（食品科学专业论文）红色红曲菌M7紫外诱变突变子特征分析.pdf

红色红帅菌m 7 紫外诱变突变了特征分析 红色红曲菌m 7 紫外诱变突变子的特征分析 摘要 红曲菌( m o n a s c u ss p p ) 是我国传统的食用和药用微生物，在我国已有上千年 的应用历史。它能分泌产生色素、莫呐可啉类( m o n a c o l i n s ) 物质、y 氨基丁酸 ( 丫a m i n o b u t y r i ca c i d ，g a b a ) 、麦角固醇和丰富的水解酶类等，是生产食品发酵剂、 着色剂、保健食品、药品或其原料的重要微生物资源。目前，国内外对红曲菌菌种 的分类、选育、发酵条件及代谢产物分离纯化的研究相对较多，而有关红曲菌的分 子生物学研究才刚刚起步，有关功能基因的研究很少，而关于红曲菌产色素、产孢 等相关基因的研究尚未见报道。 本研究以紫外线为诱变剂，以红色红曲菌( m o n a s c u sr u b e r ) m 7 为出发菌株， 获得2 4 株稳定的白化子与小菌落等突变株。在此基础上，对突变子的菌落形态、显 微结构及其次生代谢产物等进行了分析。本课题为鉴定红曲菌菌落大小、颜色和产 孢子等相关基因的研究提供了材料。具体内容如下： l 红色红曲菌( m o n a s c u sr u b e r ) m 7 的紫外诱变 对出发菌株m 7 进行斜面培养1 8d ，用无菌水沈下孢子，用玻璃珠打散，稀释 至1 0 6 个m l ，涂布于2 5e r n x 3 0c m 玻璃板，3 0w ，4 0c m 进行3 0m i n 紫外照射，避 光培养7d ，挑选形态发生变化的突变子。经过多轮诱变共获得2 6 株形态发生显著 变化的突变子。突变子经过3 代连续培养后，筛选获得2 4 株稳定的突变子，遗传稳 定性为9 2 3 。这些突变子的编号分别为5 0 1 c 、5 1 8 b 、5 1 8 e 、6 1 8 a 、6 1 8 f , 6 1 8 e 、 6 1 8 h ，1 1 0 2 a ，7 2 9 b ，9 2 9 b 、9 2 9 h ，9 2 9 j ，1 0 2 9 ，9 2 9 k ，7 2 9 c ，5 0 1 d ，9 2 9 d ，9 2 9 t , 9 2 9 9 、4 2 1 a 、4 2 1 c 、4 2 6 q 、6 1 8 9 、1 1 0 2 b 。 2 突变子的形态特征观察 2 5 ，p d a 培养出发菌株m 7 与筛选到的突变子9d ，按其菌落直径、正反面 颜色、气生菌丝形态等特征共分为六大类：i 出发菌株m 7 ；i i 与出发菌株m 7 菌落特征相似的菌株，共7 株，分别是1 1 0 2 a 、7 2 9 b 、9 2 9 b 、9 2 9 h 、9 2 9 j 、1 1 0 2 9 、 9 2 9 k ；小菌落菌株，直径仅1 9c l t i 左右，分别是5 0 1 c 、5 1 8 b 、5 1 8 e 、6 1 8 a 、6 1 8 t , 6 1 8 e 、6 1 8 h ：i v 白化子菌株，菌落粉色，共一株，为7 2 9 c ；v 绒毡状菌落，共4 株，分别是5 0 1 d 、9 2 9 d 、9 2 9 f , 9 2 9 9 ；v i 栗色菌株，共5 株，分别是4 2 1 a 、4 2 1 c 、 华中农业人学2 0 0 8 届顾f ：学位论文 4 2 6 q 、6 1 8 9 、1 1 0 2 b 。随后，2 5 c 下用插片法p d a 培养9d 对所筛突变子进行显微 形态观察。 3 突变子次生代谢产物的分析 从供试菌株制得的红曲粉中分别提取色素、桔霉素、莫呐可啉k 、y 氨基丁酸 四种次生代谢产物，检测分析其产量，得出结果如下：5 0 1 d 莫呐可啉k 产量最高， 达3 9 0 7 7r t g g ；6 1 8 t , 9 2 9 h 、9 2 9 b 、9 2 9 j 的m o n a c o l i nk 产量均较低，已低于本实 验条件下h p l c 的最低检测限。其中有1 0 株突变子m o n a c o l i nk 产量提高。6 1 8 h 的 桔霉素产量最高，达4 0 1 21 t g g ：7 2 9 c 、4 2 1 a 、4 2 1 c 产量低于检测限。5 1 8 b 的1 ，- 氨 基丁酸产量最高，达7 9 8 2 5r t g g ，4 2 6 q 产量最低，仅2 0 0 7p g 僧。6 18 h 色价最高， 达2 4 5 7u g ：7 2 9 c 色价最低，为3 7u g 。 4 突变子5 0 1 d 和6 1 8 h 发酵条件初步研究 为了更好的了解各突变子的特性，对高产莫呐可啉k 突变子5 0 1 d 与高产色素 与桔霉素突变子6 1 8 h 进行发酵条件初步研究，包括固态发酵与三角瓶液态发酵。其 中，固态发酵条件研究包括培养温度和时间因素；液态摇瓶发酵条件研究包括碳源 与初始发酵液p h 值两因素。得出结果如下：( 1 ) 固态发酵：不同温度培养红曲菌， 其次生代谢产物变化较大。在3 0 时，桔霉素产量达最高，之后呈下降趋势；2 5 时，莫呐可啉k 产量最高，之后下降；色价在1 5 3 5 逐渐升高，2 5 以后，上升 趋势减缓。从8d 1 5d ，色价、桔霉素、莫呐可啉k 均呈上升趋势，1 5d 色价与桔 霉素、莫呐可啉k 产量基本达到最大值，之后变化趋于平缓或降低。( 2 ) 三角瓶发 酵：甘油为碳源时其色价、莫呐可啉k 和桔霉素产量均较高，但以葡萄糖为碳源时， 桔霉素产量相对要低，莫呐可啉k 与色价均较高。p h 值变化对两株突变子色素、 桔霉素与莫呐可啉k 的产量都有较大的影响。p h 值为3 时莫呐可啉k 与桔霉素产 量均极低。桔霉素产量在p h 为6 时达最高；莫呐可啉k 产量在p h 为5 时晟高； 色价在p h 值为6 时达最高。 关键词：红曲菌；紫外诱变；显微观察；次生代谢产物 红色红n 菌m 7 紫外诱变突变了特征分析 a b s t r a c t m o n a s c u ss p p ，ak i n do ff u n g u su s e di nf o o dp r o d u c t i o na n dt r a d i t i o n a lm e d i c i n ef o r t h o u s a n d so fy e a r si nc h i n a , h a sb e c o m ea ni m p o r t a n tm i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e sd u et oi t s y i e l do fm a n yk i n d so fm e t a b o l i t e s ，s u c ha sh o n g q up i g m e n t ，m o n a c o l i n s ，7 - a m i n o b u t y r i c a c i d ( g a b a ) ，e r g o s t e r o l ，w h i c ha r eu s e da sf o o df e r m e n t a t i o ns t a r t e r , f o o dc o l o r a n t ， f u n c t i o nf o o da n dr a wm a t e r i a l so fm e d i c i n e a tp r e s e n t ，t h ei n v e s t i g a t i o na b o u t m o n a s c u ss p p w a sf o c u s e do ni t sc l a s s i f i c a t i o n ，b r e e d i n g , m e t a b o l i t e si s o l a t i o na n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n st oi m p r o v eu s e f u lm e t a b o l i t e s ，b u tt h es t u d yo nm o l e c u l a r b i o l o g yo fm o n a s c u ss p p i sa tt h eb e g i n n i n gs t a g e i tw a sf o u n dt h a tm o s t o ft h e s e q u e n c e sr e l a t e dt om o n a s c u ss p p i ng e n b a n kw e r ec a r r i e do nc l a s s i f i c a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no ft h eh o m o l o g y , f e ww a sf u n c t i o n a lg e n e s u pt on o w , i th a sn or e p o r t a b o u tt h eg e n e ( s ) i n v o l v e di nh o n g q uf u n c t i o n u vm u t a t i o nw a su s e dt op r o d u c em u t a n t so fm - 7i nm ys t u d y 2 4m u t a n t si n c l u d i n g p e t i t ec o l o n ya n da l b i n om u t a n tw e r eo b t a i n e d o u rs t u d ym a i n l yi n c l u d e da n a l y s i so n c o l o n ym o r p h o l o g y , m i c r o m o r p h o l o g ya n dy i e l do fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，w h i c h e s t a b l i s h e dt h e o r e t i c a lf o u n d a t i o na n dp r o d u c e db a s i cm a t e r i a l st oe x p l o r ef u n c t i o n a l g e n e t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s 1 m o n a s c u sr u b e rm - 7u v m u t a g e n e s i s a f t e rs l a n tc u l t u r eo fm 一7f o r18d ，s p o r e sw e r ew a s h e db ys t e r i l ew a t e r , s e p a r a t e d b yb e a d s d i l u t e dt o10 0i n d m la n dp l a s t e r e do n2 5c r u x3 0c mp e t r id i s h e s o m em u t a n t s o fd i f f e r e n tm o r p h o l o g yw e r es e l e c t e db yu vm u t a g e n e s i sa n dw e r ec u l t u r e di nt h e c o n d i t i o n so fa v o i d i n gl i g h t h a dg o t2 6m u t a n t sw h i c hc h a n g e di nc o n f i g u r a t i o n a f t e r t h r e eg e n e r a t i o n s ih a dg o t2 4m u t a n ts t a b l e t h es t e a d yt r a n s m i s s i b i l i t yi s9 2 3 t h e s e m u t a n t sw e r en a m e d5 0 1 c ，5 1 8 b ，5 1 8 e ，6 1 8 a , 6 1 8 f , 6 1 8 e ，6 1 8 h ，1 1 0 2 a , 7 2 9 b ，9 2 9 b ，9 2 9 h , 9 2 9 j ，1 1 0 2 9 ，9 2 9 k , 7 2 9 c ，5 0 1 d ，9 2 9 d ，9 2 9 f , 9 2 9 9 ，4 2 1 a ，4 2 1 c ，4 2 6 q ，6 1 8 9 ，1 1 0 2 b 。 2 t h em u t a n t s c o l o n ym o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c c u l t i v a t e dm - 7a n do t h e rm u t a n t so np d af o r9d ，c l a s s i f i e dt h e s em u t a n t sb yt h e i r c l o n yc h a r a c t e r i s t i c b e i n gd i v i d e di n t of i v eg r o u p ：t h em u t a n t ss i m i l a rw i t hm 7 ，7 s t r a i n si na l l ，t h e yw e r e110 2 a , 7 2 9 b ，9 2 9 b ，9 2 9 h ，9 2 9 j ，110 2 9 , 9 2 9 k ；t h ep e t i t ec o l o n y m u t a n t s ，7s t r a i n si na l l ，t h e yw e r e5 0 1 c ，5 1 8 b ，5 1 8 e ，6 1 8 a , 6 1 8 f , 6 1 8 e ，6 1 8 h ；t h e a l b i n o m u t a n t ，o n l yo n es t r a i n ，i tw a s7 2 9 c ；t h ev i l l i f o r mc l o n ym u t a n t s ，4s t r a i n s ，t h e yw e r e 5 0 1 d ，9 2 9 d ，9 2 9 f , 9 2 9 9 ；t h ec a s t a n e o u sc l o n ym u t a n t s ，t h e yw e r e4 2 1a , 4 21c ，4 2 6 q ，618 9 , 110 2 b a n dt h e nc u l t i v a t e dt h e s em u t a n t s15d ，o b s e r v e dt h e s em u t a n t su n d e rm i c r o s c o p e i i i 华中农业人学2 0 0 8 届硕 ：学位论文 3 s e c o n d a r ym e t a b o l i t e sa n a l y s i so fm u t a n t sa n do r i g i n a ls t r a i nm - 7 e x t r a c t e dm o n a c o l i nl 【，g a b a ，c i t r i n i n ，p i g m e n tf r o mt h er f rm a d eb yt h e s e s t r a i n s t h er e s u l tw a s ：5 0 1 dp r o d u c e dt h eh i g h e s ty i e l do f m o n a c o l i nk ，3 9 0 7 7p 舀6 1 8 f , 9 2 9 h ，9 2 9 b ，9 2 9 jp r o d u c e dl i t t l em o n a c o l i nk t h ey i e l dw a sl o w e rt h a nt h ed e t e c tl i m i t ； 6 18 hp r o d u c e dt h eh i g h e s ty i e l do fc i t r i 血，4 0 1 2p g ，t h ey i e l do f7 2 9 c ，4 2 1 aa n d4 2 1 e w a sl o w e rt h a nt h ed e t e c tl i m i t ；518 bp r o d u c e dg a b a m o s t ，7 9 8 2 5p 眈，4 2 1ap r o d u c e d t h el e a s t ，2 0 0 7 i _ t g g ；618 hp r o d u c e dt h eh i g h e s ty i e l dp i g m e n t ，2 4 5 7u g ，7 2 9 cp r o d u c e d t h el e a s t ，3 7 g 4 p r e l i m i n a r ys t u d yo ff e r m e n t a t i o no nm u t a n t s5 0 1 da n d6 1 8 h i no r d e rt or e s e a r c ht h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e s em u t a n t sb e t t e r , w eh a v ed o n e f e r m e n t a t i o nr e s e a r c ho n618 ha n d5 01d i n c l u d es o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o na n dl i q u i d - s t a t e f e r m e n t a t i o n t h er e s u l ti s ：( 1 ) s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n a t3 0 c ，m u t a n t sp r o d u c ec i t r i n i n t h eh i g h e s t ；a t2 5 ，m o n a c o l i nk p r o d u c t i o na r r i v e dt h eh i g h e s ty i e l d f r o ml5 3 5 ，t h e p i g m e n t - v a l u ei n c r e a s e dg r a d u a l l y , b u tf r o m3 0 c ，t h et r e n d a n c eo fi n c r e a s et u r n e ds l o w l y f r o m8d - 15d ，t h ey i e l dm o n a c o l i nk ，g a b a ，c i t r i n i n , p i g m e n t v a l u ea l li n c r i s e d g r a d u a l l y , a n dt h e n ，a l lt h ep r o d u c t i o nr e d u c e d ( 2 ) l i q u i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n t o o k g l y c e r i n 鹊c a r b o ns o u r c e ，t h ey i e l do fm o n a c o l i nl 【，g a b a , c i t r i n i n , p i g m e n t v a l u ew e r e h i g h e rt h a no t h e r s t o o kg l u c o s ea sc a r b o ns o u r c e ，t h ey i e l do fc i t f i n i nw a sl o w e r d i f f e r e n tp ho fc u l t u r em e d i u mi n f e c t e dt h ey i e l do fm e t a b o l i t e sm u c h w h e nt h ev a l u e o fp hw a s3 ，t h e yp r o d u c e da l lt h em e t a b o l i t e sl i t t l e w h e nt h ev a l u eo fp hw a s5 ，t h e y i e l do fm o n a c o l i nka n dp i g m e n tw a st h eh i g h e s t w h e nt h ev a l u eo fp hw a s6 ，t h ey i e l d o fc i t r i n i nw a st h eh i g h e s t k e yw o r d s ：m o n a s c u sr u b e r ；u vm u t a g e n e s i s ；m i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n ；s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s i v 红色红【m 菌m 7 紫外诱变突变了特征分析 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 乔如需保密，解密时间年 月日 是否保密 蟛 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 碱蚣各呖谚帅：彬年月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 猢黼馘巧彩铷张彬 蛳期：挪年月7 日 参细期：年月日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 红色红m 菌m 7 紫外诱变突变了特征分析 第一章文献综述弟一早义i 颞综尬 红曲菌( m o n a s c u ss p p ) 是用来制备红曲的微生物菌种，是我国重要的微生物 资源。红曲又称月曲、神曲和红曲米，是我国传统的特色发酵食品，被广泛应用于 中药和多种食品中。传统的红曲是指以大米为原料，经红曲菌固体发酵而成的产物 即红曲米( 方元超等，1 9 9 9 ) 。主要用作食品发酵剂、着色剂、防腐剂、增香剂及中 药配伍( 张徐兰等，2 0 0 6 ：纪远中，2 0 0 5 ；雷萍和金宗濂，2 0 0 3 ) 。随着红曲研究的 深入，红曲中的多种有益代谢产物如色素、m o n a c o l i nk 、y 氨基丁酸( y a m i n o b u t y r i c a c i d ，g a b a ) 、麦角固醇等成分已被广泛应用于现代食品、医药、饲料和化妆品等 领域中。据报道，美国从我国进口功能红曲作为膳食补充剂，欧洲一些国家从我国 进口红曲作为香肠发色剂( 金宗濂，2 0 0 5 ；陈云，2 0 0 3 ；贾波，2 0 0 3 ) 。 目前，国内外关于红曲菌的研究主要集中在菌种分类、选育、发酵条件研究及 活性成分的分离纯化等方面，并且取得了一系列的研究成果( c h e r ta n dh u ，2 0 0 5 ： 熊晓辉等，2 0 0 4 ；洪智勇和毛宁，2 0 0 2 ；宓鹤鸣和程荣珍，2 0 0 0 ；许赣荣等，2 0 0 0 ； 傅亮和周卫兵，1 9 9 6 ) 。而有关红曲菌的分子生物学研究才刚刚起步，有关功能基因 的研究很少，而关于红曲菌产色素、产孢等相关基因的研究尚未见报道。 1 红曲菌的生物学特性 红曲菌是腐生真菌，生长的最适p h 为3 5 5 o ，嗜酸，尤嗜乳酸，故常出现在 乳酸自然发酵的基质中，如青贮饲料、大曲、制曲作坊等。红曲菌的生长温度为 1 5 - - 4 2 ，最适温度为2 5 3 5 ；其耐乙醇能力强，能耐高达1 0 的乙醇；它能以多 种糖、醇类物质和一些酸类物质为碳源；能利用各种氮源，因此其生活能力非常强。 红曲菌的菌丝具不规则分支，细胞之问有隔，菌丝间常有网结联合( a n a s t o m o s e ) 现象。细胞无色或含有色素颗粒。细胞内有多个核，含有大型液泡和黄色的油滴。 细胞壁光滑，但有的菌丝，尤其是生长时间长的菌丝外壁一般都附有结晶状的疣状 物( c r y s t a l l i n ee n c r u s t a t i o n s ) 。 红曲菌的繁殖分有性和无性繁殖。无性繁殖产生分生孢子，其着生方式为单一 或成单链状生长在菌丝顶端，孢子呈倒梨形或球形，孢子壁光滑，无色或红色。有 性繁殖产生闭囊壳，在形成初期一般为无色，后期为红褐色，闭囊壳壁粗糙。红曲 华中农业人学2 0 0 8 届硕1 ：学位论文 菌的子囊呈卵球形，内含成对的子囊孢子，子囊壁较薄；子囊孢子椭圆形，孢子壁 光滑，无色或淡红色( 李钟庆和郭芳，2 0 0 3 ；章克第，1 9 8 9 ) 。 2 红曲菌的分类 红曲菌属( m o n a s c u sv a i lt i e g h e m ) 是v a nt i e g h e m 于1 8 8 4 年建立的属。当时 v a n t i e g h e m 观察到的是成熟的闭囊壳，其中的子囊壁已解体，故误认为只有一个含 有许多孢子的子囊，而将这类菌定名为单子囊菌( m o n a s c u s ) ( 李钟庆和郭芳，2 0 0 3 ) 。 自该属建立至今，其在真菌中的分类地位还未统一。 真菌分类系统主要有d eb a r y 系统( 1 8 8 4 ) 、m a r t i n 系统( 1 9 5 0 ) 、g a u m a n n 系 统( 1 9 6 2 1 9 6 4 ) 、w h i t t a k e r 系统( 1 9 6 9 ) 、a i n s w o r t h 系统( 1 9 7 3 ) 、a l e x o p o u l o s 系 统( 1 9 7 4 ) 等( 余永年，1 9 8 0 ) 。刘波( 1 9 7 8 ) 和e a u m a n n ( 1 9 7 9 ) 都采用了m a r t i n 分类系统，将红曲菌属归于真菌门( e u m y c o t a ) 、子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) 、真子囊 菌亚纲( e u a s c o m y c e t e s ) 、散囊菌目( e u r o f i a l e s ) 、散囊菌科( e u r o t i a c e a e ) 。戴芳澜 ( 1 9 8 7 ) 采用自己的分类系统( 1 9 5 9 1 9 7 3 ) ，对于红曲菌属的分类归属与前述一致。 陈驹声( 1 9 8 2 ) 和远藤章( 1 9 9 4 ) 将红曲菌属归于半子囊菌纲( h e m i a s c o m y c e t e s ) 下，这与我国大多数学者意见不同。俞大绂( 1 9 8 5 ) 、张纪忠( 1 9 9 0 ) 等采用了a i n s w o r t h 分类系统，将红曲茵属归于真菌界( e u m y c o p h y t a ) 、子囊菌门( a s c o m y c o t a ) 、真子 囊菌纲( e u a s c o m y c e t e s ) 、散囊菌目( e u r o t i a l e s ) 、红曲科( m o n a s c a c e a e ) 。与m a r t i n 分类系统相比，于散囊菌目下建立红曲科，从而与散囊菌科分开。目前各国真菌分 类学者普遍采用a i n s w o r t h 系统。 中科院微生物研究所的李钟庆长期从事红曲菌分类学方面的研究，他认为红曲 菌至少应分为1 2 个种( 李钟庆和郭芳，2 0 0 4 ) ，分类如下。 红色红曲菌( m o n a s c u sr u b e rv a nt i e g h e m ) 丛毛红曲菌( mp i l o s u sk s a t oe xd h a w k s w o t h p i t t ) 紫色红曲菌( mp u r p u r e u sw e n t ) 佛罗旱达红曲菌( mf l o r i d a n u sc a n n o n b a m a r d ) 苍白红曲菌( mp a l l e n sc a n o n ，a b d u l l a h & a b b s ) 血红红曲菌( 必s a n g u i n e u sc a n o n a b d u l l a h a b b s ) 早生红曲菌( me r e m o p h i l u sh o c k i n g & p i t t ) 新月红曲菌( 必l u n i s p o r a su d a g a w a b a b a ) 2 红色红1 f n 菌m 7 紫外诱变突变了特缸分析 发自红曲菌( 磁a l b i d u l u s z q l i & f g u o ) 火红色红曲菌( mr u t i l u sz q l i & f g u o ) 烟灰色红曲菌( m f u m e u sz q l i & f g u o ) 橙色红曲菌( ma u r a n t i a c u sz q l i & f g u o ) 3 红曲菌的代谢产物 3 1 红曲色素 3 1 1 红曲色素的种类 红曲色素是多种色素成份的混合物，由化学结构相似的红、橙、黄三类不同色 素组成。目前已确定结构式且被人们所认同的有6 种，分别为红斑素( r u b r o p u n c t a t i n ) ， 红曲红素( m o n a s c o r u b r i n ) ， 红斑胺( r u b r o p u n c t a m i n e ) ，红曲红胺 ( m o n a s c o m b r a m i n e ) ，红曲素( m o n a s c i n ) 和红曲黄素( a n k a n a v i n ) ( 宫慧梅，2 0 0 2 ； 庄桂，1 9 9 6 ) 。其中，r o b r u p c t a i n 和m o n a s c o r u b r i n 是橙色素，r u b r o p u n c t a m i n e 和 m o n a s c o m b r a m i n e 为红色素，m o n a s c i n 和a n k a f l a v i n 是黄色素，其化学结构见图1 1 。 1 9 9 4 年，y o n g s m i t h 等又发现了两种新的黄色素，其分子式分别为c 2 5 h 3 1 0 5 n 和 c 2 3 h 2 7 0 5 n 。一般认为，三种色素中只有橙色素是通过生物途径合成的，而其它两种 色素都是由橙色素经化学氧化得来的( c a r d sa n ds h e p h e r d ，1 9 7 7 ) 。 o o 红斑胺( r u b r o p u n c t a m i n e ) 分子式c 2 i h 2 3 n 0 4 m e 0 m e o 红曲红胺( m o n a s c o r u b r a m i n e ) 分子式c 2 3 h 2 7 n 0 4 。 华中农业人学2 0 0 8 届硕i ：学位论文 o 0 o 红斑素( r u b r o p u n c t a t i n ) 分子式c 2 1 h 2 2 0 5 m e 0 o 红曲素( m o n a s c i n ) m e o m e o 红曲红素( m o n a s c o r u b r i n ) 分子式c 2 3 h 2 6 0 s o 红曲黄素( a n k a f l a v i n ) 分子式c 2 3 h 3 0 0 5 图1 - 16 种红曲色素的化学结构式 f i g 1 - 1c h e m i c a l s t r u c t u r e so f6k i n do fp i g m e n t si nr f r 3 1 2 红曲色素的一般性质 m e ( 1 ) 色价 色价是指单位质量或单位体积内某种色素的含量单位，用u g 或u m l 表示。红 曲色素有两个最大吸收波峰，分别在4 1 0n n l 和5 1 0h i 1 附近，各与化学合成的色素 柠檬黄和烟脂红的主波峰相近，即黄色光波区和红色光波区。因此我们用分光光度 计测定4 1 0n n l 和5 1 0s i l l 的吸光度值( o d 值) ，分别计算黄色色素和红色色素。( 张 永权等，1 9 8 5 ) 。 ( 2 ) 溶解度 红曲色素中有一部分水溶性较好，属水溶性色素，有一部分却只能溶于有机溶 剂中，不易溶于水中，属脂溶性色素。红曲色素中的脂溶性色素均能溶于乙醚、氯 仿、乙醇、醋酸、j 下己烷等溶剂中，其溶解度在醋酸中最大，j 下己烷中最低。常用 4 红色红曲菌m 7 紫外诱变突变了特征分析 的溶剂是乙醇和醋酸，乙醇浓度为7 5 一8 2 ，醋酸浓度7 8 时对红曲色素的溶解性 最好。红曲色素在水中的溶解度与水溶液的p h 有关。在中性或碱性条件下极易溶 解，而在p h4 以下的酸性范围内或含5 以上盐溶液中，其溶解度呈减弱倾向( 周 建钟等，2 0 0 3 ) 。 ( 3 ) 稳定性 红曲色素是混合色素，因此其中任何一种色素颜色变化都会对整体有影响。红 曲色素在应用中最大的缺点就是不够稳定。 有关研究( 连喜军，2 0 0 5 ：宋水山，1 9 9 5 ) 证明红曲色素对同光敏感性较差， 易于退色。受光照时间越长，退色程度也越大。在室内反射光线下，样品放置8 0d ， 色度损失3 0 左右，而在夏天白天直射光线下放置5h 就损失5 0 色度。若能将三 种色素分别提纯、存放，使用效果比较好。 p h 对红曲色素的影响较复杂，对红曲色素中各组分影响也不尽相同。一般红曲 色素在中性范围比较稳定，即使在加热情况下也以中性为佳，不过在酸碱两种情况 下，偏碱性比偏酸性为好，损失率较少( 夏明和杜琪珍，2 0 0 3 ) 。 红曲色素的热稳定性很好，优于其它合成色素，即使天然色素中其耐热性也属 优良。红曲色素在7 0 乙醇溶液中经1 3 0 处理1 5m i n ，仅2 5 分解；红曲黄色素 于1 2 0 ( 2 下可加热1h ；于1 0 0 下可加热6 5h ，8 0 可加热3 0h ( 赖建平和罗军， 1 9 9 9 ；谢珍珍和李建英，1 9 9 3 ) 。 3 2 莫呐可啉类物质 3 2 1 莫呐可啉类物质的发现 1 9 7 9 年远藤章又从红曲菌属m o n a s c u sr u b e r 的培养液中获得一种胆固醇合成抑 制剂莫呐可啉k 。1 9 8 0 年美国的a l b e r t s 等( 1 9 8 0 ) 人也从a s p e r g i l l st e r r e u s ( 土曲 霉) 中发现了相似的h m g c o a 抑制物质，起名为m e v i n o l i n 。m o v i n o l i n 也称为 l o v a s t a t i n ( 洛伐他汀) ，与莫呐可啉k 为同一种物质，这些物质都能有效抑制胆固 醇生物合成中的关键酶h m g c o a 还原酶( 3 羟基3 甲基戊二酰基辅酶a 还原酶) 的活性，从而能阻断人体内胆固醇的合成，进而能调节人体内异常血脂。 5 华中农业人学2 0 0 8 届顾i j 学位论文 3 2 2 莫呐可啉k 的理化性质 莫呐可啉k 的主要结构为氢化萘母核、p - 羟一6 - 内酯坏和2 甲基- 丁酸。根据母核 上两处支链结构的不同，可以形成多种莫呐可啉类物质见图1 2 。莫呐可啉k 在常 态下是透明的针状结晶；易溶于甲醇，乙醇，丙酮，氯仿和苯等有机溶剂，不易溶 于水；分子式为：c 2 4 h 3 6 0 5 ( 内酯型) ；分子量为4 0 4 5 5 。在酸性条件下有酸型和内 酯型两种形态。 0 图1 - 2m o n a c o l i nk 化学结构式 f i g 1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r eo fm o n a c o l i nk 3 2 3 红曲中莫呐可啉k 的检测方法 o 红曲中莫呐可啉k 的检测方法主要有紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相 法( h p l c ) 、超临界流体色谱法等，其中最常用的是以c 1 8 柱作为分离柱，联合紫 外检测，采用乙腈或甲醇和磷酸水溶液为流动相的h p l c 检测方法。 红曲中的莫呐可啉k 以两种形式同时存在，即闭环的内酯式结构和丌环的酸式 结构。以前，红曲中莫呐可啉k 的h p l c 检测方法多采用美国药典中土曲霉内酯式 洛伐它汀的检测方法，事实上仅适用于检测红曲中的内酯式莫呐可啉k 。罗仁才 ( 2 0 0 3 ) 用n a o h 将红曲样品碱化处理，使内酯式莫呐可啉k 全部转化为酸式，以 h p l c 法测定了红曲中莫呐可啉k 的总量。目前，尚未有国家标准可检测红曲中两 种结构的莫呐可啉k 的含量。许赣荣等( 2 0 0 0 ) 将红曲样品的p h 控制在6 7 之间， 使两种结构的莫呐可啉k 在测定过程中不互相转化，然后用文献报道的色谱条件分 别测定了红曲中内酯式和酸式莫呐可啉k 的含量，该方法对于天然功能性红曲的鉴 别和质量评价具有重要意义。 6 红色红f h 菌m 7 紫外诱变突变了特征分析 3 2 4 莫呐可啉类物质的功能性作用 6 0 年代初，对抗生素的研究已逐步扩展到筛选酶活性抑制剂的领域，该领域的 学者们筛选到许多有前途的酶类抑制剂，如h m g c o a 还原酶抑制剂。h m g c o a 还原酶是控制体内胆固醇合成速度的关键酶，胆固醇的生物合成途径见图1 3 。 乙酰乙酰辅酶a 硫解酶羟甲皋戊_ 二酰辅酶a 合成酶 乙辅酶a 乙酰乙酰辅酶a l 6 6 0 、6 3l d i h y d r o x e m l i n 羟甲基戊二酰辅酶a _ 二羟甲戊酸_ 焦磷酸法呢酯 抑制作用l 莫呐可啉k 鲨烯合成酶脂酰辅酶a ：肌 i i i | 醇脂酰转移酶 叫鲨烯_ 胆固醇 s q u a l e s t a t i np y r i p y r o p e n e s 图1 3 胆固醇生物合成途径及l o v a s t a t i n 抑制位点 f i g 1 - 3c h o l e s t e r o lb i o s y n t h e s i sa n dl o v a s t a t i ni n h i b i t o rs i t e s 莫呐可啉类化合物作为h m g c o a 还原酶的竞争性抑制剂，可以有效减少或阻 断内源性胆固醇的合成，其中以莫呐可啉k 的活性最为显著。天然红曲中莫呐可啉 类化合物的发现使红曲被作为天然药物中抑制胆固醇合成和降血脂的首选药物，并 受到世人瞩目( 马美荣，1 9 9 9 ；毛宁，1 9 9 7 ) 。 近年来，莫呐可啉类化合物被认为不仅是有效的降血脂药物，同时还具有较好 的肾脏保护作用。药理研究表明，莫呐可啉k 具有明显的抑制肾小球系膜细胞的增 生和细胞外基质分泌的作用( 张徐兰，2 0 0 6 ；王丽等，2 0 0 0 ) 。 e n d o 教授( 1 9 7 9 ) 通过对莫呐可啉k 的内酯构型弱碱化，形成了碱金属盐、土 族金属盐等，发现它们分别具有预防和治疗胆结石、前列腺肥大和肿瘤作用，使胆 结石形成指数下降，改善f i i f 列腺肥大程度，使排尿正常，还能使肿瘤增值率降低。 7 华中农业人学2 0 0 8 届硕i j 学位论文 3 3 桔霉素 香港中文大学的w o n g 等( 1 9 8 1 ) 从红曲中分离出一种抑茵因子，命名为 m o n a s c i d i n a 。法国b l a n c 教授( 1 9 9 5 ) 用质谱、核磁共振、紫外及荧光分析等多种 方法对其进行结构测定和定性分析，证实m o n a s c i d i n a 就是桔霉素( c i t r i n i n ) 。此后， 中国、法国、日本、美国、荷兰、土耳其等国先后丌展了研究，肯定了红曲及相关 产品中桔霉素的存在，并探讨了桔霉素的测定方法及其控制方法。 h e t h e r i n g t o n 和r a s i s t t r i c k ( h e t h e r i n g t o na n dr a s i s t t r i c k ，19 31 ) 从桔青霉 ( p e n i c i l l i u mc i t r i n u m ) 培养物的过滤液中分离到了桔霉素自然界中有许多青霉 ( p e n i c i l l i u ms p p ) 和曲霉( a s p e r g i l l u ss p p ) 菌株