（食品科学专业论文）鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的分离纯化及性质研究.pdf

学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：哥切钎 时间k 刁年占冈d 目i 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作者( 签名) ： 导师( 签名) ： 时间：洲屏 杨f 遂、 i 鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的 分离纯化及性质研究 摘要 胰蛋白酶( t r y p s i n ，e c3 4 2 1 4 ) 和胰凝乳蛋白酶( c h y m o t r y p s i n ，e c3 4 2 1 1 ) 是丝 氨酸蛋白酶家族中的主要水解酶，也是肽链内切酶。胰蛋白酶专一裂解碱性氨基酸残基 ( l y s ，a r g ) 羧基侧链的肽键；而胰凝乳蛋白酶则专一水解p h e 、t r p 和t y r 等疏水氨基酸 残基羧基侧链的肽键。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶不但在鱼体内起着重要的生理功能，而且 在低温下具有较高的酶活性，是具有潜在重要应用价值的工具酶。目前，国内外关于鱼类 胰蛋白酶的研究较多，但对胰凝乳蛋白酶的研究却很少。本课题首次以淡水鲫鱼为研究对 象，对其肝胰脏中胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶进行了分离纯化，研究其酶学性质，并制备了 抗胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶多克隆抗体，为今后研究淡水鱼胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的生 理功能以及这类酶在生物、医药以及食品加工中的应用提供了理论基础。 本课题分离纯化胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的方法包括硫酸铵分级盐析、 d e a e s e p h a r o s e 阴离子交换层析、s e p h a c r y ls 2 0 0 凝胶过滤层析、s p s e p h a r o s e 阳离子交 换层析和p h e n y l s e p h a r o s e 疏水层析等。本研究得到了两种类型的胰凝乳蛋白酶( 阴离子 型胰凝乳蛋白酶c h y m o t r y p s i n a 和阳离子型胰凝乳蛋白酶c h y m o t r y p s i nb ) 和一种阴离子 型胰蛋白酶。 s d s p a g e 和n a t i v e - p a g e 结果表明c h y m o t r y p s i na 、c h y m o t r y p s i nb 和t r y p s i n 都得 到了高度纯化。s d s p a g e 显示c h y m o t r y p s i na 、c h y m o t r y p s i nb 和t r y p s i n 的分子量分别 为2 8k d a 、2 7k d a 和2 1k d a 。以s u c l e u l e u v a l - t y r - m c a 为底物，c h y m o t r y p s i na 、 c h y m o t r y p s i nb 的最适温度分别为4 0 0 c 和5 0o c ，最适p h 值分别为p h7 5 和p h8 5 ；当 水解底物b o c p h e s c r - a r g - m c a 时，t r y p s i n 的最适温度和最适p h 值分别是3 5 0 c 和p h8 5 。 c h y m o t r y p s i na 、c h y m o t r y p s i nb 和t r y p s i n 在4 0 。c 以下稳定性较好，p h 值的耐受范围 为5 5 至1 1 0 。丝氨酸类蛋白酶抑制剂对c h y m o t r y p s i n a 、c h y m o t r y p s i nb 和t r y p s i n 产生 强烈抑制，并且两种酶的抑制效果相似。t r y p s i n 底物特异性实验表明，该酶对荧光底物 b o c g l n - a r g a r g m c a 的分解能力最强。c h y m o t r y p s i na 、c h y m o t r y p s i nb 和t r y p s i n 可被 c e + 和m 矿离子激活，而被f e 2 + 、z n 2 + 、m n 2 + 、c u ：+ 、b a 2 + 和c d 2 + 离子在一定程度上抑 制。动力学实验表明，以s u c l e u - l e u - v a l - t y r - m c a 为底物，c h y m o t r y p s i n a 、c h y m o t r y p s i n b 的值分别为1 4 和o 5p m o l l ，所对应的值分别为2 7 和3 4s 1 ；而t r y p s i n 的 值和值分别为0 8t t m o l l 和2 0 3 5s 。免疫印迹实验表明，c h y m o t r y p s i na 和 c h y m o t r y p s i nb 可以与抗鲫鱼c h y m o t r y p s i nb 抗体呈阳性反应；t r y p s i n 可与抗鲤鱼t r y p s i n 抗体呈阳性反应。 关键词：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，鲫鱼，纯化，免疫印迹，同源性，性质研究 p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft r y p s i na n d c h y m o t r y p s i n sf r o mh e p a t o p a n c r e a so fc r u c i a nc a r p ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) a b s t r a c t t r y p s i n ( e c3 4 21 4 ) a n dc h y m o t r y p s i n ( e c3 4 21 1 ) a r ee n d o p e p t i d a s e sa n da r et w o m e m b e r so ft h el a r g ef a m i l yo fs e f i n ep r o t e i n a s e s t r y p s i ns p e c i f i c a l l yh y d r o l y z e sp r o t e i n sa n d p e p t i d e sa tt h ec a r b o x y ls i d eo fa r g i n i n ea n dl y s i n er e s i d u e s c h y m o t r y p s i nc l e a v e so nt h e c a r b o x y ls i d eo fp h e n y l a l a n i n e ，t y r o s i n ea n dt r y p t o p h a nr e s i d u e s t r y p s i na n dc h y m o t r y p s i na r e n o to n l yp l a yi m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a la n dd i g e s t i v ef u n c t i o n si nf i s hb o d y , b u ta l s op l a yac r i t i c a l r o l ei np r o t e i nd i g e s t i o nf o rf o o dp r o c e s s i n g a sf i s he n z y m e st h a th a v eh i g ha c i t i v ya tl o w t e m p e r a t u r e s ，t r y p s i na n de h y m o t r y p s i nh a v ea l s ob e e nu s e di nf o o dp r o c e s s i n gi n d u s t r y h o w e v e r , t i l ln o w ，i n f o r m a t i o na b o u tf i s hc h y m o t r y p s i n sa n dt r y p s i n sf r o m 舶s hw a t e rf i s ha r e l e s sa v a i l a b l e i no r d e rt o s t u d yt h ep h y s i o l o g i c a la n dd i g e s t i v ef u n c t i o n so ft r y p s i n sa n d c h y m o t r y p s i n sf r o m 丘e s hw a t e rf i s ha n dp r o v i d et h eb a s i ci n f o r m a t i o nf o ra p p l i c a t i o ni nf o o d p r o c e s s i n g , w es t u d i e dt h ep u r i f i c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o na n dp r e p a r a t i o no fp o l y c l o n a la n t i b o d i e s a g a i n s tc h y m o t r y p s i nba n dt r y p s i nf r o mt h eh p a t o p a n c r e a so fc r u c i a nc a r p ，a ni m p o r t a n tf r e s h w a t e rf i s hi nc h i n a a na n i o n i cf o r m ( c h y m o t r y p s i na ) a n dac a t i o n i cf o r m ( c h y m o t r y p s i nb ) o f c h y m o t r y p s i n s a n da na n i o n i cf o r mt r y p s i nf r o mt h eh e p a t o p a n c r e a so fc r u c i a nc a r p ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) w e r e p u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yb yas e r i e so fp r o c e d u r e si n c l u d i n ga m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n , c o l u m nc h r o m a t o g r a p h i e so nd e a e s e p h a r o s e ，s e p h a c r y ls - 2 0 0h 凡p h e n y l s e p h a r o s eo r s p s e p h a r o s e p u r i f i e dc h y m o t r y p s i n sa n dt r y p s i nr e v e a l e ds i n g l eb a n d so nn a t i v e - p a g ea n ds d s p a g e t h em o l e c u l a rw e i g h t so fc h y m o t r y p s i na ，c h y m o t r y p s i nba n dt r y p s i nw e r e2 8k d a , 2 7k d a a n d21 k d a , r e s p e c t i v e l yo ns d s - p a g eb o t hu n d e rr e d u c i n ga n dn o n - r e d u c i n gc o n d i t i o n s c h y m o t r y p s i na a n dc h y m o t r y p s i nbe x h i b i t e dm a x i m a la c t i v i t ya t4 0 0 ca n d5 0o c ，r e s p e c t i v e l y ， a n do p t i m a lp h sw e r e7 5a n d8 0u s i n gs u e - l e t 一l e t v a l - t y r - m c aa ss u b s t r a t e h o w e v e r , t r y p s i nr e s p e c t i v e l yr e v e a l e dm a x i m a la c t i v i t ya t3 5 0 ca n dp h8 5 ，u s i n gb o c p h e s e r - a r g - m c aa ss u b s t r a t e 1 1 1 et w oc h y m o t r y p s i n sa n dt r y p s i nw e r es t a b l eu pt o4 0 0 ca n di nt h ep h r a n g ef r o m5 5t o11 0 s e r i n ep r o t e i n a s e si n h i b i t o r sa r ee f f e c t i v et oc h y m o t r y p s i n sa n dt r y p s i n a n dt h e i rs u s c e p t i b i l i t i e sw e r es i m i l a r c h y m o t r y p s i na ，c h y m o t r y p s i nba n dt r y p s i n sw e r e a c t i v a t e db ym e t a li o n ss u c ha sc a 2 + a n dm g + b u ti n a c t i v a t e db yf e 2 + ，z n 2 + ，m n 2 + ，c u 2 + a n dc d 2 + t od i f f e r e n td e g r e e s a p p a r e n t so f c h y m o t r y p s i na a n dbw e r e1 4a n d0 5l m a o l la n d 墨砒s n o ft h et w oe n z y m e sw e r e2 7a n d3 4 s u s i n gs u c - l e u - l e u - v a l t y r - m c a 嬲s u b s t r a t c ， r e s p e c t i v e l y a p p a r e n t a n d o ft r y p s i nw e r e0 8l a m o f la n d2 0 3 5s - 1 ，r e s p e c t i v e l yu s i n g b o c - p h e s e r - a r g - m c aa ss u b s t r a t e i m m u n o b l o t t i n ga n a l y s i su s i n ga n t i c h y m o t r y p s i nbw e a k l y c r o s sr e a c t e dw i 也c h y m o t r y p s i n 八s u g g e s t i n gt 1 1 e i rh o m o g e n e i t y i m m u n o b l o t t i n ga n a l y s i s u s i n ga n t i - c o m m o nc a r pt r y p s i nac r o s sr e a c t e dw i mt h ep u r i f i e dt r y p s i n , s u g g e s t i n gc o m m o n c a r pt r y p s i na i sh o m o g e n o u st oc r u c i a ne a r pt r y p s i n k e y w o r d s ：t r y p s i n , c h y m o t r y p s i n , c r u c i a nc a r p ，p u r i f i c a t i o n ，i m m u n o b l o t t i n g ，h o m o l o g y ， c h a r a e t e r i z a t i o n 1 1 1 目 录 第一章引言1 1 1 鲫鱼简介：1 1 2 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶研究现状2 1 2 1 胰凝乳蛋白酶( 原) 和胰凝乳蛋白酶2 1 2 2 胰凝乳蛋白酶分离纯化3 1 2 3 胰蛋白酶( 原) 和胰蛋白酶4 1 2 4 胰蛋白酶分离纯化5 1 3 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶应用的研究6 1 4 本课题研究的内容与意义7 第二章材料与方法8 2 1 材料8 2 1 1 实验用鱼8 2 1 2 试剂8 2 1 3 实验所用溶液及其制备8 2 1 4 实验所用仪器10 2 2 方：法1 1 2 2 1 蛋白酶活性的测定1 1 2 2 2 蛋白酶浓度的测定1 l 2 2 3s d s p a g e 、n a t i v e p a g e 及g e l a t i nz y m o g r a p h y 1 2 2 2 4 提取纯化方案一1 4 2 2 5 性质分析17 第三章结果与讨论：2 0 3 1 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的纯化及性质研究2 0 3 1 1 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的纯化2 0 1 硫酸铵分级范围确定2 0 2 胰凝乳蛋白酶的柱层析分离2 1 3 1 2 胰凝乳蛋白酶的性质研究一2 5 1 电泳和酶谱分析2 5 2 抑制剂对胰凝乳蛋白酶的作用2 7 3 金属离子对胰蛋白酶活性的影响2 8 4 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的温度范围和温度稳定性2 9 5 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的p h 范围和p h 稳定性一3 0 6 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的动力学参数3 1 7 鲫鱼胰凝乳蛋白酶的免疫印迹反应3 2 3 2 鲫鱼胰蛋白酶的纯化及性质研究3 3 3 2 1 鲫鱼胰蛋白酶的纯化3 3 3 2 2 胰蛋白酶的性质研究3 4 1 电泳和酶谱分析3 4 2 蛋白酶抑制剂及底物特异性作用3 5 4 金属离子对胰蛋白酶活性的影响3 6 5 鲫鱼胰蛋白酶的温度范围和温度稳定性3 7 6 鲫鱼胰蛋白酶的p h 范围和p h 稳定性3 8 7 鲫鱼胰蛋白酶的动力学参数3 9 8 鲫鱼胰凝乳蛋白酶b 和胰蛋白酶抗体的制备及其免疫交叉反应。4 0 第四章讨论与展望4 2 j l 定谢z l 4 参考文献4 5 在学期间发表的学术论文5 3 v 缩写 b m 匝 a p s d a b d t t e “ e d t a g l y h i 冲 p m s f s d s t e n 匝d 翮 b s a 主要缩略语及中英文对照表 全称( 英文) b - m e r e a p t o e t h a n o l a m m o n i u mp e r s u l f a t e 3 ，3 - d i a m i n o b 毛z i n d i nt e t r a h y d r o c h l o r i d e d l - d i t h i o t h r e i t o l t r a n s - e p o x y s u c c i n y l - l - l e u c y l - a m i d o ( 4 - g u a n i d i n o ) b u t a n e e t l l y l e n e d i a m i n et e t r a , a c e t i ca c i d g l y c i n e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e s o d i u md o d e 圮y ls u l f a t e n ，n n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i c h l o r o a e e t i ca c i d b o v i n es e r u ma l b u m i n v i 全称( 中文) b 疏基乙醇 过硫酸铵 二氨基联苯胺 二硫苏糖醇 反式环琥珀酸亮氨 酰氨胍基丁酮 乙二胺四乙酸 甘氨酸 辣根过氧化物酶 苯甲基磺酞氟 十二烷基硫磺酸钠 四甲基乙二胺 三氯乙酸 牛血清白蛋白 第一章引言 蛋白酶在食品工业中发挥着越来越重要的作用。商业化蛋白酶主要来源于动物、植物 及微生物，但来源于海洋及其它水产动物的蛋白酶并没有得到广泛的应用【l 】。 2 0 0 7 年，我国水产品总产量达n 4 ，7 4 8 万t 【2 】。每年水产品加工保鲜过程中产生的下脚 料( 废弃物) 1 0 0 万t ( 1 9 9 8 年) 以上【3 】，占整个鱼下脚料5 以上的内脏作为蛋白酶资源 无论在基础研究还是商业化应用都具有重要意义【4 】。然而水产加工工程中产生的下脚料一 般是作为低利用价值的饲料和肥料【5 】或者直接丢弃导致环境污染。因此，将水产品加工下 脚料转变成高利用价值的生物工具酶或生化试剂是提高其利用价值和解决环境污染的有 效手段。 另一方面，由于鱼类是浮游动物，它们的生存需要体内的消化酶随其生存环境改变而 变化，因此，来源于变温动物鱼类的消化酶活性要比来源于哺乳动物的甜锚】。鱼类胰脏含 有胰蛋白酶( e c3 4 2 1 4 ) 和胰凝乳蛋白酶( e c3 4 2 1 1 ) 等，这些酶可以广泛应用于食 品加工生产过程【9 】；同时二者在生物、医学方面也有广泛应用【1 0 。1 5 1 。因此，从鱼下脚料中 获取具有高利用价值的工具酶和生化制剂越来越有研究利用价值。 在鱼内脏的许多蛋白水解酶中，来自胰腺中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是起消化作用 的主要蛋白酶，它们在蛋白质的分解和生物生命活动中扮演重要的角色。本文以我国淡水 水域广泛分布且产量较大的鲫鱼为研究对象，对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶进行了分离纯化 并对其性质作了较为详细的分析。 1 1 鲫鱼简介 鲫鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ，图1 1 ) 属鲤形目、鲤科、鲫属的一种。身体似鲤，但体较 扁而高；头小，眼大，无须；下咽齿一行，侧扁；背鳍基部较长，背鳍、臀鳍均具有带锯 齿的粗状硬刺。鲫鱼在中国除青藏高原外各地各种水域皆产。地方名有：鲫瓜子、鲋鱼、 鲫拐子、朝鱼、刀子鱼、鲫壳子。鲫鱼对生态环境具有很强的适应能力，能耐低氧耐寒， 不论浅水、深水、流水、静水、清水、浊水甚至污水都能适应生长【l6 1 。 鲫鱼又是杂食性鱼类，它们的食谱极为广、杂，其动物性食物以枝角类、桡足类、苔 藓虫、轮虫、淡水壳菜、蚬、摇蚊幼虫以及虾等为主；植物性食物则以植物的碎屑为最主 要，常见的还有硅藻类、丝状藻类、水草等。 鲫鱼不仅味道鲜美，营养丰富，而且具有食疗保健等功能。本草纲目载：“合小豆 煮汁服，消水肿：炙油涂，主妇人阴疳诸疮，杀虫止痛；酿五倍子煅研，治下血；酿茗叶 煨服，治消渴；酿胡蒜煨研饮服，治膈气。 鲫鱼肉肥籽多，味尤鲜美，故民间有“冬鲫 夏鲇 之说。我国古医籍本草经疏也对鲫鱼有极高评价：“诸鱼中惟此可常食。 图1 一l 鲫鱼 f i g 1 1c r u c i a nc a r p ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 鲫鱼所含的蛋白质品质优良、必需氨基酸齐全、易于消化吸收，是肝肾疾病，心脑血 管疾病患者的良好蛋白质来源，常食可增强抗病能力。此外，鲫鱼也被认为有健脾利湿， 和中开胃，活血通络、温中下气之功效，对脾胃虚弱、水肿、溃疡、气管炎、哮喘、糖尿 病有很好的滋补食疗作用。 鲫鱼的肝胰脏( 图1 2 ) 为弥散型，暗红色，从胸腹腔横膈膜稍后起，分散在肠道的 外表面。 图1 2 鲫鱼内脏 f i g 1 2t h ev i s c e r ao fc r u c i a nc a r p ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 1 2 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶研究现状 1 2 1 胰凝乳蛋白酶( 原) 和胰凝乳蛋白酶 胰凝乳蛋白酶原( c h y m o t r y p s i n o g e n ) 为胰凝乳蛋白酶的前体物质。哺乳动物牛胰凝乳 蛋白酶原( c h y m o t r y p s i n o g e n ) 是由2 4 5 个氨基酸残基组成的，具有5 对二硫键的单肽链蛋 白质，当受到胰蛋白酶作用后，a r g l 5 和n e l 6 间的肽链断开，才具有酶活性，这种酶称为p 胰凝乳蛋白酶。p 胰凝乳蛋白酶的活性最高，但不稳定。它再作用于其它的p 胰凝乳蛋白 酶分子上，使另一个p 胰凝乳蛋白酶失去两个二肽( s e r l 4 - a r 9 1 5 及m 1 4 7 ) ，而形成酶的稳 定形式1 胰凝乳蛋白酶。它是由3 条肽链组成，a 、b 两条链及b 、c 两链间各通过一 对二硫键相连，a 胰凝乳蛋白酶的活性只有p 胰凝乳蛋白酶的4 0 ，酶活性部位的氨基酸 2 残基h i s 5 7 、a s p l 0 2 和s e r l 9 5 分别来自b 、c 二肽链【1 刀。其酶原激活过程如下图( 1 3 ) 所示。 l ：l 霉膏r r t h ea c t i v a t i o no fc 1 y m o l l y p h h 啊i t nb yp r o t c o l y t l cc l e a v a g e b o t h 嚣- 4 l d 口- h ，n ，o l r ) p s md r cc n - - , m a l l c a l l 3 , a f t i 、e 参s c ck i n c m a g ce x e r c i s e 1 0 - 4 图1 - 3 胰凝乳蛋白酶原的激活 f i g 1 - 3t h ea c t i v a t i o no fc h y m o t r y p s i n o g e n 胰凝乳蛋白酶( c h y m o t r y p s i n 或a c h y m o t r y p s i n ) 又称a 一糜蛋白酶、a - 胰乳酶，在胰脏 中以酶前体物质胰凝乳蛋白酶原的形态生物合成，随胰液分泌出去。在小肠受到胰蛋白酶 和胰凝乳蛋白酶的分解作用，转变成活性的胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶属于肽链内切酶， 主要切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧。牛a 胰凝乳蛋白酶的氨基酸残基数为 2 4 5 个，分子量约2 5k d a ，第5 7 位组氨酸、1 0 2 位天冬氨酸、1 9 5 位丝氨酸等三个残基在 催化作用中起着中心作用，是组成丝氨酸蛋白酶活性中心的重要部分。1 9 5 位丝氨酸受二 异丙基氟磷酸( d f p ) 的作用产生特异的修饰而丧失活性，这是丝氨酸蛋白酶的典型特点。 胰凝乳蛋白酶与同样存在于胰脏里的胰蛋白酶虽然在结构和催化机制方面非常相似，但底 物特异性完全不同。 1 2 2 胰凝乳蛋白酶的分离纯化 最早报道c h y m o t r y p s i n 的分离纯化主要是来自哺乳动物猪【18 1 、羊、人【2 0 】和牛【2 l 】等。 国外研究鱼胰凝乳蛋白酶纯化主要是从鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 瞄】、角鲨鱼( s q u a l u s a c a n t h i a s ) 2 3 】、格陵兰鳕鱼( g a d u sm o r h “a 三) 【2 4 1 、北大西洋鳕鱼( g a d u sm o r h u a ) 2 5 】、 虹鳟鱼( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 【2 6 1 、凤尾鱼( e n g r a u l i s j a p o n i c a ) 【2 刀、沙丁鱼( s a r d i n o p ss a g a x c a e r u l e u s ) 2 8 】。而国内仅有香港大学报道了从草鱼肝胰脏( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 2 9 】 分离纯化胰凝乳蛋白酶。尽管鱼胰凝乳蛋白酶与猪、牛的胰凝乳蛋白酶在底物特异性上很 相似，但是鱼类胰凝乳蛋白酶与哺乳动物的胰凝乳蛋白酶相比仍有一定的差异性，这些差 3 篡差太堂亟堂焦途塞 鲤鱼旺腿壁生堕堡自醛型煞趟乳堡自酶的筮离纯丝区丝厦硒究 异性包括鱼类胰凝乳蛋白酶具有较高催化活性、低的热稳定性以及多肽链氨基酸的组成 2 2 ， 2 9 , 3 0 o 研究表明在鱼类中存在两种具有相同活性但不同类型的胰凝乳蛋白酶。与哺乳动物的 胰凝乳蛋白酶一样，鱼类胰凝乳蛋白酶也是肽链内切酶，它们的分子量为2 2 3 0k d a ；最 适p h 和温度范围分别为p h7 5 9 0 和4 5 5 5o c 。在酸性条件下或温度5 5o c 以上不稳定【2 2 ， 2 6 】 o 1 2 3 胰蛋白酶( 原) 和胰蛋白酶 胰蛋白酶( t r y p s i n ) 和胰凝乳蛋白酶都是以酶原的形式在胰腺中产生的。胰蛋白酶原 ( t r y p s i n o g e n ) 由胰腺细胞分泌，进入小肠后，在有c a 2 + 的环境中受到肠激酶( i n t e r o k i n a s e ) 的激活作用后，l y s 6 1 i e 7 之间的肽键被打断，从氨基端水解下一个酸性6 肽( 图l - 4 ) 。这 种水解使其构象发生变化，形成胰蛋白酶的活性中心( h i s 5 7 ，a s p l 0 2 ，s e r l 9 5 ) ，由酶原转 变成具有酶活的胰蛋白酶。胰蛋白酶不仅可以激活胰蛋白酶原，而且还可以激活胰凝乳蛋 白酶原、弹性蛋白酶原及羧肽酶原，具有重要的生理功能。被肠激酶激活后的胰蛋白酶是 所有胰蛋白酶原的共同激活剂，在它的控制下，可以使所有的胰蛋白酶同时起作用【1 7 1 。胰 蛋白酶对各个胰脏蛋白酶原的激活作用如图( 1 - 5 ) 所示。 跌蚤臼锋娘的漱请 原 图l _ 4 胰蛋白酶原的激活 f i g 1 - 4t h ea c t i v a t i o no ft r y p s i n o g e n 胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶一样同属于丝氨酸蛋白酶家族的消化酶，是食物蛋白质消化 的重要蛋白酶。胰蛋白酶也是一种肽链内切酶，专一裂解有碱性氨基酸残基( l y s ，a r g ) 羧基侧链的肽键。此外，胰蛋白酶还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酯键与酰胺键。胰 蛋白酶因分布的广泛性及结构的保守性，作为酶的模型，人们对其在蛋白质水平和基因结 构水平均进行了深入的研究。迄今为止，关于胰蛋白酶基因序列的报道在g e n b a n k 上已超 过2 0 ，0 0 0 条。 4 胰蛋白酶原 肠激酶+ c a 2 + 胰凝乳蛋白酶原 胰凝 羧肽 j 肽 弹性蛋白酶原 一 胀姒酶一j r| i 蛋白酶弹性奎 晤 ， ， 一豁陆 图1 - 5 胰蛋白酶对各种蛋白酶原的激活 f i g 1 5a c t i v i t i o no fv a r i o u sv i s c e r ap r o t c i n o g c nb yt r y p s i n 1 2 4 胰蛋白酶的分离纯化 国外学者n o r t h r o p 等【3 l 】在1 9 3 1 年最先对牛的胰蛋白酶晶体进行了纯化研究，1 9 6 4 年w a l s h k a 等采用氨基酸测序的方法得到了牛胰蛋白酶全部氨基酸序歹l j 3 2 j 。1 9 7 4 年，h u b e r 等【3 3 j 采用x 射线衍射的方法测定出了牛胰蛋白酶的三维结构。之后蛋白酶研究学者分别分 离纯化和鉴定出许多种冷血动物和温血动物的胰蛋白酶。其中哺乳动物包括人m 】、牛【3 5 1 、 狗【3 6 1 、鼠 3 7 - 4 9 1 和猪 4 0 4 1 1 等。关于鱼类胰蛋白酶的研究已有大量报道，包括草鱼 ( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 【4 明、鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) r 2 2 、马苏大麻哈鱼( o n c o r h y n c h u s k e t a ) 【4 3 1 、鲶鱼( p a r a s i l i r u sa s o t u s ) 【州、柳叶鱼( m e l l a t u sv i l l u s u s ) 4 s 】、沙丁鱼( s a r d i n o p s m e l a n o s t i c t u s ) 【蛔、格陵兰鳕鱼( g a d u so g a c ) 4 7 】、风尾鱼( e n g r a u l i se n c r a n s i c h o l u s ) 4 8 】、 大西洋鳕鱼( g a d um o t h 蝴) t 4 9 、虹鳟鱼( o n c o r c h y n c h u sm y k i s s ) 【5 0 1 、大西洋鲑鱼 ( s a l m o n s a l a r ) t 5 1 1 、金枪鱼( t h u n n u st o n g 9 0 1 ) 5 2 1 、阿拉伯六线鱼( p l e u r o p r a m m u sa z o n u s ) t 5 孙、 大西洋狐鲣鱼( s a r d as a r d a ) 【刊、狭鳕鱼( t h e r a g r ac h a l c o g r a m m a ) 5 5 j 和鳜鱼( s i n i p e r c a e h u a t s i ) 5 6 】、等。除鲤鱼、鳜鱼、鲶鱼、草鱼外，关于淡水鱼类胰蛋白酶的报道很少。到 2 0 0 4 年，国内外研究学者已经分离纯化出4 种软骨鱼和2 7 种硬骨鱼的胰蛋白酶。 文献报道的鱼类胰蛋白酶的分子量一般是通过s d s p a g e 或凝胶过滤的方法来测定 的。1 9 7 1 年，k e i l t 5 7 】报道胰蛋白酶的分子量为2 0 0 2 4 0k d a 。但是从很多鱼类分离出的胰 蛋白酶的分子量都在这个范围之外，m a r i n e z 等【5 8 】测得风尾鱼胰蛋白酶的分子量为2 5 6 k d a ，o u t z e n 拶】得出大西洋蛙的胰蛋白酶分子量为2 5 0k d a ，而鲤鱼【2 2 】贝i j 为2 8 0l d ) a 。综 合国内外的研究表明，鱼类胰蛋白酶的分子量主要范围是在1 8 0 3 0 q k d a 。鱼类胰蛋白酶 适宜p h 值一般在p h8 0 1 0 0 ，最适反应温度在3 0 6 0 0 c ，等电点在p h4 5 6 0 范围内，因 此，在中性条件下绝大部分的胰蛋白酶都是碱性蛋白酶，只有少数是酸性蛋白酶。这与哺 乳动物相比有很大的差异，哺乳动物的胰蛋白酶的等电点一般为p h8 0 9 0 ，因此，哺乳 5 类动物胰蛋白酶大都属于酸性蛋白酶。 1 3 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶应用的研究 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶在食品工业、水产养殖业、医药工业及现代生物技术等领域 均有重要的应用。 在食品加工方面，c h a v e e s u k 等 6 0 】在研究鱼露加工时发现加入胰凝乳蛋白酶和胰蛋白 酶不仅能缩短鱼露的水解时间，而且还能增加鱼露的总氮、可溶性蛋白、游离氨基酸和总 氨基酸的含量。k l o m k l a o 等【6 1 1 2 0 0 6 年也报道了鱼露生产过程中加入沙丁鱼的内脏能缩短 发酵时间，加快生产进程，原因是沙丁鱼内脏含有胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。冯志彪等【6 2 】 则在2 0 0 2 年进行了螺旋藻蛋白质胰蛋白酶促水解的研究。肖凯军等 6 3 】利用胰蛋白酶水解 鲨鱼鳍软骨提取粘多糖，通过正交实验得出了胰蛋白酶酶解鲨鱼鳍软骨的最佳工艺。杨萍 等m j 研究了胰蛋白酶对青磷鱼鱼肉水解蛋白a 氨态氮含量和可溶性蛋白得率的影响，确定 了最佳水解条件。 在水产养殖方面，t h e i l a c k e r 和p o r t o r 6 5 】研究发现对营养的需求和具有高消化能力的胰 蛋白酶对阿拉斯加狭鳕鱼( t h e r a g r ac h a l c o g r a m m a ) 鱼苗的成活扮演着重要角色，可以将 胰蛋白酶作为一种生物标记来检测养殖饲料的数量和质量，低的胰蛋自酶含量表明鱼苗缺 少食物而处于饥饿状态，这样可以衡量鱼体的健康状况。田希文等人【6 6 】以发育到第n 期的 乌苏里白鲑( c o r e g o n u su s s u r i e n s i sb e r g ) 鱼卵巢为材料，利用胰蛋白酶使固定在卵巢上的 卵粒脱离下来，并研究了不同温度、盐度和胰蛋白酶浓度对鱼卵分离速度和效果的影响。 医学方面，胰凝乳蛋白酶在眼科、皮肤科做临床局部应用已被肯定【67 1 。国内临床上胰 凝乳蛋白酶主要用于眼科手术，也可用于伤口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿。近年来， 随着临床药理学研究的不断发展，胰凝乳蛋白酶的临床应用范围也日渐广泛。其临床应用 主要包括以下方面：( 1 ) 治疗脂肪硬化。胰凝乳蛋白酶具有分解蛋白、消化脓液及坏死组 织、助长肉芽生长的作用，可使凝固的蛋白、脂肪变软溶化，并促进新生肉芽的生长，从而 达到促进愈合的目的。李升香等娜】用a 胰凝乳蛋白酶治疗因肌肉注射致脂肪硬化患者9 例，效果显著。( 2 ) 治疗皮肤慢性溃疡。马利斌【6 刿以外用胰凝乳蛋白酶为主，根据疮面的 大小，坏死组织的多少，用1 2 支含量40 0 0 单位的酶粉针剂，临床治愈3 7 例，无效l 例， 治愈率为9 7 4 。治愈的3 7 例中，疗程最短1 5d ，最长8 5d 。( 3 ) 治疗骨伤科。宋明【7 0 】 将a - 胰凝乳蛋白酶应用于治疗粘连型肩周炎、创伤性疤痕粘连、创伤性关节炎、滑囊炎等， 共有1 2 0 0 多例次接受治疗，除2 例有过敏反应外，均取得了满意的疗效。( 4 ) 治疗腰椎 间盘突出症。郑光亮等【7 l 】应用高浓度a 胰凝乳蛋白酶对应节段治疗各型腰椎间盘突出症 3 6 例。治疗有效率达9 4 4 4 。( 5 ) 治疗结核性脓胸。曹立华【7 2 】等对结核性脓胸6 8 例均 采用胰凝乳蛋