（食品科学专业论文）莲原花青素的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗氧化活性研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权y l l l f l 1 1 i h 1 7 l l l l 9 i l l l l 9 l l l 1 7 l f l l l 6 l l l l 型 学位论文 各 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 躺 时间： 2 0 1o 年5 月 2 0 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：序肆嫱 导师签名：多儡龟( 互 签名日期：山f 口年多月甥日签名日期：zc f 口年f 月2 7 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 莲原花青素的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗氧化活性研究 目录 目录i 摘要i a b s t r a c t i i i 缩略语表v 前。言1 日看l 1 原花青素概述1 2 莲房原花青素的研究现状2 3 酶辅助提取天然活性成分的研究2 4 油脂抗氧化剂的研究现状3 5 等高线法概述5 6 抗氧化剂增效作用研究进展6 7 本文的研究内容及意义6 8 本研究的创新点7 第一章莲原花青素的酶辅助提取工艺研究8 弓i 言8 l 材料与试剂8 2 仪器与设备一8 3 实验方法9 3 1 原料分析9 3 2 莲房原花青素的酶辅助提取单因素实验9 3 3 莲房原花青素酶辅助提取的正交试验9 3 4 超声辅助，微波辅助与酶辅助结合实验1 0 3 5 莲房原花青素的纯化1 0 3 6 测定方法1 0 4 结果与讨论1 2 4 1 原料分析实验结果1 2 4 2 单因素实验结果1 2 4 - 3 正交实验结果1 3 4 4 验证实验结果1 5 4 5 超声辅助，微波辅助与酶辅助结合实验结果1 5 4 6 莲房原花青素的纯化1 6 4 7 冻干样品中原花青素、总酚、黄酮的含量分析1 6 4 8 红外色谱分析1 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 4 9 液相色谱分析18 4 10 抗氧化性比较19 5 小结2 0 第二章莲原花青素在油脂体系中的抗氧化作用2 l 引言2l 1 材料与试剂2l 2 仪器与设备2 2 3 实验方法2 3 3 1 莲原花青素在不饱和脂肪酸体系中的抗氧化作用2 3 3 2 莲原花青素在动植物油脂中的抗氧化作用2 4 3 3 油脂氧化样品的红外色谱分析2 4 3 4 莲房原花青素对脂肪氧合酶活性抑制的测定2 4 4 结果与讨论2 5 4 1 莲房原花青素在不饱和脂肪酸中的抗氧化作用2 5 4 2 莲房原花青素在动植物油中的抗氧化作用2 7 4 3 莲房原花青素对脂肪氧合酶的抑制作用3 l 4 4 讨 念3 2 5 小结3 3 5 1 莲原花青素在不饱和脂肪酸中具有优良的抗氧化效果3 3 5 2 莲原花青素可明显延长油脂保藏的保质期3 3 5 3 莲原花青素对脂肪氧合酶的抑制作用明显3 4 第三章莲原花青素与其他抗氧化剂的相互作用3 5 引言3 5 1 材料与试剂3 5 2 仪器与设备3 5 3 实验方法3 6 3 1l s p c 、v c 、v e 、半胱氨酸对d p p h 自由基的清除作用3 6 3 2l s p c 与v c 、v e 、半胱氨酸复配后对d p p h 自由基的清除作用3 6 3 3i s o b o l o g r a m 分析法评价l s p c 与v c 、v e 、半胱氨酸复配后的抗氧 化相互作用3 6 3 4 各类酸对l s p c 的增效作用3 7 3 5 统计分析3 7 4 结果与讨论3 8 4 1l s p c 、v c 、v e 、半胱氨酸清除d p p h 自由基的能力3 8 4 2l s p c 与v c 、v e 、半胱氨酸复配后清除d p p h 自由基的能力3 8 4 3i s o b o l o g r a m 分析法评价l s p c 与v c 、v e 、半胱氨酸复配后的抗氧 化相互作用结果4 1 莲原花青素的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗氧化活性研究 4 4 各类酸对莲原花青素的增效作用4 2 4 5 讨j 沦4 3 5 小结4 3 第四章莲房原花青素在火腿中的应用4 4 引言4 4 l 材料与试剂4 4 2 仪器与设备4 4 3 实验方法4 5 3 1 火腿的制作工艺4 5 3 2 样品添加4 5 3 3 过氧化值的测定4 5 4 结果与讨论4 6 5 卅、结4 7 第五章结论。4 8 参考文献4 9 发表的文章。5 4 致谢。5 5 莲原花青素的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗氧化活性研究 摘要 原花青素是广泛存在于植物中的一类多酚化合物，许多研究表明，原花青素 具有很强的抗氧化能力、清除自由基能力和药理活性。 本研究以植物莲的成熟花托( 莲房) 为原料，尝试采用酶辅助提取的方法提 高原花青素的提取率，将其应用于油脂中，研究其对不饱和脂肪酸、油脂、脂肪 氧合酶等的氧化抑制作用，并将其添加在火腿中，研究莲原花青素在食品中的抗 氧化作用。此外，采用等高线法研究了莲原花青素与其他抗氧化剂的相互作用。 本研究的主要成果如下： ( 1 ) 采用纤维素酶和果胶酶对莲房组织进行酶解，采用四因素三水平正交实验 对酶解时间、加酶量和酶解温度等提取工艺参数进行优化，获得了最佳工 艺参数为纤维素酶添加量为o 7 ，果胶酶添加量0 1 ，酶解温度5 5 ， 酶解时间2 5h 。后又结合微波和超声的技术手段，发现与醇提法相比， 优化后的提取工艺能将莲房原花青素的提取率提高约4 8 。 ( 2 ) 采用液相、红外等方法对不同方法提取的原花青素进行了结构的对比，发 现并没有区别，说明酶辅助提取的方法能显著提高原花青素的提取率。在 此基础上采用d p p h 法进行了抗氧化性的对比，结果表明酶辅助提取和醇 提法提取的原花青素有着相同的抗氧化性。 ( 3 ) 从大豆中提取脂肪氧合酶，采用亚油酸体系研究不同浓度莲原花青素对其 活性的抑制作用，并与茶多酚进行比较。结果表明，原花青素与茶多酚在 亚油酸体系中对脂肪氧合酶活性的抑制效果几乎一致，当溶液浓度为 0 0 8 m g m l 。1 时，原花青素和茶多酚的抑制率分别为8 8 6 8 和9 1 7 7 ，其 i c 5 0 分别为：0 0 4 7 0m g m l 。1 和0 0 4 6 8m g m l 一。 ( 4 ) 采用烘箱法研究莲原花青素在不饱和脂肪酸体系的抗氧化作用。结果表 明，在油酸体系中，无论是单独使用不同浓度的原花青素，还是与其他抗 氧化剂复配，均能显示较强的抗氧化性，其中原花青素与维生素e 的复 配效果最优。在亚油酸亚麻酸体系中，不同浓度的原花青素均显示一定的 抗氧化性。 ( 5 ) 采用烘箱法研究莲原花青素在各类动植物油脂中的抗氧化作用。结果表 明，原花青素对多种油脂有良好的抗氧化活性。在茶籽油中少量的添加即 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 可取得很好的效果。而与维生素e 复配后，则能显著延长猪油的氧化诱 导期。 6 ) 将l s o b o l o g r a m 法与d p p h 法结合，研究莲原花青素与其他抗氧化剂的相 ( 7 ) 互作用。i s o b o l o g r a m 分析图中莲房原花青素与v c 、v e 、半胱氨酸复合 组的效应点都在相加线及9 5 可信限的下方，理论i c 5 0 a d d 值与实验i c 5 0 , m i x 值有显著性差异，并且相互作用指数y 都小于l ，表明莲房原花青素与v c 、 v e 、半胱氨酸复配后都有抗氧化协同性。 按猪油中莲原花青素与维生素e 的最佳配比浓度添加于火腿中，观察到 此种复合抗氧化剂能显著提高肉类食品的抗氧化活性。 关键词：莲原花青素，复合酶，提取，油脂，抗氧化 莲原花青索的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗氧化活性研究 a b s t r a c t p r o c y a n i d i n si sat y p eo fp o l y p h e n o l sc o m p o u n d ，i nr e c e n ty e a r s ，m u c hs t u d i e s a n da g r e a ta m o u n to f w o r ko fp r o c y a n i d i n sh a v em a d ec l e a rt h a tp r o c y a n i d i n sh a s m a n yo u t s t a n d i n gc h a r a c t e r i s t i c ss u c ha st h ea b i l i t yo fa n t i o x i d a t i o n 、s e a v e n g i n g o h ， a n de x c e l l e n tb i o l o g i c a la n dp h a r m a c o l o g i ca c t i v i t i e s t h es t u d yh a su s e dt h es e e d p o do ft h el o t u so fn e l u m b on u c i f e r ag a e r t n ，t r yt o e n h a n c et h ee x t r a c t i o nr a t i oo fp r o c y a n i d i n st h r o u g he n z y m ea s s i s t a n t e d a n ds t u d y t h ea n t i o x i d a t i o no fp r o c y a n i d i n si nu n s a t u r a t e df a t t ya c i d 、o i l sa n dl i p o x y g e n a s e a n d a d di tt oh a m st or e s e a r c hi t sa n o x i t a n t i o ni nf o o dw h i c hc o n t a i no i l s f u r t h e r m o r e ， u s e dt h ei s o b o l o g r a mt os t u d yt h ei n t e r a c t i o no fp r o c y a n i d i n sw i t ho t h e ra n t i o x i d a n t m y m a i nr e s e a r c hr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： i t h ec e l l u l a s ea n dp e c t a s eh a v eb e e nu s e di n t h ee x t r a c t i o np r o c e s s a n o r t h o g o n a le x p e r i m e n ti s c a r r i e do u tt oo p t i m i z et h ep a r a m e t e r so fe n z y m et i m e ， t e m p e r a t u r ea n ds oo n t h eb e s tt e c h n i cp a r a m e t e r sa r e l i k et h i s ：t h ea m o u n to f c e l l u l a s ei s0 7 ，t h ea m o u n to fp e c t a s ei so 1 ，e n z y m et e m p e r a t u r ei s5 5 c ， e n z y m et i m ei s2 5h o u r s t h e nc o m b i n et h em e t h o d so fm i c r o w a v ea n du l t r a s o n i c ，i t f m dt h a tc o m p a r ew i t ht h em e t h o do fe t h a n o le x t r a c t i o n ，m et e c h n i ca f t e ro p t i m i z e d c a ni n c r e a s et h ee x t r a c t i o nr a t i og r e a t l y 2 h p l ca n di rh a v eb e e nu s e dt oc o m p a r et h ef o r mo ft h es a m p l e s ，t h er e s u l t s h o w st h a te n z y m ea s s i s t a n t e x t r a c t i o nc a ne n h a n c et h ee x t r a c t i o nr a t i oo f p r o c y a n i d i n so b s e r v a b l ya n dt h ef o r m sh a v en od i s t i n g u i s h o nt h i sb a s i sic o m p a r e d t h e i ra n t i o x i d a t i o nb yd p p ha n df i n dt h a tt h e yh a v et h es a m ea n t i o x i d a t i o n 3 e x t r a c tl i p o x y g e n a s ef r o mb e a n ，l i n o l e i ca c i ds y s t e mh a sb e e nu s e dt os t u d yt h e i n h i b i te f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o np r o c y a n i d i n sa n dt e ap o l y p h e n o lt oi t t h e r e s u l ts h o w st h a tp r o c y a n i d i n sa n dt e ap o l y p h e n o lh a v et h es a m ei n h i b i te f f e c tt o l i p o x y g e n a s ei nl i n o l e i ca c i ds y s t e m w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni so 0 8 m g m l 一1 ，t h e i n h i b i t i o nr a t i o so fp r o c y a n i d i n sa n dt e ap o l y p h e n o la r e8 8 6 8 a n d91 7 7 a n dt h e i c 5 0a r eo 0 4 7 0m g 。m l 一1a n do 0 4 6 8m g 。m l 一1 4 s t u d yo nt h ea n t i o x i d a t i o no fp r o c y a n i d i n si nu n s a t u r a t e df a t t ya c i db yo v e n 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 t h er e s u l ts h o w st h a t ：i no l e i ca c i d , n om a t t e ru s ep r o c y a n i d i n sa l o n eo rw i t ho t h e r a n t i o x i d a n t s ，t h e ya l ls h o w e de x c e l l e n ta n t i o x i d a t i o n ，a n dt h eb e s ti sp r o c y a n i d i n s c o m p o u n dw i t hv i t a m i ne i nl i n o l e i c a c i da n dl i n o l e n i ca c i d ，p r o c y a n i d i n sw i t h d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa l lh a ss o m ea n t i o x i d a t i o n 5 s t u d yo nt h ea n t i o x i d a t i o no fp r o c y a n i d i n si no i l sb yo v e n t h er e s u l t ss h o w t h a tp r o c y a n i d i n sh a sf a v o r a b l ea n t i o x i d a t i o ni nm a n yk i n d so fo i l s i nt e ao i l ，o n l ya l i t t l ep r o c y a n i d i n ss h o w se x c e l l e n te f f e c t a n dw h e ni tc o m p o u n d sw i t hv i t a m i ne ，t h e o x i d a t i v ei n d u c t i o nt i m eo fl a r do i lh a sb e e np r o l o n g e dr e m a r k a b l e 6 c o m b i n ei s o b o l o g r a mw i t hd p p h ，is t u d i e dt h ei n t e r a c t i o no fp r o c y a n i d i n s w i t ho t h e ra n t i o x i d a n t s t h ep o i n t so fc o m b i n a t i o n sw e r ef o u n dt ob el y i n gb e l o wt h e a d d i t i v i t yl i n ea n d9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l si nt h ei s o b o l o g r a p h i cg r a p h s t h e r ew a sa s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h et h e o r e t i c a li c 5 0 ，a d dv a l u e sa n dt h ee x p e r i m e n t a l i c 5 0 ，m i xv a l u e s t h ei n t e r a c t i o ni n d e xv a l u e so ft h ec o m b i n a t i o n sw e r el e s st h a n 1 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tl s p cc o m b i n e dw i t hv c 、v ea n dc y s t e i n eh a d s y n e r g i s t i ca n t i o x i d a n tp r o p e r t i e s 7 t h eb e s tm a t c h i n go fp r o c y a n i d i n sw i t hv ei nl a r do i lh a sb e e nu s e di nh a r m ， a n di ts h o w so u t s t a n d i n ga n t i o x i d a t i o n k e yw o r d s ：l a p c ，c o m p l e xe n z y m e ，e x t r a c t i o n ，o i l ，a n t i o x i d a t i o n i v 莲原花青耋塑堕塑墅塑墼垫查垦茎垄塑堕塑垫墨垡亟丝婴壅 一一 缩略语表 简写英文全称 中文全称 p c p r o c y a n i d i n s 原花青素 l s p c p r o c y r a n i d i n sf r o m l o t u so fs e e d p o d莲房原花青素 b h a b u t y l a t e dh y d r o x y a n i s o l e 丁基羟基回香醚 b h t b u t y l a t e dh y d r o x y t o l u e n e 2 ，6 一二叔丁基对甲酚 t b h q t e r t b u t y lh y d r o q u i n o n e 叔丁基对苯二酚 d p p h 1 , 1 d i p h e n y l 2 p i c r y l h y d r a z y l 1 ，1 - z 苯基一2 一三硝基苯肼 c c a t e c h i n 儿茶素 e c e p i c a t e c h i n 表儿茶素 i c 5 0 5 0 i n h i b i t i n gc o n c e n t r a t i o n 半数抑制率浓度 p o v p e r o x i d ev a l u e 过氧化值 v p v i t a m i nc 维生素c v 霄 v i t a m i n e 维生素e n i s i n n i s i n 乳酸链球菌素 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 v 莲原花青素的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗瓴化活性研究 1 原花青素概述 _ 上j l 刖置 原花青素( p r o c y a n i d i n s ，简称p c ) 是一种多酚化合物的总称，由不同数量的儿茶 素或表儿茶素缩合而成，主要分布在莲房、葡萄、银杏、大黄、花旗松、小连翘、 山楂等植物中( 凌志群，2 0 0 1 ) 。1 9 6 1 年，德国k a r l 首次从英国山楂新鲜果实的乙 醇提取物中分离出两种多酚化合物，1 9 6 7 年，美国j p s l y n 从葡萄皮和葡萄籽中提取 分离了四种多酚化合物，在酸性递质中，所得的多酚化合物均可加热产生花青素。 因此，这类多酚化合物被命名为原花青素( 崔介君等，2 0 0 3 ；剧红梅等，2 0 0 7 ) 。上 世纪末期，b r o w n 等分别采用纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法和高效液相色谱法 对原花青素进行了分离纯化( b r o w na g e ta l1 9 6 9 ) 。原花青素的分子结构单元是由表 儿茶素、儿茶素或没食子酸组成。通常把二四聚体称为低聚原花青素，把五聚体以 上的称为高聚原花青素。( 如图1 ) 图l 原花青素结构图 f i g 1t h es t r u c t u r a ld r a w i n go fl s p c 其中低聚原花青素是最重要的一类原花青素，尤以二聚体的抗氧化活性最强( 王 忠合等，2 0 0 6 ) 。低聚原花青素分子中具有还原性的酚羟基作为氢供体，联苯三酚或 邻苯二酚的结构可进一步加强其还原性。此外，两个脂肪族羟基有着良好的水溶性， 这些分子结构特点使原花青素具有良好的清除自由基的活性。其抗氧化机制类似黄 酮类抗氧化剂，即自身作为优良的氢供体，向活泼自由基r 或r o o 等提供h 后， 可与其它自由基形成稳定的聚合体，从而切断自由基的链式反应，发挥抗氧化作用 ( 张泽生和罗冠中，2 0 0 6 ；t e i s s e d r ep le ta l ，1 9 9 6 ) 。各国学者对上百种植物原花青素 p 一 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 尤其对葡萄籽原花青素进行了广泛而深入的研究，发现具有抗氧化、抗衰老、增强 心血管活性等多种生物活性和药理作用( l a p a r r aje ta l ，1 9 7 7 ) 。 2 莲房原花青素的研究现状 莲房是莲科植物莲( n e l u m b on u c i f e r ag a e r t n ) 的成熟花托( 又名莲蓬壳，s e e d p o do f t h el o t u s ，简称l s ) ，其主要成分包括蛋白质、糖类、脂肪、粗纤维、灰分、尼古酸、 胡萝卜素、维生素b 2 、维生素c 、蹂质及微量莲子碱等( 凌志群，2 0 0 1 ) 。莲房作 为传统中药材，功效已为人所熟知。本实验室首次从莲房中分离出了原花青素，证 实它是莲房的主要活性成分之一，并且具有多种生理功能： 段玉清等证明莲房原花青素对丫射线致免疫器官损伤有很好的防护作用( 段玉清 等，2 0 0 6 ) ；凌智群等证明莲房原花青素可治疗心肌缺血，有调节血脂的作用( 凌智 群等，2 0 0 1 ) ；杜晓芬等证实莲房原花青素对肿瘤细胞有预防作用( 杜晓芬等，2 0 0 5 ) ； 张海晖等证明莲房原花青素有增强人体免疫力的作用( 张海晖等，2 0 0 5 ) ：凌智群 证明具有抗活性氧自由基和脂质过氧化的作用( 凌智群，2 0 0 2 ) ；唐瑛等证明，适量 莲原花青素具有护肝功能( 唐瑛等，2 0 0 6 ) ；龚玉石等证明莲房原花青素有改善学习 记忆障碍，预防老年痴呆的功能( 龚玉石等，2 0 0 6 ) 。 3 酶辅助提取天然活性成分的研究 纤维素酶是一类能将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分 解纤维素产生寡糖和纤维- 糖，最终水解为葡萄糖( 顾方媛等，2 0 0 8 ) 。果胶酶是催 化植物细胞间质( 即果胶质) 水解成半乳糖醛酸和果胶酸的一类酶。 酶解法为天然产物提取中的新兴技术，利用酶制剂可以降解植物细胞壁，使胞内 有效成分最大限度溶出，同时酶解可以较温和的将植物组织分解，保证了提取物的 性质和结构的稳定。微波技术和超声技术也有文献报道将其用于天然产物的提取( 李 瑞丽等，2 0 0 8 ；) 。王康等利用纤维素酶提取侧柏叶中总黄酮，对提取过程中的温度、 p h 值、酶用量、提取时间、乙醇浓度及侧柏叶粒度等工艺条件进行了实验研究，得 到了优化的提取条件，酶法提取过程比同温水提过程的提取率高，表明酶解反应降 低了有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，对传质过程有显著的促进作用( 王 康等，1 9 9 8 ) 。高保英等进行了复合酶法和微波法提取甘草黄酮的比较实验研究，复 合酶由纤维素酶和果胶酶组成，酶法提取率可达1 6 5 ，与微波法相比提取成本低， 2 莲原花青素的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗氧化活性研究 耗能少，为提取甘草黄酮提供了一种新方法。( 高保英等，2 0 0 4 ) ；沈爱英等采用有 纤维素酶、果胶酶和蛋白酶按一定比例组成的复合酶，对姬松茸子实体在4 5 酶解 4 0m i n ，然后升温至8 5 ，热水浸提1h ，多糖提取率为1 5 6 7 ，所需时间为单纯 热水浸提法的一半，而提取率明显高于水浸提( 沈爱英等，2 0 0 1 ) 。 莲原花青素的提取主要有水浸提法( 杜晓芬等，2 0 0 5 ) 和有机溶剂提取法( 凌志 群，2 0 0 1 ) ，但由于原花青素与莲房的纤维组织结合较紧密，不容易溶出，所以提取 率较低，只有1 0 1 5 。因此，本文将酶辅助和微波超声辅助应用于莲房原花青素 提取的研究是有着重要意义的。 4 油脂抗氧化剂的研究现状 食品在加工、储藏、运输、使用过程中除了由微生物作用发生腐败变质外，油脂 受到光、热、酶、金属离子等作用而发生氧化是导致品质变劣的又一重要因素。由 于不饱和脂肪酸中的双键很容易被氧化，油脂或含油脂食品极易氧化酸败( 李书国 等，2 0 0 6 ) 。氧化还会引起食品发生褪色、褐变、维生素破坏等一些列变化，从而使 食品腐败变质，以至于缩短货架期降低、降低食品的品质和营养价值，氧化酸败严 重时甚至产生有毒物质，危及人体健康。 油脂自动氧化( a n t i o x i d a t i o n ) 是活化的含烯底物( 如不饱和油脂) 与基态氧发生的游 离基反应，包括链引发、链传递和链终止3 个阶段。在链引发阶段不饱和脂肪酸及 其甘油脂( 1 m ) 在金属催化或光、热作用下，易使与双键相邻的0 t 亚甲基脱氢，引发 烷基游离基( r ) ；在链传递阶段，r 与空气中的氧结合形成过氧游离基( r 0 0 ) ， r 0 0 又夺取另一分子r h 中的洳亚甲基氢，生成氢过氧化物( r o o h ) ，同时产生新 的r ，如此循环下去。链终止阶段，游离基之间反应形成非游离基化合物。其反应 过程如下： ( 1 ) 链引发( 诱导期) r h r + h ( 2 ) 链传递 ( 3 ) 链终止 r + r r r 量安全、防止发生氧化酸败成为油脂生产、储存关键环节。除精加工、密封包装外， 常采用添加抗氧化剂的方法延缓油脂和含油食品氧化，是储存油脂和含油食品抗氧 化最有效手段( l ix i u q i ne ta l ，2 0 0 9 ) 。 脂肪氧合酶( l i p o x y g e n a s e ) 属氧化还原酶，a n d r e 和h o u ( 1 9 3 2 ) 首先发现大豆蛋 白制品产生豆腥味是因为聚不饱和脂肪酸的酶促反应的结果，其中关键的酶是脂肪 氧合酶。脂肪氧合酶最普通的天然底物是亚油酸、花生四烯酸，其催化含顺顺1 ，禾 戊二烯的不饱和脂肪酸及酯形成氢过氧化物，从而产生豆腥味和其他挥发性物质， 是引起脂肪酶促脂质过氧化作用的重要因素( 许瑛瑛、华欲飞，2 0 0 1 ) 。脂肪氧合酶 催化初期产物氢过氧化物及其反应中形成的各种次级产物的存在会给食品的颜色、 风味、质构和营养等方面带来正面或负面的影响。脂肪氧合酶催化亚油酸时产生大 量的自由基基团，分子中酚羟基数目越多，则与活性自由基结合的氢原子也越多，从而 抑制脂肪氧合酶活性的效果增强。低聚原花青素有多个酚羟基( 何婷等，2 0 0 8 ) 。同 时脂肪氧合酶活性基团是f d + ，原花青素的邻二羟基结构与脂肪氧合酶的f e ”发生 鳌合作用后，将保持其非活化状态从而抑制脂肪氧合酶活性( 陈艳君、王建新，2 0 0 8 ) 。 抗氧化剂是一类能延缓或减慢油脂氧化的物质( 谢笔钧等，2 0 0 4 ) 。美国食品药 物管理局( f d a ) 规定，食品抗氧化剂是指延滞因氧化而引起的劣变、酸败或变色的 物质。添加抗氧化剂能够延缓甚至阻遏食品由于空气的氧化作用而引起的氧化腐败， 并对维生素类和必需氨基酸等一些易氧化的营养成分起保护作用( 吴季洪，1 9 9 4 ) 。 抗氧化剂( a n t i o x i d a n t s ) 按抗氧化机理可分为游离基清除剂、单线态氧淬灭剂、氢过氧 化物分解剂、金属螯合剂、氧清除剂、酶抗氧化剂、紫外线吸收剂( 阚健全，2 0 0 2 ) 。 人工合成的抗氧化剂以其良好的性能广泛用于食品中。虽然它们能很好地保护食品 的品质，但因其产生有毒有害物质而影响人们的健康。因此天然抗氧化剂取代合成 抗氧化剂是今后食品工业的发展趋势( b r a nal1 9 7 5 ；w h y s n e rj1 9 9 4 ) 。在天 然抗氧化剂中，酚类仍是最重要的一类，如自然界中分市很广的生育酚茶叶中的 茶多酚，芝麻中的芝麻酚，愈创木树脂( 酚酸) 等均是优良的抗氧化剂，它们是优良 的氢供体，可清除原有的游离基，同时自身生成比较稳定的游离基中间产物。酚类 4 莲原花青索的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗氧化活性研究 物质的抗氧化机理是： r o o + a h 2 r o o h 十a h r o o + a h r o o h 十a a h + a h 一a a ( 偶合) a h + a h _ a h 2 + a( 歧化) r0 0 + ah r o o a 5 等高线法概述 i s o b o l o g r a m 分析法又叫等效应法、等高线法、等辐射分析法，它起源于1 8 7 0 年f r a s e r 在研究毒扁豆碱和阿托品复合效应时提出的i s o b o l o s ( 刘瑾等，2 0 0 6 ) ，1 9 2 7 年经l o e w e 发展并提出i s o b o l o g r a m ，通过计算e d s o 来构建i s o b o l o g r a m 分析图，从 图中直观地反映两物质问的相互作用( 协同、拮抗、相加) ( p e t e r k ge t a l ，1 9 9 5 ) ，具 体做法是在等高线图中，将两种药物单独使用时的强度( 用5 0 的有效剂量e d 5 0 表 示标绘在x 、y 轴上，两点相连成相加线，如果药物合用后强度落在该线上，表示 两种药作用为相加；如果在相加线左侧，则代表协同；落在右侧，则为拮抗。如图2 所示： 复合后e d e d 5 0 c 图2a 、c 两药相互作用等高线图 f i g 2c o n t o u rm a p o f d r u g s a a n dc 掌握药物之间的相互作用( 协同、拮抗、相a n ) 可更好地避免单独、大剂量应用 某一药物造成的不良作用，合理地指导临床复合用药，增加用药的安全性。等辐射 分析法被广泛应用于基础和临床研究，国外应用更为普遍。无论在药物相互作用的 定性还是定量方面，都体现出它的优点。从消炎药物到血管活性药物，从抗癌药物 到致癌药物，从胆碱能药物到肾上腺能药物，如果在某种效应上呈现一致的趋势， 就可用等辐射法判断药物之间是否具有相加或协同关系，相反，如果在某种效应上 华中农业大学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 呈现相反的趋势可以判断它们是否具有拮抗关系，尤其能在定量基础上，精确地论 证药物之间的相互作用( 陈鸿等，2 0 0 4 ) 。 目前用等辐射分析法已经论证了很多麻醉药物之间的相互作用。尤其在镇静、催 眠、镇痛类药物联合应用上，很多以往不了解的药物复合的相互作用得以了解，指 导了临床麻醉( 肖黎波等，2 0 0 7 ) 。1 9 9 2 年t a l l a r i d a 等进行系统改进完善，进一步 推广了该方法的实际应用。现在i s o b o l o g r a m 分析法广泛应用于药物之间相互作用的 分析，被认为是能准确对药物间相互作用进行分类的有力工具( 张凌等，2 0 0 7 ； j a r o g n i e wjle t a l ，2 0 0 9 ；e w awe t a l ，2 0 0 9 ) 。2 0 0 7 年y f r u m 等将i s o b o l o g r a m 分析图 用于抗氧化方面的研究( y r r u me t a l ，2 0 0 7 ) 。 6 抗氧化剂增效作用研究进展 在实际应用抗氧化剂时，常同时使用两种或两种以上的抗氧化剂，几种抗氧化剂 之间产生协同效应，导致抗氧化效果优于单独使用一种抗氧化剂，这种效应被称为 增效作用。其增效机制通常有两种： 两种游离基受体中，其中增效剂的作用是使主抗氧化剂再生，从而起到增效作 用。如同属酚类的抗氧化剂b h a 和b h t ，前有为主抗氧化剂，它将首先成为氢供 体，而b h t 由于空间阻碍只能与r 0 0 缓慢地起反应，故b h t 的作用是使b h a 再 生。 增效剂为金属螯合剂。如酚类+ 抗坏血酸，其中酚类是主抗氧化剂，抗坏血酸 可螯合金属离子，此外抗坏血酸还是氧清除剂和使酚类抗氧化剂再生，两者联合使 用，抗氧化能力大为提高( 阚健全，2 0 0 2 ) 。 王莹研究证明作为增效剂，有机酸、d 胡萝b 素等能够增强茶多酚的抗氧化性能 ( 王莹，2 0 0 7 ) ；彭元怀等研究发现柠檬酸甘油脂肪酸酯对油脂具有抗氧化性，酯化 程度越大，抗氧化效果越好。柠檬酸甘油脂肪酸酯对抗氧化剂t b h q 具有良好的抗氧 化增效性，酯化程度越大，抗氧化增效性越好( 彭元怀等，2 0 0 8 ) ；周才琼等证明在茶 多酚中添加有机酸对茶多酚抗氧化活性有明显的增效作用( 周才琼等，2 0 0 1 ) 。 7 本文的研究内容及意义 ( 1 ) 采用纤维素酶和果胶酶的复合酶辅助提取莲原花青素，以提高其提取率， 为莲原花青素的提取开辟新的方法。 6 莲原花青索的酶辅助提取技术及其在油脂中的抗氧化活性研究 ( 2 ) 目前，莲房原花青素抗氧化活性的研究主要侧重于对人体的抗衰老，预防 某些疾病等方面