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外加因子对两相系统转化植物甾醇制备雄烯二酮的影响 摘要 雄烯二酮( a d ) 是制备甾体激素类药物的重要中间体，可通过微生物选择性 切除植物甾醇侧链获得，但该法仍存在底物甾醇进入细胞困难等问题，因此产 物转化率较低。本文在现有菌株及发酵液配方基础上，引入鱼精蛋白、甘氨酸、 表面活性剂及超声辐照作为外加因子，提高了产物转化率；本文还对罐发酵条 件进行优化和产物提取工艺研究，为微生物法工业化生产雄烯二酮提供了理论 依据。本研究的主要结论有： 通过对细胞壁结构抑制剂的对比研究，确定使用甘氨酸效果较好，其浓度 为3 0 9 l 时，产物转化率达8 3 7 ；通过对表面活性剂的研究，确定最佳表面活 性剂为t w e e n - 8 0 s p a n 8 0 ，当浓度为0 1 0 0 时，产物转化率达8 5 6 ；通过超声 辐照对转化效果的研究，发现采用6 0 w 超声辐照每隔12 h 超声18 0 s ，产物转化率 达8 5 3 ；通过对t w e e n 8 0 s p a n 8 0 与超声辐照协同作用的研究可知，当 t w e e n 8 0 s p a n 一8 0 浓度为o 0 7 5 、每隔1 2 h 超声1 5 0 s 时，产物转化率可达8 8 7 。 在上述研究基础上，通过正交试验优化得到最适5 l 罐发酵条件为：初始 p h 值8 5 、温度3 2 。c 、每升发酵液通气1 l m i n 、搅拌速率4 5 0 r m i n ，在此条件 下产物转化率平均达8 6 6 。在此基础上，研究发酵过程发酵液p h 值的变化 情况，结果表明在发酵到6 0 8 0 h 时发酵液p h 值从6 9 降至5 7 ，试验证明当发 酵至6 0 h 时，每隔1 2 h 调节p h 值一次对产物转化有利，转化率可达8 9 7 ， 发酵周期缩短到9 6 h ，迸一步研究发现在发酵过程中补充适量的无菌水有利于 产物转化。本文还研究了两相系统中雄烯二酮的提取工艺，通过该工艺提取产 物，提取率可达7 6 6 1 ，产品纯度达9 8 2 4 。 关键词：两相系统；外加因子；发酵；植物甾醇；制备；雄烯二酮 t h ee f f e c t so fp l u sf a c t o r so nt w o - - p h a s es y s t e m t r a n s f o r mp h y t o s t e r o lt oa n d r o s t e n e d i o n e a b s t r a c t a n d r o s t e n e d i o n ei sak e yi n t e r m e d i a t eo fm i c r o b i a ls t e r o i dm e t a b o l i s m i tc a n b ep r o d u c e db ym i c r o b i a ls i d ec h a i nc l e a v a g eo f p h y t o s t e r o l ，h o w e v e rt h i sm e t h o d s t i l lh a st h ed i f f i c u l to fs u b s t a n c et r a n s f e r r i n g i tm a k e st h et r a n s f o r m i n gr a t es t i l l l o w i nt h i sa r t i c l e ，w ef o c u so nt h ee f f e c t so fp r o t a m i n e ，g l y c i n e ，s u r f a c t a n t sa n d u l t r a s o u n di ni m p r o v i n gt h ef r a c t i o n a lc o n v e r s i o no fa n d r o s t e n e d i o n ea tt h eb a s i so f p r e l i m i n a r ys t u d i e s t h er e s e a r c ha l s oo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，i t p r o v i d e sat h e o r e t i c a lb a s i so fm i c r o b i 0 1 0 9 i c a lm e t h o df o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o no f a n d r o s t e n e d i o n e t h em a i nc o n c l u s i o n so ft h i sp a p e ra r ea sf o l l o w i n g ： b yt h es t u d yo fi n h i b i t o r so fc e l lw a l ls t r u c t u r e ，w ec o n f i r mt h eu s eo fg l y c i n e ， w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni s3 0 9 l ，t h ep r o d u c to ft h ec o n c e r s i o nr a t ei s8 3 7 b y t h es t u d yo fs u r f a c t a n t ，w ec o n f i r mt h eu s eo ft - 8 0 s 8 0 ，w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni s 0 10 0 ，t h ep r o d u c to ft h ec o n c e r s i o nr a t ei s85 6 b yt h es t u d yo fu l t r a s o u n d ，w e c o n f i r mu s i n gt h eu l t r a s o u n di r r a d i a t i o n6 0 wu l t r a s o n i c18 0 se v e r y12 hc a nm a k e t h ep r o d u c to ft h ec o n c e r s i o nr a t ei n c r e a s et o8 5 3 b yu l t r a s o n i ci r r a d i a t i o nw i t h t - 8 0 s - 8 0s y n e r g ys t u d y , w ec a ns e et h a tw h e nt - 8 0 s 8 0c o n c e n t r a t i o no fo 0 7 5 e v e r y12 hu l t r a s o u n d15 0 s ，t h ep r o d u c to ft h ec o n v e r s i o nr a t eu pt o8 8 7 a tt h eb a s i so ft h ea b o v e m e n t i o n e ds t u d y , t h r o u g ht h eo r t h o g o n a lt e s tt o o p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nt a n kt ob et h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：t h e i n i t i a lp hv a l u eo f8 5 ，t e m p e r a t u r e3 2 ，v e n t i l a t i o np e rl i t e rf e r m e n t a t i o nb r o t hi l m i n ， s t i r r i n gr a t e4 50 r m i n ，u n d e rt h e s ec o n d i t i o n st h ep r o d u c to fc o n v e r s i o nr a t eu pt o a b o u t8 6 6 o nt h i sb a s i s ，t h es t u d yo ff e r m e n t a t i o nb r o t hc h a n g e si np hv a l u e s ，i t f o u n dt h a ta t6 0 8 0 hf e r m e n t a t i o nb r o t ht h ep hv a l u e sr e d u c ef r o m6 9d o w nt o5 7 ， t e s tp r o v e st h a te v e ni ft h ef e r m e n t a t i o nt i m et o6 0 he v e r y12 hr e g u la t i o no fp h v a l u eo fac o n v e r s i o no fap r o d u c tb e n e f i c i a lt ot h ec o n v e r s i o nr a t eu pt o8 9 7 ，t h e f e r m e n t a t i o nc y c l es h o r t e n e dt oa b o u t9 6 h ，i n d e p t hs t u d yw ef o u n dt h a ta d da n a p p r o p r i a t ea m o u n to fs t e r i l ew a t e rt ot h ef e r m e n t a t i o nb r o t hi nf e r m e n t a t i o n p r o c e s si sg o o da tt h et r a n s f o r m a t i o no fp r o d u c t t h i sa r t i c l ea l s oe x a m i n e dt h e t w o p h a s es y s t e m a n d r o s t e n e d i o n et h e e x t r a c t i o np r o c e s s ，w i t ht h ea d o p t i o no ft h et e c h n o l o g yo fe x t r a c t i o no ft h ep r o d u c t ， t h ee x t r a c t i o nr a t ec o u l dr e a c h7 6 61 ，t h ep r o d u c tp u r i t yr e a c h9 8 2 4 i i k e yw o r d s ：t w o p h a s es y s t e m ；p l u sf a c t o r ；f e r m e n t a t i o n ；p h y t o s t e r o l ； p r e p a r a t i o n ；a n d r o s t e n e d i o n e i i i 插图清单 图1 - 1 甾体化合物的结构式1 图1 - 2 甾体化合物的微生物转化反应位点3 图1 - 3 雄烯二酮的结构式4 图1 - 4 胆固醇转化为a d d 与雄烯二酮的反应途径5 图1 - 5 甾体母核的降解过程6 图2 - 1 分枝杆菌生长曲线测定1 4 图2 - 2t l c 分析图一15 图2 - 3 雄烯二酮标品的液相色谱图1 6 图2 - 4 雄烯二酮的标准曲线1 6 图2 5 鱼精蛋白作用于分枝杆菌的显微结构图“1 8 图2 6 鱼精蛋白浓度对菌体转化能力的影响1 9 图2 7 甘氨酸浓度为3 5 9 l 时分枝杆菌的显微结构图2 0 图2 8 甘氨酸浓度对菌体转化能力的影响”2 0 图2 9 全细胞催化模型示意图”2 1 图3 - 1 表面活性剂对分枝杆菌转化能力的影响一2 6 图3 2 超声辐照的强度及剂量对分枝杆菌转化能力的影响一2 7 图3 3 表面活性剂的作用机理”2 8 图3 4t w e e n - 8 0 与s p a n - 8 0 促进油水乳化的机理2 8 图3 5 超声辐照对菌体转化能力的作用机理”2 9 图3 - 6 超声辐照与表面活性剂共同作用的机理”2 9 图4 - 1 接种量对菌体转化能力的影响”3 3 图4 - 2 温度对菌体转化能力的影响”3 3 图4 - 3 转速对菌体转化能力的影响“3 4 图4 - 4 通气速率对菌体转化能力的影响”3 4 图4 - 5 初始p h 值对菌体转化能力的影响3 5 图4 - 6 发酵过程中p h 值的变化情况3 6 图5 - 1 温度对雄烯二酮溶解度的影响3 9 图5 2 温度对甾醇溶解度的影响“4 0 图5 - 3 不同预处理对雄烯二酮总含量的影响”4 0 图5 - 4 萃取比对雄烯二酮萃取率的影响4 1 图5 - 5 上清液的雄烯二酮浓度与结晶时间的关系4 2 图5 - 6 产品高效液相色谱图4 2 图5 - 7 两相系统中提取雄烯二酮的流程图”4 3 v i i i 表格清单 表i - i 工业上重要的甾体药物微生物转化反应3 表2 - i 不同浓度的鱼精蛋白对菌体生长的影响”1 7 表2 - 2 不同浓度的甘氨酸对分枝杆菌生长的影响1 9 表3 - 1 不同种类和浓度的表面活性剂对分枝杆菌生长的影响”2 5 表3 2 油水两相乳化效果对照表2 5 表3 - 3 超声辐照的强度及剂量对菌体生长的影响“2 6 表3 - 4 表面活性剂与超声辐照共同作用对分枝杆菌转化能力的影响一2 7 表4 - il 。( 3 4 ) 正交试验设计及其结果分析3 5 表4 - 2l 。( 3 4 ) 正交试验验证试验结果一3 6 表4 - 3 调控p h 值对菌体转化能力及发酵周期的影响3 7 表4 - 4 补充无菌水对菌体转化能力及发酵周期的影响3 7 表5 1 不同温度下甲醇与乙醇萃取油相雄烯二酮的分配系数一4 i 表5 2 乙酸乙酯油相的高效液相色谱结果4 2 i x 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得合肥工业大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：铀年 签字日期： m i 学位论文版权使用授权书 k 黾l 踟 本学位论文作者完全了解 金g 巴王些态堂 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权 金胆王些态堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期： 矿7 年 罗炳彳 krt 瞻 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期： 电话： 邮编： 军啪 9 名 多 年 隧砂 致谢 本论文是在我的导师潘丽军教授的悉心指导下完成的。无论是从论文的选 题、试验方案的制定还是论文的修改完稿，潘老师都倾注了大量的心血，给予 了我无微不至的关怀和帮助。潘老师严谨求实的治学作风、对科学的执着追求 以及对人生的深刻理解，都使我受益匪浅。在此向潘老师致以最诚挚的谢意和 最崇高的敬意! 课题论文的完成是对我近三年研究生所学知识和技能的一个大总结，更是 对以前知识的巩固和提升，不仅使我的动手能力得到了很大提高，也使我的创 新思维得到了很好发展。感谢校、院、系领导和试验室的老师们为我们营造了 一个的浓厚的学术氛围和良好的试验环境，也为我们今后的工作和学习打下了 坚实的基础。 感谢姜绍通教授、陈从贵教授、郑志副教授、杨英老师、李兴江老师、韩 卓老师、罗水忠老师、陈晓燕老师给了我许多指导和帮助。此外，胡锦艳师姐、 赵俊平师兄等及本科生杨晓军在试验过程中给予了我不少启发或协助，也向他 们表示感谢。同时感谢同试验室的冯丽桦、聂胜德、刘靖、桂蕾、张丽、罗蕾 蕾、胡艳红同学，两年多共同的学习生活，我从他们身上学到了很多。 感谢我的家人，他们的支持和鼓励，使我能够顺利完成这篇硕士论文，这 里谨向他们致以最衷心的感谢! 两年多的研究生生活是我人生最宝贵的财富，再次感谢所有关心和帮助我 的领导、师长、家人、同学及朋友们! i v 作者：罗炳华 2 0 0 8 年12 月3 0 日 1 1 甾体化合物简介 第一章绪论 1 1 1 甾体化合物的结构 甾体化合物( s t e r o i d s ) 又称类固醇，是一类含有环戊烷多氢菲核的化合物， 化学结构上由a 、b 、c 、d 四个环稠合而成，其中a 、b 、c 环为六元环，d 环为 五元环。通常a b 环稠合处和c d 环稠合处各有一个角甲基，许多甾类在d 环1 7 位有侧链( 见图1 1 ) 川。 鬻卜弋h 3 5 啪c h 气尸v - 一弋 剁 1 1 1 2 嚣吒k 3 一弋 2 ，滞占。嵫6h 3 乏 iai b i 。4 。6 图1 1 甾体化合物的结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fs t e r o i d s 1 1 2 甾体激素类药物的分类及功能 自二十世纪5 0 年代以来，随着对甾体化合物研究的日益深入，甾体激素类 药物己逐渐成为医药领域的重要门类，在临床上的应用日益广泛，在世界范围 内其产量仅次于抗生素。甾体激素类药物主要分为三大类【2 】： ( 1 ) 肾上腺皮质激素( a d r e n n o c o r t i c o s t e r o i d s ) ，简称皮质激素，包括盐皮 质激素和糖皮质激素两类。盐皮质激素( m i n e r a l o c o r t i c o i d s ) 在体内主要影 响水盐代谢，主要药物有醛固酮( a l d o s t e r o n e ) ，临床上主要应用于治疗阿狄森 氏内分泌疾病。糖皮质激素( g l u c o c o r t i c o i d s ) ，主要生理作用是影响糖、蛋白质、 脂肪和水盐代谢，主要有可的松( c o r s t i s o n e ) ，泼泥松( p r e d n i s o n e ) 、地塞 米松( d e x a m e t h a s o n e ) 、倍他米松( b e t a m e t h a s o n e ) 等，其主要功效为抗炎、抗毒、 抗过敏、免疫抑制，对风湿性、类风湿性关节炎、红斑狼疮等胶原性疾病有明 显的治疗作用。 ( 2 ) 性激素( s e xh o r m o n e ) ，包括雌激素、孕激素和雄激素。雌激素 ( e s t r o g e n s ) 主要有雌酮( o e s t r o n e ) ，雌三醇( e s t r i 0 1 ) 等，孕激素( p r o g e s t o e n s ) 主要 有孕酮( p r o g e s t e r o n e ) ，临床上常用于治疗妇科疾病，骨质疏松等。雄激素 ( a n d r o g e n s ) 主要有睾酮( t e s t o s t e r o n e ) ，临床上主要用于两性性机能不全所致的 疾病，还可用于治疗贫血、消耗性疾病以及促进骨折和伤口的愈合等。 ( 3 ) 蛋白同化激素( a n a b o l i es t e r o i d s ) ，主要有l7 a 甲基去氢睾丸素( 17 a m e t h y l d e h y d r o t e s t o s t e r o n e ) 、苯丙酸诺龙( n a n d r o l o n e p h y l p r o p i o n a t e ) 等，主要用 于蛋白质合成不足和分解增加的治疗，如营养不良、严重烧伤、恶性肿瘤、手 术后恢复期过长、慢性消耗性疾病以及长期大剂量使用糖皮质激素引起的负氮 平衡等。 1 1 3 甾体激素类药物的制备方法 1 1 3 1 传统方法 甾体药物的结构比较复杂，若用全合成方法进行制备，常常由于反应步骤 较多，不甚经济，因此，甾体药物的生产极大部分都是利用己具有甾体骨架的 天然产物进行结构改造而成。胆酸、薯蓣皂甙元、海柯皂甙元和惕告皂甙元等 都是制造甾体药物的原料。其中，从薯蓣皂甙元中提取薯蓣皂素作为合成甾体 药物原料，在相当长的一段时期内占据着主导地位( 约占7 0 ) ，我国大多以薯蓣 皂素为原料【3 6 j 。 1 1 3 2 微生物制法 随着甾体医药工业对薯蓣皂素需求的日益增长，薯蓣资源日渐枯竭，急需 新方法来代替传统的生产方式。19 5 2 年，美国u p j o h n 公司的p e t e r s o n 和m u r r a y 首先发现少根根霉( r h i z o p u sa r r h i z u s ) ，以后又发现黑根霉( r h i z o p u sn i g r i c a n s ) 能使黄体酮进一步转化成1 1a 一羟基黄体酮，收率达8 5 以上，解决了生产可的 松等皮质激素药物的最大难题。化学合成难以完成的反应，利用微生物轻而易 举得到了实现，由此开创了微生物转化甾体化合物的先河。 微生物对甾体化合物的转化反应是多样的，它们对甾体每一位置( 包括甾体 母核和侧链) 上的原子或基团都有可能进行生物转化( 见图1 2 ) 【7 j 。这些反应 至今已经发现的主要有氧化、还原、水解、酯化、酰化、异构化、卤化、a 环 开环、边链降解等( 见表1 1 ) 2 】。以上反应不一定都是单一的转化，有时一种 微生物还可以对某种甾体化合物同时产生数种不同的转化反应。目前在甾体激 素药物的生产中，比较重要的微生物转化反应主要有羟基化、脱氢、边链降解 等。在这些反应中，羟基化反应应用最多，边链降解的重要性也不容忽视。人 们可以直接利用微生物切除天然甾醇的侧链生产甾体药物中间体雄烯二酮( a d ) 和雄二烯二酮( a d d ) ，a d 与a d d 再经化学方法进行结构改造可得到一系列有价 值的甾体激素类化合物。这不仅从根本上改变了薯蓣皂素法生产某些甾体药物 步骤多，转化率低，价格贵等不足之处，而且使得自然界丰富的甾体资源得到 有效的利用，解决了甾体医药工业中所需原料的问题，促进了甾体医药工业的 迅速发展。图1 2 和表1 1 是不同微生物转化甾醇过程的反应位点。 2 船器i h尹3c i 山k 黔乏= 2 3 一舀 2 j 弗嵫一h 3 iai b i 一 图1 2 甾体化合物的微生物转化反应位点 f i g 1 - 2b i o t r a n s f o r m a t i o ns i t e so fs t e r o i d s 表1 1 工业上重要的甾体药物微生物转化反应 t a b l e 1 li m p o r t a n tk i n d so fb i o t r a n s f o r m a t i o ni ni n d u s t r y 1 2 雄烯二酮的功能及生产方法 1 2 1 雄烯二酮的功能作用 雄烯二酮( 雄甾4 烯3 ，1 7 二酮，a n d r o s t e n e d i o n e ，简称a d ，分子式： c 1 9 h 2 6 0 2 ) 是制备甾体激素类药物的重要中间体。a d 主要用来生产雄性激素、 蛋白同化激素、螺内脂等药物。a d 除了可以合成性激素外，还可以通过在其1 7 位酮基上引入皮质激素侧链使之能够应用于皮质激素的生产。因此，通过a d 几乎可以合成所有的甾体药物哺】。 o o 图1 3a d 的结构式 f i g 1 - 3t h es t r u c t u r eo f a d 1 2 2 雄烯二酮的传统制备方法 传统的制备a d 的方法是薯蓣皂甙元途径：即从野生中药材“穿地龙”等植物 中提取薯蓣皂素，进行化学合成。 传统生产方法的局限性在于：( 1 ) 化学工艺过程复杂，步骤繁琐； ( 2 ) 成本高、消耗大；( 3 ) 破坏环境目前穿地龙资源十分紧张，人们无秩序、 不科学采挖，不但破坏了地表植被，还破坏了生态环境。 1 2 3a d 的微生物转化途径 1 2 3 1 微生物转化途径的优势 由于市场对a d 的需求日益增长，传统生产方法所用原料薯蓣皂甙元资源日 渐枯竭，价格也不断攀升。因此，目前以稀缺的薯蓣皂甙元为原料的工业体系 逐渐被以自然界丰富存在的动植物甾醇为原料的工业体系所代替乃甾体医药工 业发展的一大趋势【9 , 1 0 。 1 2 3 2 微生物降解甾醇的机理 ( 1 ) 微生物法生产a d 的过程机理 1 9 6 8 年s i h 和w h i t l o c k 【1 1 】就对胆固醇代谢作了一系列试验并作了全面解释。 微生物降解胆固醇生产a d 的过程包括c 3 位的酯化，5 双键被异构酶催化转位 到4 双键的异构化以及c 1 7 边链的降解。甾醇c 1 7 边链的降解与脂肪酸b 氧化相 似【12 1 ，开始于c 2 7 羟基化，再氧化成c 2 7 羧酸，然后通过b 氧化失去丙酸、乙酸、 最后再失去丙酸，形成c 17 酮化合物。如图1 4 f i t 示【1 3 】： 4 h o a d d o h 3 o 图1 4 胆固醇转化为a d d 与a d 的反应途径 f i g 1 - 4t h er e a c t i o np r o c e s sf r o mc h o l e s t e r o lt oa d da n da d h 3 h ( 2 ) 甾核的降解 微生物对甾醇降解并不终止于a d 的生成。a d 生成之后，微生物还将对其 5 c i 2 位进行脱氢及9 a 羟化，然后a 环芳构化，b 环开裂，甾核即被降解【13 1 ，如图 1 5 所示： o o o c 0 2 + h 2 0 图1 5 甾体母核的降解过程 f i g 1 5t h ed e g r a d a t i o no fs t e r o i dn u c l e a r 甾醇降解过程的机理表明，在微生物转化甾醇过程中，要想获得大量a d ， 必须设法控制好c 1 7 氧化边链酶，9 - o 羟化酶和c 1 2 脱氢酶活性，使反应朝有利 于产物生成的方向进行。 1 2 4 微生物转化法生产a d 的国内外研究概况 1 2 4 1 国外研究概况 早在1 9 4 4 年，t u r f i t t 1 4 1 就报道了分枝杆菌能利用胆固醇及植物甾醇作为生 长繁殖的唯一碳源，但它除了降解侧链外，还进一步降解甾体的骨架，因此不 能用于生产甾体激素的中间体如a d 等，但这已推进了微生物转化甾体类化合物 的进程。1 9 5 2 年u p j o h n 公司的m u r r a y 和p e t e r s o n 申请了由l l a 一羟基化作用生成黄体 酮的专利。这是微生物转化生产类固醇及激素药物的方法进入到工业化规模的里程 碑。直到1 9 6 9 年日本a r i m a 1 5 , 1 6 1 等人用添加抑制剂的方法使分枝杆菌只降解胆 固醇的侧链生成a d d 而不降解甾核，从此开始了微生物降解各种甾醇合成 a d d 的研究。7 0 年代，m a r s c h e c k t l 7 】等用诱变的方法筛选到分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u mn r r lb 3 6 8 3 ，无需加入抑制剂便能有效降解胆固醇、胆甾酮、 6 植物甾醇等的侧链产生a d d ，该菌的迸一步诱变得到了丧失c 1 ，2 脱氢酶活 力m y c o b a c t e r i u mn r r lb 3 8 0 5 的突变株，该菌能有效产生a d 。自2 0 世纪8 0 年代以来，微生物降解甾醇生成a d 、a d d 技术得到充分发展。国外很多大的 制药公司如日本三菱化成，西德先令( s c h e r i n gag ) ，荷兰g i s t ，美国u p j o h n 等在8 0 年代后期就己将甾醇发酵生成a d 的路线用于工业生产，大大降低了成 本【1 8 , 1 9 】。近些年来，随着基因工程技术的进展，有研究者从基因方面考虑寻找 非致病微生物菌落，经过诱变等方式处理获得突变菌株，提高产物产量【2 。 r a n j i t 等就构建了一株含有质粒p j l l 的节杆菌，能对甾醇侧链进行选择性降解 生成a d 而不降解甾核。此外，在培养基优化，提高甾醇溶解度等方面，国外 专家学者们也作了大量研究，并取得一定突破。在最近的二十余年间，在该领域 取得突出贡献的研究人员主要有a r i m a 等( 1 9 6 9 ) ，p i n h e i r o 等( 1 9 9 3 ) ，d i a s 等 ( 1 9 9 4 ，2 0 0 2 ) ，l e o n 等( 1 9 9 8 ) ，f e m a n d e s 和c a b r a l ( 2 0 0 7 ) ，k i e s l i c h 等( 1 9 8 5 ) ，o w e n 等 ( 1 9 8 3 ，1 9 8 5 ) ，s i h 等( 1 9 6 8 ) ，f u j i m o t o 等( 1 9 8 2 ) ，s z e n t i r m a i 等( 1 9 9 0 ) ，g y u r e 等( 1 9 9 3 ) ， w o v c h a 等( 1 9 7 8 ) ，w o v c h a 和b i g g s ( 1 9 8 1 ) 。目前的主要研究集中于如何提高憎水性底 物的生物催化。研究的团队包括c r u z 等( 2 0 0 1 ，2 0 0 2 ，2 0 0 4 a ，b ) ，d ec a r v a l h o 等( 2 0 0 4 ) ， f e r n a n d e s 等( 19 9 8 ，2 0 0 3 ) ，f e r n a n d e s 和c a b r a 等1 ( 2 0 0 7 ) ，s t a e b l e r 等( 2 0 0 4 ) ，c l a u d i n o 等( 2 0 0 7 ) ，d o n o v a 等( 19 9 7 ，2 0 0 5 a ，b ，c ，2 0 0 7 a ) ，d o n o v a 等( 2 0 0 7 a ) ，k o r y c k a - m a c h a l a 等 ( 2 0 01 ，2 0 0 5 ) ，r u m i j o w a s k a 等( 19 9 7 ，2 0 0 0 ) ， s e d l a c z e k 等( 19 9 7 ，19 9 9 ) ，p e r e z 等 ( 1 9 9 5 ，2 0 0 3 ，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) ，w a n g 等( 2 0 0 4 a ，b ，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ) ，m a l a v i y a 等( 2 0 0 7 a , b ) ，m a l a v i y a 和g o m e s ( 2 0 0 7 a , b ) ，他们都致力于利用微生物转化固醇以生产a d 及其衍生物【z l 】。 1 2 4 2 国内研究概况 国内对a d 微生物转化的研究始于2 0 世纪9 0 年代初期，9 0 年代中期停滞了一 段时间，近些年又有所复兴。 2 0 世纪9 0 年代初期对a d 的微生物转化研究主要集中在探索不同菌种转化 甾醇能力的高低以及培养基的优化上，其中，中科院上海有机化学研究所的王 敬一【2 2 1 等选用一株牝牛分枝杆菌，生物中心的陈知本 2 3 】等选用一株分枝杆菌， 上海医科大学的王黎明等【2 4 】选用一株诺卡菌，上海医科大学的史济平等【z5 j 选用 一株珊瑚红球菌分别进行了研究，这些菌种的转化能力都不是很高，一般底物 投料量在0 1 0 2 5 时，a d 转化率只有3 0 左右，只有陈知本等研究的分枝 杆菌在适当的发酵条件下，得到了8 9 的最高转化率【2 3 1 。培养基优化方面主要 研究培养基成分、助溶剂乙醇添加量、无机金属离子、温度、p h 、通气量、以 及投料方式、底物诱导等因素对发酵的影响。大多数试验结果证明，培养基中 碳源含量的多少与甾体的降解有密切关系。适量的碳源既可使菌体生长旺盛， 又利于边链降解所需酶系形成，而又不导致甾体被彻底氧化，从而有利于累积 a d ；碳源浓度过高反而不利于发酵。一般4 的乙醇对甾醇助溶效果较好，并 7 且能促使菌体形成不完整细胞膜，从而有利于底物进入细胞并进行生物转化。 甾体转化的酶系通常是种诱导酶，在整个菌体生长过程中添加适量甾醇有诱 导作用，不仅提高了a d 的转化率，还相应提高了底物的投料量，底物投料以分 批方式加入为宜。 近些年来对a d 的微生物转化的研究主要集中在菌种的诱变选育、甾核降解 抑制剂的作用及培养基优化上。中国药科大学的李莹 2 6 】等采用紫外光、y a g 倍 频脉冲激光及两者复合诱变方法进行诱变育种，得到一株分枝杆菌高产优质突 变株，产a d 能力提高了1 1 6 ，且不再产生结构类似物a d d 。哈尔滨理工大学 的吴宝华等 2 7 】采用紫外线照射、n t g 、5 b u 等化学诱变剂及复合诱变方法，筛 选出一株转化大豆甾醇转化率达9 5 ，a d 产率达4 5 的高产节杆菌菌株。 综合分析上述研究成果可以看出目前该领域主要存在以下问题： ( 1 ) 底物甾醇和产物a d 在水中的溶解度低 甾体化合物在水中的溶解度很低，一般的溶解度范围在l0 5 1 0 西m o l l 之 间，属难溶性或微溶性化合物【2 引。甾醇在水中的溶解度低于2 m g l ，产物a d 在 水中的溶解度也不高- 于5 0 m g l t 2 9 1 。甾体化合物的难溶性严重影响甾体转化反应 的速率和产率，也是限制微生物转化工业化最主要的障碍之一【3 0 一3 2 】。如何增 大甾醇的溶解度并使之有效均匀地分散，是提高甾体转化反应活性和速率的关 键控制因素。 ( 2 ) 产物抑制 微生物催化的过程是可逆的，过大的产物浓度对转化酶有反馈抑制作用。 r e i c h er 等采用树脂等吸附剂的原位产物去除方法实现了解除产物抑制和保护 产物进一步降解，在产物浓度达到10 9 l 时也获得了较高的产物转化率【3 引。 ( 3 ) 细胞外层结构的阻碍作用 甾体化合物的微生物转化需要在相关的胞内酶的催化下进行，这就决定了 只有扩散进人细胞的底物才能与酶接触并进行有效转化，而甾体化合物进出细 胞的难易度取决于细胞壁结构状况和细胞膜的通透性等。 解决上述问题的方法主要有： ( 1 ) 目前解决甾醇溶解度低的方法是采用有机溶剂进料。甲醇、二甲亚矾、 二甲基甲酰胺、乙醇是研究比较多的四种溶剂，它们均易溶于水并较容易溶解 甾体化合物 3 4 1 。近来有人采用聚丙二醇( p p g ) 及硅氧烷作为溶剂使投料浓度及 转化率大大提高，有文献 35 】报道在以p p g 作为溶剂的条件下m y c o b a c t e r i u ms p 。 m b 3 6 8 3 能成功的将植物甾醇降解为a d ，底物浓度在5 9 l 左右，转化率大为提 高。但由于水溶性有机溶剂的生物相容性差，对微生物细胞有一定的毒害作用， 因此投入浓度受到限制，制约了底物投料量的增加。 采用添加表面活性剂等的乳浊液进料方法也得到广泛研究，如环糊精【3 引、 卵鳞脂37 1 、聚氧丙烯醇 3 引、t w e e n 8 0 3 9 1 等。这些物质既能增加底物的溶解度， 又能改变细胞膜的通透性【4 0 1 ，对加快底物的传递、提高转化效率效果明显。 h c s s e l i n k 等【4 l 】通过试验证明b c d 能显著增加分枝杆菌m y c o b a c t e r i u ms p n r r l b3 6 8 3 降解胆固醇、谷甾醇及4 胆甾烯酮边链生成a d ( d ) 的产率，当环 糊精与底物的摩尔比率为2 ：l 时微生物降解边链的活性可增加1 7 3 倍，a d 的收率 从3 5 ，4 0 提高到8 0 以上，发酵周期却由17 5 h 减小到1 2 0 h 。b c d 的存在并 不影响细胞的生长比率和细胞密度，在甾体边链降解过程中，c d 作为一种惰性 甾体增溶剂、反应载体及保护剂，不影响生物催化剂本身【4 2 1 。本课题采用葵花 油作为有机溶剂溶解底物甾醇，具有甾醇溶解度大、对细胞无毒害等优点。 超声辐照乳化也是促进甾醇乳化溶解的有效手段之一可起到粉碎颗粒， 提高比表面积等目的，从而增加甾体底物与微生物细胞的接触机会，提高转化 率。 ( 2 ) 改变菌体外层细胞壁结构对底物及产物的通透性。基因突变、细胞壁 改性剂、肽聚糖合成抑制剂等能影响疏水性及亲水性物质的渗透性【43 | 。k o r y e k a m a c h a l a 等 4 4 】研究表明，聚阳离子( 如鱼精蛋白，聚乙烯亚胺等) 能增加疏水化合 物对分枝杆菌细胞壁的渗透，发酵液中有鱼精蛋白存在时，b 谷甾醇的转化率 提高了3 倍。l e o ns e d l a c z e k 等【45 】证明m 氯苯丙氨酸及d l 亮氨酸作为分枝杆菌 细胞膜脂质双层外层脂质化合物生物合成抑制剂，在浓度适合时可成倍提高 a d ( d ) 的产量。肽聚糖合成的抑制剂如甘氨酸( 1 5 m g m l ) 和万古霉素( 1 5 0 p g m l ) 能使细胞的转化活性提高近3 倍，另外粘菌素在浓度为1 0 p g m l 至0l5 1 a g m l 时也 能提高转化率。但是，分枝杆菌细胞膜脂质双层内层的霉菌酸，阿拉伯糖苷抑 制剂如异烟肼的加入却使淄醇转化活性显著降低这说明完整的霉菌酸、阿拉 伯糖苷结构在甾醇渗透入细胞过程中的必要性，而在人们筛选的能降解甾醇边 链的菌种中，活性最强的也正是那些细胞膜中含有霉菌酸的菌种【4 酬。 ( 3 ) 改变细胞膜对底物及产物的通透性。适宜的表面活性剂、超声辐照等能影 响细胞膜对甾醇及a d 的通透性。细胞膜是细胞外层包裹的一层封闭膜，其主要成分 为脂类和蛋白质，目前以脂质双分子层结构镶嵌蛋白质流体的模型被广泛认同，构成 细胞膜骨架的脂质分子的分子结构中同时包含疏水基和亲水基。 表面活性剂的分子结构与细胞膜相似，因此具有一定的生物效应。当表面活性剂 与膜接触时，会与脂质膜发生融合入侵等现象，从而改变膜的通透性，表面活性剂所 包含的底物也随之进入细胞内，经一系列酶催化反应后得到产物，再透过细胞膜排出 至胞外，在胞外又可形成胶束团，加速产物排出胞内的过程，整个过程与膜泡运输类 似。 向两相发酵系统中引入超声辐照可产生生物及化学效应，改变微生物的生长环 境，促进某些酶催化反应的发生，并促进细胞膜的通透性及流动性，达到了强化分枝 杆菌转化甾醇产a d 的目的。 9 1 2 5 两相发酵系统简介 两相发酵系统是指将细胞培养与产物萃取分离耦合的由水相和有机溶剂相 组成的微生物发酵系统。这种发酵系统的优势在于：首先可以提高底物甾醇的 投料量，因为甾醇在有机溶剂中的溶解度要比在水中的溶解度大很多；其次该 系统可以减少代谢产物的反馈抑制作用，提高代谢产物产率，推进工业化进程； 第三，可以协调上游和下游加工过程，使整个过程的研究得到优化，以提高生 产效率，降低生成成本。 构建两相发酵系统的关键是确定合适的有机溶剂。其最重要的两点要求： 一是生物相容性好，对细胞无毒性，不影响其生长繁殖；二是对底物甾醇及代 谢产物雄烯二酮有较大的溶解萃取能力。这两者往往不可兼得【47 1 。其中，考察 有机溶剂对细胞的相容性非常困难。原先，l a n n ec 等【4s 】考察了1 0 7 种有机溶剂 的介电常数、偶极矩、氢键、极化强度和l o g p 值( p 为有机溶剂在辛醇和水两相 体系中的分配系数) 等参数，认为只有l o g p 值能很好预测生物相