酸产气，但产气产杆菌v - p 试验阳性， 而大肠埃细菌v - p 试验则为阴性。 ( 3 ) 硫化氢试验 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫 化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物，间接反映待测细菌是否有促成硫化氢生 成的能力。沙门菌属，枸橼酸杆菌属，变形杆菌属都可以分解含硫氨基酸或含硫 化合物生成硫化氢气体。 ( 4 ) 尿素酶( u r e a s e ) 试验 有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生2 个分子的氨，使培养基变为碱性， 酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成 此酶。其活性最适p h 为7 o 。根据普通变形杆菌在生长过程中产生n h 3 的原 理，t a n 3 巧】等用b 趟肌氨传感器对普通变形杆菌的生长特征进行分析检测及温度对 奇异变形杆菌的影响，推导了其成长的动力学参数和动力学模型。 硕士学位论文 ( 5 ) 苯丙氨酸脱氨酶试验 细菌分解氨基酸，可通过脱氨基或羧基生成反应物，这些反应由酶反应进行。 有些细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸氧化脱氨后生成苯丙酮酸，与三氯 化铁试剂产生深绿色反应。 ( 6 ) 氧化酶( o x i d a s e ) 试验 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶 先使细胞色素c 氧化，然后此氧化型细胞色素c 再对苯二胺氧化，产生颜色反应。 本试验的结果又与细胞色素c 的存在有关。铜绿假单胞菌为阳性，而大肠埃希菌 为阴性。 ( 7 ) 凝固酶试验 凝固酶是金黄色葡萄球菌产生的毒性酶，此酶有两种存在方式，即结合于细 胞壁的凝聚因子，也称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白质，使发生沉 淀，包围于细菌外面凝结成块。另一种为细菌合成释放在液体中的游离凝固酶。 凝固酶试验对检验金黄色葡萄球菌和确定葡萄球菌的致病性都有重要作用。 1 1 3 微生物新陈代谢的应用领域 1 1 3 1 用于生化反应对微生物进行检验 生化方法检测病原微生物实际上是测定微生物特异性酶。由于各种微生物所具 有的酶系统不完全相同，对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物产 生的不同代谢产物来间接检测该微生物内酶的有无，从而达到检测特定微生物的目 的。如沙门氏菌能产生辛酯酶，这一性能是除沙门氏菌外的各属肠杆菌科细菌所不 具备的。根据这一特性，甄宏太等【7 l 报道了快速检测沙门氏菌的辛酯酶法。该方法 是以4 2 甲基伞形酮辛酯( m u c a p ) 为底物，经沙门氏菌的酶降解后，释放出4 m u ，在 紫外灯下观察其发出的蓝色荧光。该方法简便易行，从加入底物到紫外灯下观察到 出结果仅需几分钟即可完成，其灵敏度和特异性分别可达9 5 和9 0 【8 1 。对与 h 2 s ( + ) 反应的沙门氏菌该法更为敏感，灵敏度和特异性均接近1 0 0 【9 1 。大肠埃希 氏菌具b 一葡萄糖醛酸酶，但以0 1 5 7 ：h 7 为代表的肠出血性大肠埃希氏菌( e h e c ) 却不具此酶，故8 一葡萄糖醛酸酶阴性已成为初步筛查e h e c 的重要特征。白色念珠 菌具脯氨酸肽酶及n 一已酰8 一d 半乳糖苷酶，分别以合适的试剂检测，两酶均阳性 即为白色念珠菌。 1 1 3 2 用于微生物传感器 ( 1 ) 原材料及代谢产物的测定 微生物传感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的测定，代谢产物如头孢霉素、 谷氨酸、甲酸、甲烷、醇类、青霉素、乳酸等的测定。测量的原理基本上都是用 压电生物传感器存微生物代谢产物拎测的应用研究 适合的微生物电极与氧电极组成，利用微生物的同化作用耗氧，通过测量氧电极 电流的变化量来测量氧气的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。 ( 2 ) 微生物细胞总数的测定 在发酵控制方面，一直需要直接测定细胞数目的简单而连续的方法。人们发 现在阳极表面，细菌可以直接被氧化并产生电流。这种电化学系统已应用于细胞 数目的测定，其结果与传统的菌斑计数法测细胞数是相同的【1 0 】。 ( 3 ) 代谢试验的鉴定 传统的微生物代谢类型的鉴定都是根据微生物在某种培养基上的生长情况 进行的。这些实验方法需要较长的培养时间和专门的技术。微生物对底物的同化 作用可以通过其呼吸活性进行测定。用氧电极可以直接测量微生物的呼吸活性。 因此，可以用微生物传感器来测定微生物的代谢特征。这个系统已用予微生物的 简单鉴定、微生物培养基的选择、微生物酶活性的测定、废水中可被生物降解的 物质估计、用于废水处理的微生物选择、活性污泥的同化作用试验、生物降解物 的确定、微生物的保存方法选择等【1 1 】。 1 1 3 3 用于环境监测 目前，有研究人员分离了两种新的酵母菌种s p t l 和s p t 2 ，并将其固定在玻 璃碳极上以构成微生物传感器用于测量b o d ，其重复性在- 1 0 以内。将该传感 器用于测量纸浆厂污水中b o d 的测定，其测量最小值可达2m g l ，所用时间为 5 m i n 【1 2 】。将荧光素酶导入大肠杆菌( e c o l i ) 中构成的微生物传感器，可以用来 检测砷的有毒化合物1 1 3 l 。目前，有9 种革兰氏阴性细菌从西西伯利亚石油盆地的 土壤中分离出来，以酚作为唯一的碳源和能源。它对酚的监测极限为5 x 1 0 一m o l 。 该传感器工作的最适条件为：p h = 7 4 、3 5 0 c ，连续工作时间为3 0 h 1 1 4 】。还有一种 假单胞菌属( p s e u d o m o n a sr a t h o n i s ) 制成的测量表面活性剂浓度的电流型生物传 感器，该传感器能在测量结束后很快地恢复敏感元件的活性i ”l 。还有一种专门测 量铜离子的电流型微生物传感器。该生物传感器可以在浓度范围( o 5 2 ) x 1 0 。3 m o l 范围内测定c u s 0 4 溶液。目前已经将各类金属离子诱导启动子转入大肠杆菌中， 使得大肠杆菌会在含有各种金属离子的的溶液中出现发光反应。根据它发光的强 度可以测定重金属离子的浓度，其测量范围可以从纳摩尔到微摩尔，所需时间为 6 0 l o o m i n l l 6 07 1 。用于测量污水中锌浓度的生物传感器也已经研制成功，其结果 令人满意1 1 8 l 。估测河口出水流污染情况的海藻传感器对三种主要污染物( 重金属、 除草剂、氨基甲酸盐杀虫剂) 的不同浓度进行了测定，均可监测到它们的有毒反 应，重复性和再生性都很高1 1 9 】。有一种应用p c r 技术的d n a 压电生物传感器， 可以测定种特殊的细菌毒素。这种压电生物传感器可以鉴别样品中是否含有气 单胞菌属的特殊基因片段，从而为从水样中检测是否含带有这种病原的各种气单 硕上学位论文 胞菌提供了可能【2 0 1 。还有一种通道生物传感器可以检测浮游植物和水母等生物体 产生的腰鞭毛虫神经毒素等毒性物质，目前已经能够测量在一个浮游生物细胞内 含有的极微量的p s p 毒素【2 1 1 。一种固定有表面细胞质粒基因组的生物传感器已 经制得，用于测量水中微藻素的含量，它直接的测量范围是( 5 0 1 0 0 0 ) x 1 0 。6 9 l t 2 2 j 。 一种基于酶的抑制性分析的多重生物传感器用于测量毒性物质的设想也已经提 出。其性能已经得到测试，效果较好1 2 引。 1 2 新型微生物测定方法 人们的生活离不开微生物，在工业、农业、医学、药学等领域，微生物已获 得了广泛的应用。不仅如此，微生物在人类科学发展史上，特别是在生命科学的 发展上作出了巨大的贡献。因此，发展快速而简单的微生物分析测定方法是十分 有意义的。广大的微生物学家、物理学家、化学家及其它学科的科学家们充分利 用微生物的光学、电化学，生物化学和物理性质，提出了一系列新型微生物快速 测定技术。 1 2 1 细胞成分分析法 微生物的某些特定细胞成分的含量是相对稳定的，因此可以通过测定这些成 分来进行微生物的测定。 1 2 1 1 质粒指纹图谱法( p l a s m i df i n g e r p r i n t i n g ) 该法是用于质粒分析的间接分子生物学技术。包括用琼脂糖凝胶电泳监测细 菌的质粒特性和采用限制性内切酶对质粒d n a 作同源性分析。该技术能对社会感 染的细菌进行监测和传染源的追踪。国内外许多学者都用质粒d n a 分析方法来进 行细菌性感染的流行病学调查和对耐药性细菌的监测。 1 2 1 2 核酸探针( n u c l e a ra c i dp r o b e ) 核酸探针对人体与动物体中致病菌的成功检测，使原来难以人工培养繁殖的 细菌、病毒的检测成为可能。它显著优点是特异性强，缺点是检测临床标本的敏 感性低，一般标本中含l x l 0 4 c e l l s m l 细菌才能进行杂交阳性反应。特异性强的d n a 探针与敏感性高的p c r 技术相结合已成为研究与临床的一种良好途径【2 4 1 。 1 2 1 3 聚合酶联式反应( p c r ) 技术 p c r 技术最早于1 9 8 5 年由美国人类基因学会( a s h g ) 年会在d n a 片段扩增工作 的研究中得以描述，由此开始在各个相关领域得到了迅速而广泛的研究，现已成为 一个世界性的前沿课题。最先利用p c r 技术扩增而出的d n a 序列是人的b 一球蛋白 基因【2 5 1 ，并在1 9 8 7 年6 月首次临床应用。该技术可用于生长缓慢或难以培养的病原 乐电乍物传感器存微乍物代澍产物榆测的应用研究 体的鉴定，其中最成功的是结核杆菌的鉴定【2 6 1 。也可以用于难以鉴定的病原体的 诊断。一般是指发酵革兰氏阴性杆菌和厌氧菌。n i e d e r h a u s e r 等【2 7 】利用p c r 技术检 测了食品中的单核细胞增生李斯特氏菌伍m o m o c y t o g e n e s ) ，只需几个小时的时间 即可完成对该菌的检测。此方法十分灵敏，可测定低至1 0c e l l s m l 的微生物。实验 证明，p c r 具有灵敏度高、特异性强、快速等特点。但在临床中存在许多亟待解 决的问题。p c r 检测的假阳性和假阴性是影响其应用的关键问题，主要是引物的 特异性不高、电泳结果判断有误、标本中存在抑制因子、标本i j 处理与d n a 提取 方法等有关，另外还与试剂质量、操作方法不当有关【2 引。另夕 f d n a 的检测并不意 味着必须使用活细胞，从理论上讲任何可以提供核酸物质的样品都可以进行p c r 扩 增，这就是说p c r 技术不能区分活细胞和死细胞【2 9 1 。各种衍生技术如反转录p c r ( r t p c r ) 、多重p c r 3 0 1 、巢式p c r i 3 1 1 、p c r 单链构象多态性( p c r s s c p ) 、 r f l p 、r a p d 技术、荧光定量p c r 3 2 l 等。其中定量p c r 既可以用于临床感染 性疾病的诊断，又可用于监测其疗效。而d n a 测序分析可用于病原菌的鉴定和亚 型的区分，以及同种病原菌不同菌株的区分。 免疫p c r ( i m m u n op o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，i mp c r ) 是1 9 9 2 年s a n o 等【3 3 】建 立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚 合酶链反应的高敏感性有机结合起来，它的基本原理是用一段已知d n a 分子标记 抗体作为探针，用此探针与待测抗原反应，p c r 扩增粘附在抗原抗体复合物上的 这段d n a 分子，电泳定性，根据特异性p c r 产物的有无，来判断待测抗原是否存 在。目前，国内外报道的免疫p c r 的敏感性一般比现行的e l i s a 法高1 0 2 1 0 5 倍【3 4 1 。 由于p c r 产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比，因此免疫 p c r 还可用于抗原的半定量试验。 1 2 1 4 脂及衍生物法 磷脂是所有活细胞原生质膜中的主要成分。在细菌的自然群落中，磷酸脂在 细菌的生物量中的比例是相对恒定的【3 5 l ，所以通过测定磷酸脂及其衍生物可以指 示活细胞的生物量。 1 2 1 5 代谢酶法 所有大肠菌含有特异的代谢酶d 半乳糖苷酶。在自然条件下可以水解吡喃半 乳糖底物，水解的产物可被细菌继续利用于生长。实验中采用标记营养物质o n p g ( 邻硝基苯b d 吡喃半乳糖) 和m u g ( 4 甲基伞形b - d 葡糖苷酸) ，样品中的大肠菌 分解相应的标记营养物o n f g ，打开o n p g 的营养部分吡喃半乳糖和指示剂部分 邻硝基苯之间的结合键，其中营养部分被菌吸收用于生长，游离的指示剂呈黄色 ( 结合态无色) 。这种方法灵敏度高可测至l x l 0 乏c f u m l 的细菌。 硕十学位论文 1 2 1 6 细胞壁组分测定法 细菌细胞壁的肽葡聚糖含有其它有机体不存在的几种组分，因此可作为细菌 生物量的指示。革兰氏阳性茵生物膜的测定可以通过磷酸脂被浓氢氟酸的选择性 水解，分析胞壁酸来完成【3 6 1 。革兰氏阴性菌则可以通过测定脂多糖( l p s ) 组分来测 定。 1 2 2 生物电化学方法 生物电化学方法是指通过电极测定生物量产生或消耗的电荷，从而提供分析 信号的方法。基于微生物生长过程中培养基的电化学性质的改变，许多新的生物 电化学方法被提出用于微生物的测定。 1 2 2 1 阻抗及电导分析法 这种方法是最早应用于细菌测定的电化学技术之一。随着细菌的生长代谢， 培养基的导电性升高，阻抗下降，用电极测定流经培养基的交流阻抗，可以实现 对细菌生长的连续监测。此外，通过阻抗一时间曲线与校正曲线的比较可以估计 细菌的存在数目。 1 2 2 2 电流分析法 电流分析法是在控制恒电位的情况下，通过测定工作电极上的电流来测定微 生物的生物量的方法。c a s m i r i 等f 3 7 】构建了l 一乳酸氧化酶和l 一乳酸脱氢酶电流 型传感器，并用于大肠杆菌生长培养基中的l 一乳酸盐的测定，l 一乳酸盐的量被 用作细胞数目的指标。 1 2 2 3 电位分析法 微生物在生长代谢过程中，0 2 的消耗、c 0 2 的产生和对电活性物质的氧化等 现象能够引起电极( 如氧电极、c 0 2 电极和p h 电极等) 电位的改变。本法具有简便、 快速和灵敏等特点，但不适用于实时分析。 1 2 2 4 循环伏安法及方波极谱法 循环伏安法可用于测定酵母和细菌，并可用于区分革兰氏阳性和阴性菌，h a n 等【3 8 l 用四环素修饰玻碳电极构建的生物传感器，采用伏安法测定了1 6 个食品和环 境中的微生物群落，检测限为2 - - 5 x 1 0 4 c e l l s ，测定一个样品仅需3 0 m i n 。方波极 谱法利用膜染料测定微生物【3 9 1 ，通过研究固定于电极表面的染料与细菌发生反应 前后的电化学性质，根据阴极峰电流对菌细胞浓度进行直接测定。 压电乍物传感器在微生物代谢产物柃测的残用研究 1 2 3 非生物电化学方法 1 2 3 1 微量量热法 微生物在生长和代谢过程中能产生大量的代谢热，而且代谢热与微生物生长 代谢速率有一定相关性，因此可通过记录微生物的生长热谱来对其生长过程进行 在线监测【4 0 1 。 1 2 3 2 粘度法 细菌生长过程中培养液的流变学性质能够很好的指示微生物培养的情况。 r a p p 4 1 】对c e l l u l o m o n a su d a 在碎报纸上生长时的粘度变化进行了在线监测。 1 2 3 3 表面荧光过滤技术 这类方法中最成功的是直接表面荧光过滤技术( d e f t ) 。在这种方法中，首先 用胰蛋白酶和洗涤剂( t r i t o nx 1 0 0 ) 对细菌样品进行预处理，用聚碳酸酯膜过滤后， 加入荧光色素( 吖啶橙或二脒基一2 一吲哚) 进行着色，然后再用膜滤集，将膜清洗 后，用表面荧光显微镜对微生物计数。通过计算滤膜上橙色到橙黄色细胞数目柬 测定活细胞数目。现在已有自动化仪器用于对食品和水样中细菌的测定，但仍存 在微粒状物质的干扰及需较长时间的预培养等问题。 1 2 3 4 生物发光法 生物发光法普遍用于食品分析中细菌三磷酸腺苷( a t p ) 的测定。方法的原理是 基于对荧光素酶催化下a t p 和荧光素反应的测定，反应产生的光子量或发光强度 与存在于样品中的初始a t p 量成正比【4 2 1 。此外，光子量可被转化为每毫升菌液的 细胞数，其测定可低到1 0 3 1 0 4 c e l l s m l 。 1 2 3 5 反射测量法( r m ) 其工作原理是根据细菌在生长繁殖过程中可利用培养基中加有1 4 c 标记的碳 水化合物或盐类的底物代谢产生“c 0 2 ，然后通过闪烁计数器等测量1 4 c 0 2 含量的 增加与否，来确定标本中有无细菌的存在。r m 已在临床分析、供水监测、药物及 食品工业、生态学研究中广泛用于对微生物进行早期测定。此方法非常灵敏，但 不适于在线监测。1 9 7 5 年，m o r e l l o 提出了一个菌血症r m 的“试验方案”，具有一 定的参考意义。f r a n k 进行了菌尿症的快速诊断，r o w l e y 等用r m 检查熟食品中 的细菌含量。 1 2 3 6 拉曼光谱法 傅立叶变换拉曼光谱和紫外共振拉曼光谱已经用于微生物悬液和干膜的测 定，测定的细胞数可低至1 5 0c e l l s m l i 4 3 1 。m a q u e l i n 等1 4 4 】采用近红外多通道同拉 硕士学位论文 曼光谱技术测定了生长在固体培养基上的临床微生物。 1 2 3 7 气相色谱法( g c ) 此法以微生物自身的化学组成以及其代谢或分解产物作为诊断依据。m i t r u k a 等利用g c 分析了各种细菌性感染动物的血清标本，从而提出了利用g c 作传染病 快速诊断的建议。继之，b r o o k s 等【4 5 4 6 】采用此法研究了尿道感染病人的尿液和关 节炎病人的滑液内细菌代谢产物的存在，由此可对淋球菌、葡萄球菌和链球菌所 引起的关节炎进行鉴别诊断。 1 2 3 8 质谱法 质谱法将是今后应用较广泛的测定方法1 4 7 1 。现在已经有将色谱分离技术与质 谱分析联用测定细菌细胞壁的报道【4 8 1 。 1 2 3 9 压电膜测定法 这种方法是使超声波通过微生物悬浮液，在压电膜表面测定产生信号的强度。 微生物引起的信号衰减与微生物的浓度有相关关系。这种方法适于实时分析，但 压电膜寿命不长，且不能区分活菌与死菌。此外，用于微生物测量的非生物电化 学方法还有电微粒分析法、声谐振密度计法【4 9 l 和电镜法【5 0 】等。 1 2 4 微生物的临床诊断技术及现状。 据美国国家医院感染检测系统统计，近2 0 年来，血液感染发生率明显增加， 目前血液感染已由7 0 年代占医院感染的6 上升至1 3 。各种条件致病菌所致菌 血症、败血症等有增多趋势。其中败血症是严重的全身性感染，病情复杂，进展 迅速，死亡率高，因菌种不同在3 0 5 7 之间。快速检测和鉴定血液中的微生物对 降低死亡率是十分中欧更要的，传统的手工培养检测方法，阳性率低，且培养周 期长，易污染，已经难于满足需要。随着科技的发展，血培养采用计算机全程自 动监测，缩短了检测时间，提高了阳性率。下面对微生物自动检测仪在临床应用 方面做一下总结。 微生物自动培养系统是提高病原检测率、缩短检测时间的重要手段。微生物 培养经历了手工、半手工、全自动等方法，目前已发展成为第三代全自动培养系 统，如美国b d 公司的b a c t e c9 0 0 0 系列、法国生物梅里埃公司的b a c t a l e r t3 d 系统、美国d i f c o 公司研制的e s p 系列等。全自动培养系统具有操作简便、快速 准确、非介入连续监测等优点。快速培养系统对于提高血液、无菌体液等标本细 菌性感染的快速诊断，指导临床合理使用抗生素、及时治疗与有效控制感染至关 重要。 压电生物传感器存微生物代谢产物拎测的臆用研究 1 3 压电生物传感器的研究进展 1 3 1 压电气相传感理论及其应用 早在1 9 5 9 年德国物理学家s a u e r b r e y l 5 1 】从适应晶体剪切驻波波长与晶片厚度 的关系出发，导出了晶片上附加物质质量( 胁) 与厚度剪切压电石英晶体频移 ( ) 的关系： 哟 硫硫 f n m p q t q a 式中厂0 、a 、m 、如和t q 分别为石英晶体的基频、电极面积、质量、密度和厚度。 1 9 7 7 年g u i b a u l t t 5 2 】在此式的基础上，导出了仅适用于a t 切型石英晶体的响应 公式： 埘i 一2 2 6 x 1 0 趣l j 6 - n a 式中的厶厂及兀单位为h z ，a m 及a 单位分别为k g 及m 2 。 石英晶体应用于分析化学领域始于k i n g l 5 3 】的工作，1 9 6 4 年他将石英晶体用于 气相色谱系统中烃的测定。此后近2 0 年，石英晶体作为灵敏的石英晶体微天平广 泛应用于气相测定：如真空镀膜厚度的在线监测【5 4 55 1 ，大气与环境污染物的监测 s 6 - s 8 l 等。随后气相测定向有机化合物和生物成分修饰p q c 发展，1 9 8 3 年g u i b a u l t l 5 9 l 首次将生物大分子修饰p q c 用于气相测定，他将酶修饰于p q c 表面测定了甲醛。 n g e h n g w a i n b i1 6 0 】等提出了基于对硫磷抗体修饰的气相免疫传感器。w u 6 1 】等将嗅 觉受体蛋白修饰于p q c 表面，通过测定液上气体而对高粱酒进行质量检测。到现 在为止，压电气相传感已经渗透到各种研究领域中去，并起到了重要的作用。 1 3 2 压电液相传感理论及其应用 自压电石英晶体在气相中成功应用以后，长期以来学术界认为由于液相中存 在过大的能量损耗故晶体不能在液相中稳定振荡【6 2 l ，因此它一直仅应用于气相中。 在2 0 世纪8 0 年代，压电石英晶体在液相中的成功应用f 6 3 “4 1 ，为其开拓了更加广 阔的应用领域。研究表明，压电晶体除了有灵敏的质量效应以外，还存在有更多 的非质量效应，如粘度、密度、应力、粘弹性、电导率、介电常数、表面形状等 介质或界面效应f 6 5 】。从此压电石英晶体的应用进入液相振荡时代。 p q c 传感器响应信号的测定方法可归纳为主动法和被动法【6 6 6 7 1 。主动法常被 称为振荡器法。该法中压电晶体作为振荡电路的一部分，连接在振荡器方法电路 的输入端和输出端之间，通过引入正反馈电路产生自激振荡，用频率计数器可测 定此时的振荡频率。这种方法常用的是t t l 振荡电路【6 6 6 引，测定的是石英晶体的 零相移频率。与主动法对应的是被动法，常被称为阻抗网络法【6 6 t 讯6 9 】。在阻抗网 络法中，压电晶体作为外部元件连接在电学测量仪器( 阻抗分析仪) 的测量端， 硕十学位论文 阻抗分析仪测定的是加在晶体上的电压与流过晶体的电流之比值极为阻抗，它与 能量损耗有关。网络技术可给出全面表征传感器响应的多个参数。这些参数可分 为三类：石英晶体等效电路的元件参数( 包括动态电阻、动态电容、动态电感和 静态电容) ，石英晶体的各种特征频率( 包括最大、最小阻抗频率和串、并联谐振 频率) 和相移。其中，石英晶体等效电路的元件参数均有各自的物理意义：动态 电阻代表能量损耗，与本体粘度和密度有关；动态电感表征晶体表面的粘弹性； 静态电容与介电性质有关。因此，采用网络分析技术可获得液相中p q c 声波传感 器的多维化学信息。 借助于阻抗网络分析法，1 9 9 5 年s c h n e i d e r 和m a r t i n l 7 0 j 建立了压电声波传感模 型，导出了频移与电感的关系式。基于牛顿流体的n a v i e r s t o k e s 方程和阻尼波传 播波动方程，t h o m o p s o n l 6 6 7 1 l 等研究了界面边界条件、液体粘度和密度对频率响 应的影响，建立了四层结构界面理论【7 2 1 ，还研究了晶体在溶液中的振荡行为【7 3 1 。 s h a n a 7 4 l 等讨论了在液相中p q c 的声电效应( a c o u s t o e l e c t r i ce f f e c t ) 。1 9 9 1 年前后， n o m u r a i 7 5 l 和z h o u 7 6 】分别独立地开发出一种新型的电极脱开式压电传感器 ( s e p c ) 。s e p c 是在p q c 的一侧置一块平行电极作为p q c 的激励电极，被测液 体置于该电极和压电石英晶体之间。s e p c 不仅保留了经典的液触式p q c 对质量、 粘度和密度响应，而且还具有更灵敏的阻抗响应特性。z h o u 还推导出频移公式i _ 7 6 j ， 讨论了等效电路参数【7 7 7 引，溶液性质和温度对频率响应的影响【7 9 0 1 。1 9 9 3 年 s h e n l 8 1 l 又进一步开发出串联式压电传感器( s p q c ) 。s p q c 由p q c 串联一个电导 电极组成，p q