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中国蜂蜜抗氧化活性的研究 摘要 蜂蜜是蜜蜂将采集的植物花蜜或植物细胞渗出的蜜露，或昆虫排泄的甘露 混以蜜蜂唾液腺的分：物，经充分酿制而储藏在蜂巢的甜性物质。本文主要采 用体外抗氧化模型研览了中国蜂蜜的抗氧化活性。全文共分六章。作者的主要 贡献有以下四个方面： 1 、对中国1 枣花蜜 党参蜜 枸杞蜜 黄芪蜜。 在f e c l 3 k 3 f e ( c n ) 6 测定还原力的体系中，根据样品还原力的大小，溶液颜 色由黄色变成绿色或蓝色。样品中的还原性物质将f e 3 + 还原成f e “，并形成p e r l p r u s s i a n 蓝色化合物。此体系同时也提供了测定样品中具有还原性的酚类化台物 含量。因此，总酚含量高的蜂蜜还原力也相对较高，两者成呈诈相关关系。 2 3 3 蜂蜜对d p p h 自由基的清除作用 ( 1 ) 标准曲线 以d p p h 溶液吸光值和d p p h 溶液浓度进行线性回归，标准曲线见图2 - 3 求得回归方程和相关系数为：y = 0 0 3 8 6 x + 0 0 0 0 7 r = 0 9 9 9 8 o 香 谴 避 吸光值a ( s a 0 t l i n ) 图2 - 3d p p h - 标准曲线 结果表明，d p p h 溶液浓度在0 0 0 1 5 0 0 5 m g m l 范围内与吸光度有良好 的线性关系。 ( 2 ) 样品的测定 通过测定5 种蜂蜜在不同浓度下对d p p h 的清除作用，分析蜂蜜种类和浓 度对d p p h 清除作用的影响，实验结果见表2 - 4 和图2 - 4 、图2 5 。同时还测定 了1 4 种蜂蜜在同一浓度下对d p p h 的清除作用，实验结果见表2 5 。 表2 _ 4 不同浓度蜂蜜对d p p h 的清除作用( ) d p p h - 是一种十分稳定的自由基。d p p h 法是一种简单快速的自由基分析 方法，其原理是依据稳定自由基d p p h 在甲醇溶液中呈深紫色在5 1 7 n m 波长 处有一强吸收，自由基清除剂通过与其单电子配对使其颜色逐渐消失，褪色程度 与接收电子数成化学计量关系。因此，通过吸光度的变化可以衡量试样清除自由 1 9 基的能力。1 9 5 8 年，b l o i s 将其应用于抗氧化剂的筛选，此后国外又有许多学者 用此方法研究了羟基黄酮、单宁和黄酮类等的抗氧化作用。目前，d p p h 法已 被广泛用于自由基清除剂的筛选工作中【1 6 1 。 枣花枇杷党参枸杞黄苠 样品 【d p p i 】( g r a g ) 图2 4 不同浓度蜂蜜对d p p h 的清除作用图2 - 5 蜂蜜清除d p p h 的i c s 0 表2 - 4 和图2 。4 结果显示：5 种蜂蜜对d p p h 均有不同程度的清除作用，且 清除率随浓度的增加而增强。对曲线进行拟合求出各种蜂蜜的l c 5 0 值，i c 5 0 值表 示清除率为5 0 所需蜂蜜的克数。i c 5 0 值越小，表明对d p p h 清除效果越强。 总酚含量最高的枣花蜜和枇杷蜜有较高的清除率，i c 5 0 值分别为o 0 4 0 9 和0 0 5 7 9 ， 表明有较高的抗氧化能力；其次是党参蜜和枸杞蜜，i c s o 值分别0 1 1 9 9 和0 1 2 9 9 ； 黄芪蜜也有一定的抗氧化能力，但清除率较低，1 c 5 0 值为0 2 7 2 9 。 表2 - 5 不同种类蜂蜜对d p p h 的清除作用( o 2 9 m l ) 从表2 - 5 结果可知，1 4 种蜂蜜在浓度为0 2 m g m l 时荞麦蜜对d p p h 的清 除能力最强，清除率达9 1 5 4 ，清除率最低的为槐花蜜，仅为1 7 2 9 。不同种 类蜂蜜对d p p h t 的清除率相差较大，这不仅与其总酚含量有密切的关系，也与 巧 加 ：兮 o o 0 o 0 o o 所含酚类化合物结构有很大关系。结构不同自由基清除机理不同。酚类化合物主 要是通过提供氢原子清除d p p h ，但也有通过对金属离子螯合清除d p p h - 。同 时，抗氧化性的大小与抗氧化剂分子中有效羟基的个数及新生成自由基的稳定性 呈正相关。 2 3 4 蜂蜜对超氧阴离子自由基的清除作用 本实验采用光照核黄素法产生超氧阴离子自由基，研究了5 种蜂蜜在不同浓 废下对0 2 - 的清除作用，结果见表2 - 6 和图2 - 6 、图2 7 。同时还测定了1 4 种蜂 蜜在o 1 9 m l 浓度下对0 2 的清除作用，结果觅表2 7 。 表2 - 6 不同浓度蜂蜜对0 2 j 的清除作用( ) 枇杷枣花党参 枸杞 黄芪 浓度( g m 1 ) 图2 - 6 不同浓度蜂蜜对0 2 j 的清除作用图2 - 7 蜂蜜清除o z 的i c s o 超氧阴离子自由基不仅具有重要的生物功能，并且与多种疾病有密切联系。 它是基态氧接受一个电子后形成的第一个氧自由基，也是机体内寿命最长的自由 基，通常作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基。体内某些物质 自氧化可产生超氧阴离子自由基。线粒体呼吸链的电子传递过程中可产生0 2 ， 它可通过进一步反应生成毒性更大的羟基自出基1 1 7 l 。酚类化合物通过酚羟基与 n m 吣 嘶 叫 皿 肿 o o o 0 o o o o 0 2 反应生成稳定的半醌式自由基，从而终止自由基链式反应。 从图2 - 6 可知，5 种蜂蜜对0 2 均有较强的清除能力，随着加入浓度的增大， 对0 2 的清除作用也增强。5 种蜂蜜在一定浓度范围内对0 2 的清除作用呈现较 好的量效关系。根据拟合方程可求出0 2 清除率为5 0 时各种蜂蜜的浓度( i c 5 0 ) 。 由表2 - 6 可知，5 种蜂蜜对0 2 - 清除的i c s o 有所不同，i c 5 0 值越小，表明其对0 2 清 除能力越强，反之，则越弱。因而从5 种蜂蜜对0 2 。清除的i c s o 值可知，它们对 0 2 - 清除能力由强到弱的顺序为：枇杷蜜 枣花蜜 党参蜜 枸杞蜜 黄芪蜜。总酚 含量最高的枇杷蜜对0 2 清除能力分别是枣花蜜、党参蜜、枸杞蜜、黄芪蜜的1 2 5 倍、1 5 6 倍、1 6 5 倍和2 4 8 倍。 表2 - 7 不同种类蜂蜜对0 2 的清除作用( 0 1 9 m l ) 从表2 7 的结果可以看出，1 4 种不同种类的蜂蜜对超氧阴离子的清除作用差 别较大。在浓度为0 1 9 m l 时，清除能力最强的荞麦蜜清除率为9 3 7 8 ，是槐 花蜜清除率的3 2 1 倍。 2 3 5 蜂蜜对脂质过氧化的抑制作用 本实验通过f e s 0 4 诱导卵磷脂脂质过氧化，研究了不同浓度和不同种类的蜂 蜜对抑制脂质过氧化的影响，结果见表2 - 8 和图2 - 8 、图2 - 9 。 脂质分子是相当稳定的，在空气中不易发生氧化作用，可是一旦有活泼自由 基存在，就可导致脂质过氧化的发生。脂质过氧化是一个典型的自由基链式反应， 在光照或自由基作用下，可使脂质分子l h 脱去1 个氢原子形成月旨质自由基l ， 此脂质自由基再与氧反应形成脂质过氧化自由基l o o ，此过氧化自由基再进攻 其它脂质分子，夺取其氢原子，生成新的自由基和脂质氢化过氧化物l o o h ，此 反应可反复进行从而导致脂质分子的不断消耗和脂质过氧化物的大量生成。酚 类化合物的抗氧化作用机制是它们均将氢供给脂类化合物自由基，由于未成对的 电子可以在苯环上离域分布，自身转变成性质稳定的酚基自由基t 1 8 。 6 j 6 6 6 酚基自由基的稳定性降低了自动氧化链反应的传递速度，从而抑制脂类进一 步被氧化，起到抗氧化的作用。 表2 4 不同浓度蜂蜜对脂质过氧化的抑制作用( ) 冰 槲 墨 嚣 党参枣花枇杷黄芪枸杞 浓度( 嘞曲 图2 - 8 不同浓度蜂蜜对脂质过氧化的抑制作用 图2 - 9 蜂蜜抑制脂质过氧化的i c 本文采用f e 2 + ，抗坏血酸体系诱导脂质过氧化。铁盐存在下，卵磷脂会发生 无酶脂质过氧化反应。从图2 8 可知：5 种蜂蜜对脂质过氧化均有较强的抑制能 力，抑制率均在6 0 以上。在o l o m 【m l 浓度范围内，抑制率随浓度增长而变 化较快，之后，清除率增长缓慢。并且5 种蜂蜜在浓度为1 5 m g m l 时，抑制率 差别不大。抑制率最高的党参蜜为7 0 3 9 ，最低的枸杞蜜清除率仅比党参蜜低 9 3 0 。从5 种蜂蜜抑制脂质过氧化1 c s o 值可以看出各种蜂蜜的抑制能力大小依 次为：党参蜜 枣花蜜 枇杷蜜，黄芪蜜 枸杞蜜。山此可以看出各种蜂蜜对超氧 阴离子的抑制能力与总酚含量的多少和还原力的强弱关系并不明显。 表2 - 9 不同种类蜂蜜对脂质过氧化的抑制作用( 1 s m m l ) 从表2 - 9 结果可以看出，1 4 种蜂蜜对脂质过氧化均有一定抑制作用，但蜂蜜 种类不同，抑制能力也有所差异。在同一浓度下，五味子蜜清除作用最好，清除 率为7 3 0 4 ，苦豆子蜜清除率仅为4 0 7 5 。 2 3 6 蜂蜜对羟基自由基的清除作用 ( 1 ) 温育时间对清除羟基自由基的影响 通过测定荞麦蜜在不同温育时间下对羟基自由基的清除率，研究了温育时间对蜂 蜜清除羟基自由基的影响。实验结果见表2 1 0 和图2 1 0 。 表2 - l o 不同时间下蜂蜜对o h 的清除率( ) 奎 一 懈 篮 烬 时间( m i a l 图2 - 1 0 不同时间下蜂蜜对o r 的清除率 从图2 1 0 中可以看出，随着温育时间的延长，蜂蜜对o h 的清除率也逐渐 2 4 减小。当温育时间为l m i n 时，清除率为6 7 0 1 ，温育时间为5 r a i n 时，清除率 f 降了1 2 2 。温育时间为6 0 m i n 时，清除率仅为1 7 2 4 。 有些酚类化合物由于具有强还原力，在f e n t o n 反应体系会出现促氧化现象。 酚类物质能够将f e 3 + 还原成f e “，这样f e 2 + 又与h 2 0 2 反应生成新的o h ，形成 循环反应。c h e n g 进行了脱氧核糖方法的动力学研究【1 9 1 ，发现1 0 s 内，酚酸的还 原力表现不明显，但随着温育时闯的延长，酚酸的还原力增强。因此，用于评价 清除o h 传统的脱氧核糖法，采用温育6 0 r a i n 并不适用于那些具有还原力的酚类 化合物。而采用短时间温育，能够避免这一问题，比较准确的测定物质的还原力。 从还原力的测定实验可以看出蜂蜜具有很强的还原力，因此随着温育时间的延 长，出现促氧化现象。所以，在评价蜂蜜清除o h 的实验中采用温育l m i n 。 ( 2 ) 不同种类蜂蜜对o h 清除作用 本实验研究了5 种蜂蜜在0 l m g m l 浓度范围内对o h 的清除作用。实验 结果见表2 1 1 和图2 1 1 。同时测定了1 4 种蜂蜜在l m g m l 时的o h 清除率，结 果见表2 1 2 。 本文采用经典的2 脱氧d 核糖法产生o h 自由基，来检测蜂蜜的清除能力。 机理如下【2 0 】：加入的清除剂与脱氧核糖竞争和- o h 反应，从而保护脱氧核糖，使 其免于被o h 降解。而被o h 降解的核糖片段生成的丙二醛( m d a ) 与硫代巴 比妥酸( t b a ) 结合后呈红色，清除剂浓度越大，被o h 降解的核糖越少，溶液 的颜色越浅【2 1 1 。 表2 - 1 1 不同浓度蜂蜜对o i i 消除作用( ) 羟基自由基的化学性质非常活泼，可损伤蛋白质、核酸、脂质等多种生物大 分子，尤其对脂质过氧化的作用最强。o h 可直接作用于细胞膜上的不饱和脂肪 酸，引发不饱和脂肪酸过氧化反应并最终生成丙二醛1 2 “。酚类化合物能清除o h 是由于其提供了酚羟基上的氢，而使o h 还原。此外，盼类化合物还能通过对金 属离子的络合，降低f o n t o n 反应的速率，从而间接实现抗氧化作用。 术 v 瓣 畿 蜒 浓度( m g m l ) 图2 1 l 不同浓度蜂蜜对o h 清除作用 表2 1 1 表明：5 种蜂蜜对o h 均有一定的清除能力，但清除能力相对较弱。 浓度为l m g m l 时，5 种蜂蜜的清除率均未超过5 0 。各种蜂蜜的清除能力差异 不明显，枇杷蜜、枣花蜜和党参蜜的清除率只有1 左右的差别，黄芪蜜与枸杞 蜜的清除率只有o 0 2 的差别。同时，在0 0 2 5 m g m l 浓度范围内，清除率增 长迅速，之后增长平缓。这可能是由于随着蜂蜜浓度增加，其还原力也随之增加， 强还原性使f e 3 + 还原成f e 2 + ，f c 2 + 又与h 2 0 2 产生o h ，因此产生的促氧化作用抵 消了高浓度下蜂蜜水溶液对o h 的清除作用。郭远华曾报道凡茶素在碱性有f c “ 等二价金属离子介导的氧化体系中有自养化作用，能产生并促进o h 产生【矧。因 此蜂蜜仅在一定的浓度范围内对羟基自由基的抑制率较明显。 表2 - 1 2 不同种类蜂蜜对羟基自由基的抑制作用( 1 m g m l ) 从表2 - 1 2 的结果可知，1 4 种蜂蜜均对o h 有清除作用。浓度为l m g m l 时 荞麦蜜清除率最高，其余蜂蜜清除率差别很小，清除率都末超过5 0 。 2 - 3 7 蜂蜜抗氧化能力与总酚含量相关性分析 为了分析蜂蜜的抗氧化能力与其总酚含量之间的关系，对蜂蜜在不同自由基 体系中的抗氧化能力与总酚含量进行相关性分析，相关系数见表2 1 3 。 表2 1 3 总酚含量与蜂蜜抗氧化能力的相关性 根据表2 1 3 中的相关系数可知，总体来说，蜂蜜抗氧化活性与其总酚含量 呈正相关。在清除d p p h 和0 2 一的抗氧化体系和还原力的测定实验中，5 种蜂 蜜清除自由基能力与其总酚含量相关性较明显，相关系数分别为r = 0 9 2 ，r = 0 9 5 ， r = 0 9 4 。总酚含量较高的枇杷蜜和枣花蜜还原力最强，抗氧化能力也最强，而含 量最低的黄芪蜜还原力和抗氧化能力也最差。但在抑制脂质过氧化和清除o h 的 实验中，蜂蜜抗氧化活性与其总酚含量的相关性并不明显，相关系数分别为 r = 0 6 4 。r = 0 8 7 。在抑制脂质过氧化实验中，总酚含量最低的黄芪蜜在1 5 m g m l 时清除率并不是最低( 6 3 4 7 ) ，与清除率最高的枣花蜜只有6 9 2 的差距。在 清除o h 实验中，黄芪蜜的清除率也只比清除率最高的枇杷蜜低7 5 6 。 总之，蜂蜜具有抗氧化作用的成分除了酚类化合物以外还有抗坏血酸、类胡 萝h 素等。这些化合物对蜂蜜抗氧化活性的贡献仍然未知，蜂蜜抗氧化活性的强 弱可能与蜂蜜所含酚类化合物以外的某些抗氧化成分具有较大的关系。此外，各 种天然抗氧化成分往往具有协同增效作用，因此，有必要进一步研究蜂蜜抗氧化 活性与其所含抗氧化物质的内在关系，以深入了解蜂蜜抗氧化的机理。 2 4 结论 实验结果表明，1 4 种蜂蜜对d p p h 、0 2 、o h 和脂质过氧化具有一定的清 除作用。但不同自出基体系，蜂蜜的清除能力有所不同。蜂蜜对0 2 。的清除效 果较明显，清除率最高的枇杷蜜可达9 1 2 8 。而对- o h 的清除率仅为4 2 1 1 。 这是因为并非所有的酚类化合物都具有相同的清除自由基功效，而与酚类化合物 的具体结构有关，另外，蜂蜜中的抗氧化物质对不同类型的自由基也存在选择性 作用。蜂蜜所含总酚含量与不同自由基体系中的抗氧化能力呈f 相关，表明酚类 化合物是蜂蜜的主要抗氧化成分之一。 2 7 参考文献 1 h a l l i w e l l ，b f r e er a d i c a l s ，a n t i o x i d a n t s ，a n dh u m a nd i s e a s e ：c u r i o s i t y ，c a u s e ，o rc o n e s q u - e n c e l a n c e t ，1 9 9 4 ，3 1 1 ( 8 9 2 4 ) ：7 2 1 7 2 4 2 o a z z a n i ，g ，p a p e t t i ，a ，d a g l i a ，m p r o t e c t i v ea c t i v i t yo f w a t e rs o l u b l e c o m p o n e n t s o f s o m e c o m m o nd i e tv e g e t a b l e so nr a tl i v e rm i c r o s o m e sa n dt h ee f f e c to ft h e r m a lt r e a t m e n t ，a g r i c f o o dc h e m ，1 9 9 8 ，4 6 ( 1 0 ) ：4 1 2 3 4 1 ” 3 k a t m e r , j ，f r a n k e l ，e 。，g r a n i o ，r ，e ta 1 n a t u r a la n t i o x i d a n t si ng r a p e sa n dw i n e s a g r i c f o o dc h e m ，1 9 9 4 ，4 2 ( 1 ) ：6 4 6 8 4 b o m s e r ，j a ，s i n g l e t a r y k w ，w a l l i g ，m a i n h i b i t i o no f t p a - i n d u c e dt u m o rp r o m o t l o n i nc d 1 1m o u s ee p i d e r m i so fa p o l y p h e n o l i c 丘a c f i o nf r o mg r a p es e e d s c a n c e rl e t t ，1 9 9 9 ， 1 3 5 ( 2 ) ：1 5 1 1 5 7 5 f e l t e r e s ，f ，t o m a s - b a r b e r a n ，fa a nh p l ct e c h n i q u ef o rf l a v o n o i da n a l y s i si nh o n e y j o f t h es c i e n c eo f f o o da n da g r i c u l t u r e ，1 9 9 1 ，5 6 ：4 9 5 6 6 o y a i z u ，m s t u d i e so np r o d u c t so fb r o w n i n gr e a c t i o n s ：a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so fp r o d u c t so f b r o w n i n gr e a c t i o np r e p a r e df r o mg l u c o s a m i n e j a p a n e s ej o u r n a lo fn u t r i t i o n ，1 9 8 6 ，4 4 ： 3 0 7 3 1 5 7 l a r r a u r i ，j a ，s a n c h e z - m o r e n o ，c ，s a u r a - c a l i x t o ，fe f i e c t o ft e m p e r a t u r eo nt h eb e e r a d i c a ls c a v e n g i n gc a p a c i t yo fe x t r a c t sf r o mr e da n dw h i t eg r a p ep o m a c ep e e l s a g r i c f o o d c h e m ，1 9 9 8 ，4 6 ( 7 ) ：2 6 9 4 2 6 9 7 8 y o k o z a w a 。t ，d o n g ，e ，n a t a g a w a ，t i nv i t r oa n di nv i v os t u d i e so nt h er a d i c a ls c a v e n g i n g a c t i v i t yo ft e a a g r i c f o o dc h e m 。1 9 9 8 ，4 6 ( 6 ) ：2 1 4 3 2 1 5 0 9 b e a u c h a m p ，c ，f r i d o v i c h ，1 s u p e r o x i d ed i m u t a s e ：i m p r o v e da s s a y sa n da na s s a ya p p l i c - a b l et oa c r y l a m i d eg e l s a n a l y t i c a l b i o c h e m i s t r y ，1 9 7 1 ，4 4 ：2 7 6 - 2 8 1 1 0 t s u d a ，t ，w a t a n a b e ，m ，e ta 1 a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h ea n t h o c y a n i np i g m e n t se y a n i - d i n g3 - o - b d g l u c o s i d ea n d c y a n i d i n a g r i c f o o d c h e m ，1 9 9 4 ，4 2 ( 2 ) ：2 4 8 - 2 5 1 1 1 h a l l i w e l l b t h ed e o x y r i b o s em e t h o d ：as i m p l et e s t t u b ea s s a yf o rd e t e r m i n a t i o no fr a t e c o n s t a n t sf o rr e a c t i o no fh y d r o x y lr a d i c a l a n a l y t i c a lb i o c h e m i s t r y ，1 9 8 7 ，1 6 5 ：2 1 5 2 1 9 1 2 曹炜，索志荣f o l i n c i o c a l t a n 比色法测定蜂蜜中总酚酸的含量食品与发酵1 ：业， 2 0 0 3 2 9 ( 1 2 ) ：8 0 8 1 1 3 y e n ，g c ，d u h ，p d ，t s a i ，c lr e l a t i o n s h i pb e t w e e na n t i o x i d a n ta c t i v i t ya n dm a t u r i t y o f p e a n u th u l l s a g r i c f o o d c h e m ，1 9 9 3 ，4 1 ( 4 ) ：6 7 7 0 1 4 s i d d h u r a j u ，p ，m o h a n ，p s ，b e c k e r ，k s t u d i e so nt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fi n d i a n l a b u r n u m ( c a s s i af i s t u l al ) ：ap r e l i m i n a r ya s s e s s m e n to fc r u d ee x t r a c t sf r o ms t e mb a r k ， l e a v e s ，f o w e r s a n d f r u i t p u l p f o o d c h e m i s t r y ，2 0 0 2 ，7 9 ( 1 ) ：6 1 6 7 1 5 h u a n g ，d ，o u ，b ，p r i o r ，r l t h ec h e m i s t r yb e h i n da n t i o x i d a n tc a p a c i t ya s s a y s a g r i c f o o dc h e m ，2 0 0 5 ，5 3 ( 6 ) ：1 8 4 1 1 8 5 6 1 6 b u r d a s ，o l e s ，w a n t i o x i d a n ta n da n t i r a d i c a la c t i v i t i e so ff i a v o n o i d s a 鲥cf o o dc h e m ， 2 0 0 1 ，4 9 ( 6 ) ：2 7 7 4 2 7 7 9 1 7 赵保路氧白由基和天然抗氧化剂北京：科学山版社，1 9 9 9 1 8 y u a n ，x p 。w a n g ，j ，y a o ，h y a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ff e r u l o y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e s f r o mw h e a tb r a n ，f o o dc h e m i s t r y ，2 0 0 5 ，9 0 ( 4 ) ：7 5 9 - - 7 6 4 1 9 c h e n g 。z y ，l i ，y 乙，c h a n g ，w b k i n e t i cd e o x y r i b o s ea s s a ya n di t sa p p l i c a t i o ni na s s - e s s i n gt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fp h e n o l i cc o m p o u n d si naf e n t o n - t y p er e a c t i o ns y s t e m a n a l y “c ac h i m i c aa c t a ，2 0 0 3 ，4 7 8 ( 6 ) ：1 2 9 1 3 7 2 0 s m i t h ，c ，h a i l i w e l l ，b ，a r u o m a ，0 1 p r o t e c t i o nb ya l b u m i na g a m s tt h ep r o - o x i d a n ta c t i - o n so f p h e n o l i c d i e t a r yc o m p o n e n t s f o o dc h e m t o x i c ，1 9 9 2 ，3 0 ( 6 ) ：4 8 3 4 8 9 2 1 余莹栗武，魏东芝原花青素体外清除自由基活性的研究华东理工大学学报，2 0 0 2 ， 2 8 ( 3 ) ：3 1 8 4 2 0 2 2 秦德安，苏丹等橙皮苷对羟自由基的清除作用中国药学杂志，1 9 9 6 ，3 1 ：3 9 7 3 9 8 2 3 郭远华，邹国林儿茶素对超氧阴离子自由基的清除及其自氧化作用研究氨基酸和生 物资源，2 0 0 1 ( 2 3 ) ：1 0 1 2 第三章蜂蜜对氧自由基致小鼠组织氧化损伤的影响 3 1 前言 随着自由基生物学与自由基医学的迅速发展，现已证明许多疾病的发展与自 由基对组织的损伤有密切关系。组织中自由基代谢紊乱，过多的自由基会引发脂 质过氧化链式反应，造成细胞膜损伤，导致细胞功能改变，诱导衰老和多种疾病 发生。有大量研究表明酚类化合物能够保护氧自由基导致的动物组织损伤。如： 柿叶中的黄酮类化合物可以有效清除o h ，抑制小鼠红细胞膜，肝、肾、脾、脑 组织及肝线粒体、微粒体膜的氧化损伤【”。茶多酚中的表儿茶索没食子酸酯和表 儿茶素对a a p h 诱导的小鼠肝微粒体脂质过氧化有显著的抑制作用【2 】。m o h a m e d 也曾报道过也门的5 种蜂蜜能够抑制o h 诱导的猪肝匀浆脂质过氧化【3 1 。 关于中国蜂蜜保护氧自由基对动物组织损伤的报道较少，因此本文选用荆条 蜜和枇杷蜜2 种单花蜜，通过对o h 诱导的小鼠肝红细胞溶血、肝线粒体肿胀和 肝匀浆脂质过氧化抑制作用的研究，评价蜂蜜清除自由基的活性，保护组织免受 损伤的功效。 3 2 材料与方法 3 2 1 实验材料 ( 1 ) 材料：荆条蜜和枇杷蜜( 陕西老蜂农蜂业有限责任公司协助采集) ；小 鼠为i c r 系列( 陕西省中医药研究院实验动物研究中心提供) 。 ( 2 ) 试剂：硫代巴比妥酸( t b a ) 、抗坏血酸( v c ) 、硫酸亚铁( f e s 0 4 ) 、 三氯乙酸( t c a ) 、双氧水( h 2 0 2 ) 、盐酸( h c l ) 、三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) 、 柠檬酸三钠( n a 3 c 6 h 5 0 9 2 h 2 0 ) 均为国产分析纯试剂。 3 2 2 实验仪器 低温超速离心机( b e c k m a n ) ；组织捣碎机( 江苏保定仪表厂) ；t g l - 1 6 g 型 高速台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) 。 3 0 3 2 3 实验方法 3 2 3 1 蜂蜜对小鼠红细胞氧化溶血的抑制作用 ( 1 ) 红细胞悬浮液的制备 小鼠摘眼球取血，分离红细胞，生理盐水洗3 次，制成o 5 的悬浮液。 ( 2 ) 小鼠红细胞氧化溶血的测定【4 l 取红细胞悬浮液l m l ，加入不同浓度的蜂蜜水溶液，最后加入1 0 0 m m o l l h 2 0 2 启动反应。将混合物3 7 c 水浴1 h ，生理盐水稀释5 倍，1 0 0 0 9 离心1 0 r a i n ， 取上清液在4 1 5 n m 处测定吸光值。以模型组1 0 0 溶血度作对照组，计算样品的 溶血度与抑制率。 溶血度：生x 1 0 0 抑制率：墨二生x 1 0 0 a ia l a o a o 表示对照组的吸光值a 1 表示模型组的吸光值a 2 表示样品组的吸光值 3 2 3 2 蜂蜜对小鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用 ( 1 ) 肝组织匀浆液的制备 用引颈法处死小鼠，迅速取上述取血后小鼠的肝，用冷的生理盐水沈净后冰 浴下匀浆，制成0 5 的悬浮液。 ( 2 ) m d a 含量的测定【5 1 1 m l0 5 肝组织匀浆，加入不同浓度的蜂蜜水溶液，6 m m o l lf e s 0 4 1 0 0 i u l ，最后加入6 0 m m o l lh 2 0 24 0 t l 。混合物在3 7 c 水浴l h ，加入i m l1 0 t c a 结束反应。加入l m l0 6 7 t b a ，于沸水浴中显色1 5 r a i n ，冷却后离心， 取上清液在5 3 2 n m 测定吸光值。以吸光度表示m d a 含量，吸光值越大，m d a 含量越高。 抑制率：生二生x 1 0 0 a 1 表示模型组的吸光值4 2 表示样品组的吸光值 3 2 3 3 蜂蜜对小鼠肝线粒体肿胀的抑制作用 ( 1 ) 肝线粒体的制备1 6 1 取肝组织在冰浴下用o 2 5 m o l l 蔗糖溶液制成1 0 的匀浆，用b e c k m a n l 8 8 0 3 l 离心机的8 0 t i 转头3 0 0 0 r r a i n ，4 c 下离心2 0 r a i n ，所得沉淀用冷的0 2 5 m o l l 的 蔗糖溶液洗两次，合并上清液，用8 0 t i 转头1 0 0 0 0r m i n ，4 c 离心2 0 r a i n ，沉 淀用冷的0 2 5 m o l l 蔗糖溶液洗两次，合并上清液，所得沉淀即为线粒体。用 1 0 m m o l l t r i s h c i 缓冲溶液配成含蛋白质0 5 m g m l 线粒体悬浮液备用。 ( 2 ) 线粒体肿胀测定m 3 m l 肝线粒体悬浮液，加入5 m m o l lf e s 0 4 和0 1 m m o l l v c 激发线粒体肿 胀，另一组加入不同浓度蜂蜜水溶液，3 7 c 恒温水浴振荡反应1 h ，在5 2 0 n m 处 测定吸光值，光密度下降表示线粒体肿胀增加。计算线粒体肿胀抑制率。 抑制率：垒二生1 0 0 爿l a o a o 表示对照组的吸光值a 1 表示模型组的吸光值a 2 表示样品组的吸光值 3 3 结果与分析 3 3 1 蜂蜜对小鼠红细胞氧化溶血的抑制作用 本实验观察了枇杷蜜和荆条蜜对小鼠红细胞溶血的抑制作用，结果见图3 - 1 、 表3 - 1 和表3 2 。 术 模 纂 嚣 浓度 图3 - 1 蜂蜜对小鼠红细胞氧化溶血的抑制作用 上清滚光密度的测定值实际上反映红细胞在体岁 温育过程中产生氧化溶血 的情况，光密度值越大，说明了红细胞氧化溶血越严重，反映了样品的抗氧化能 力越弱。结果表明，模型组值与f 常组值有显著差异，况明h 2 0 z 可以诱导红细 胞氧化溶血。样品组吸光值与模型组相比，均显著低于模型组，表明两种蜂蜜在 不同浓度下对小鼠红细胞氧化溶血均有一定的抑制作用。随着样品浓度的增加， 小鼠红细胞溶血度下降，抑制率增加，呈现出一定的量效关系。从图3 1 可以看 出，枇杷蜜的抑制率在0 0 1 o 1 9 m l 整个浓度范围内都增长较快，当浓度为 0 1 9 m l 时，抑制率为7 9 8 9 。荆条蜜在0 0 1 0 0 2 5 9 m l 浓度范围内，抑制率 增长较快，且高于枇杷蜜。但在o 0 2 5 0 1 9 m l 浓度范围内，抑制率增长缓慢， 当浓度为o 0 7 9 m l 左右时，抑制率低于枇杷蜜。 袭3 - 1 枇杷蜜对小鼠红细胞氧化溶血的抑制作用 大量研究表明，红细胞不仅在体内每天都有一部分发生自身氧化解体，在体 外温膏过程中同样可产生氧化溶血反应【8 l 。红细胞在其氧化过程中产生了大量的 氧自由基，除了加速血红蛋白的氧化外，还可以使膜脂质发生过氧化反应加速溶 血i9 1 。成熟的红细胞中氧合血红蛋白可通过自氧化生成高铁血红蛋白，f 常情况 下，高铁血红蛋白的比率为3 ，但氧合血红蛋白持续的自氧化可产生0 2 一，经 过一系列反应在f e “的催化下产生毒性更大的o h 。运动中由于机体需氧量大增， 红细胞载氧量也增加，这样血红蛋白自氧化和自由基的产生可能按比例增加，从 而导致红细胞氧化损伤加剧【l0 1 。氧自由基对红细胞造成的结果是：( 1 ) 使蛋白酶 变性，引起蛋白质的功能丧失和酶的失活；( 2 ) 使蛋白分解和酶解反应速度加快； ( 3 ) 通过双硫键使蛋白质交联。从而改变2 l 细胞的功能。 本实验用h 2 0 2 诱导红细胞氧化溶血来研究蜂蜜对小鼠红细胞氧化溶血的抑 制作用。结果表明正常的红细胞在体外温育过程中有轻微的溶血现象，这与报道 的结果一致 8 1 ，h 2 0 2 可使溶血加重，蜂蜜可以抑制小鼠红细胞氧化溶血，效果显 著，这可能与蜂蜜能够抑制o h 的生成有关。 3 3 2 蜂蜜对小鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用 m d a 为脂质过氧化产物，其生成的多少可以反映组织细胞的受损程度。 实验测定了蜂蜜对小鼠肝匀浆中m d a 生成的影响。结果见图3 2 和表3 - 3 。 冰 斟 * 髦 浓度( g m l ) 图3 - 2 蜂蜜对小鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用 表3 - 3 蜂蜜对小鼠肝匀浆腊质过氧化的抑制作用 由表3 3 结果显示，模型组与正常组相比，丙二醛的生成量显著增加，说 明o h 可使小鼠肝脏脂质过氧化加速，肝脏受损程度较为严重。加样组与模型组 相比m d a 的含量显著下降。当蜂蜜浓度为0 1 9 m l 时，枇杷蜜和荆条蜜对肝匀 浆脂质过氧化的抑制率分别为5 5 7 9 ，6 0 1 3 。并且随着两种蜂蜜浓度的增加， 抑制率增加迅速，呈一定量效关系。 肝脏具有丰富的酶性抗氧化剂，而且也是一个具有微粒体和线粒体系统的在 正常代谢过程中能产生活性氧自由基的器官。当自由基产生和抗氧化能力的平衡 被打破时，就有可能发生组织损伤。在各种肝脏疾病中均存在着自由基引发的损 伤。同时m d a 是脂质过氧化的产物，它可以和游离氨基的蛋白质、磷脂酰乙醇 胺及核酸进行多次交联，联接成比原来大许多倍的大分子，致使膜蛋白变性，膜 酶失活，膜受体失效，出现膜结构破坏，膜流动性下降，膜脆性和通透性增加， 导致生物膜结构和功能的异常，影响机体的物质代谢，能量代谢和信息传递，从 而危急正常的生命活动。 因此，本文采用体外实验，研究蜂蜜对f c “和h 2 0 2 诱发的小鼠肝匀浆脂质 过氧化的抑制作用。从实验结果可以看出，蜂蜜能够有效的抑制m d a 的生成， 减缓脂质过氧化，保护细胞膜的完整性，从而有效得保护小鼠肝组织免受损伤。 3 3 3 蜂蜜对小鼠肝线粒体肿胀的抑制作用 本实验采用f e s 0 4 v c 诱导线粒体肿胀，观察了枇杷蜜和荆条蜜对小鼠线粒 体肿胀的影响，结果见表3 - 4 和图3 - 3 、图3 - 4 。 线粒体肿胀程度与线粒体的生理和病理性反应有关，过度的肿胀则是线粒体 结构损伤的表现【1 2 l 。本实验将新鲜的线粒体与f e s 0 4 和v c 温育后，观察了5 2 0 n m 处光密度值随时间的变化情况。 表3 - 4 蜂蜜对小鼠肝线粒体肿胀的抑制作用 表3 - 4 数据表明，两种蜂蜜在不同浓度下对小鼠肝线粒体肿胀均有一定抑制 作用。荆条蜜在浓度为0 0 2 5 9 m l 时，抑制率达9 5 8 3 ，表明荆条蜜在此浓度 下抑制作用显著。从图3 3 和图3 - 4 可以看出，随着温育时间的延长，模型组的 光密度下降很快，加入蜂蜜的样品组的光密度下降趋势减缓。但是，两种蜂蜜都 出现了促氧化作用。枇杷蜜在浓度为0 0 7 5 9 m l 时，光密度下降趋势在研究的浓 度范围内下降最快，并且抑制率最低( 4 0 6 3 ) 。荆条蜜在浓度为0 0 7 5 9 m l 时， 抑制率为6 4 5 8 ，低于0 0 2 5 9 m l 时的抑制率，且光密度下降趋势快于 0 0 2 5 9 m l 。卢景芬等人通过自旋标记e s r 的实验结果表明某些黄酮化合物能损 伤人红细胞膜的膜蛋白构象，这种损伤可能是氧化性的损伤，并且损伤程度与黄 酮类化合物的分子结构与浓度大小有关1 1 3 l 。 图3 - 3 枇杷蜜对小鼠肝线粒体肿胀的抑制作用 十n i 常纰 d 一0 0 5 e c m l 时f 司( m t n ) 图3 - 4 荆条蜜对小鼠肝线粒体肿胀的抑制作用 线粒体是细胞内最重要的细胞器官之一，是氧化磷酸化能量代谢生成a t p 的主要部位。实验表明，线粒体在许多生理或病理情况下，可作为细胞凋亡的感 受器及放大器，对细胞的存活起重要的调控作用。f e s 0 4 v c 诱导线粒体肿胀的 原因是由于膜的脂质过氧化作用，使膜构造改变，膜的屏障功能丧失，膜内外离 子交换受阻。实验结果表明，蜂蜜能够降低线粒体膜脂质过氧化程度，从而减小 线粒体肿胀度，保护肝线粒体功能的正常发挥。 3 a 结论 荆条蜜和枇杷蜜均能够抑制h 2 0 2 诱导小鼠红细胞氧化溶血。随着蜂蜜浓度 的增加，小鼠红细胞溶血度下降，抑制率增加，呈现出一定的量效关系。荆条蜜 和枇杷蜜能够减缓f e 2 + 和h 2 0 2 诱导的小鼠肝脏脂质过氧化，有效的抑制m d a 的生成，抑制率与蜂蜜浓度呈一定量效关系。荆条蜜和枇杷蜜能够有效抑制v c 和f e s 0 4 诱导的线粒体肿胀。浓度为0 0 7 5 9 m l 时两种蜂蜜均出现促氧化现象。 参考文献 1 杨建雄，原江锋，李发荣柿叶黄酮的体外抗氧化作州营养学报，2 0 0 3 ，2 5 ( 2 ) ：2 1 5 2 1 7 2 c a i ，y j ，m a ，l p 。h o u ，lf ，z h o u ，b ，e ta 1 a n t i o x i d a n te f f e c t so fg r e e nt e ap o l y p h e n o l so nf r e er a d i c a li n i t i a t e dp e r o x i d a t i o no fr a tl i v e rm i c r o s o m e s c h e m i s t r i s t r ya n dp h y s i c s o f l i p k l s 。2 0 0 2 ，1 2 0 ( 2 ) ：1 0 9 - 1 1 7 3 a l ，m a m a r y a ，m ，a l - m c e 曲a ，a i - h a b o r i b ，m a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sa n dt o t a lp h e n o l i c s o fd i f f e r e n tt y p e so fh o n e y n u t r i t i o nr e s e a w h ，2 0 0 2 ，2 2 ( 9 ) ：1 0 4 1 1 0 4 7 4 田京伟，杨建雄向蘩芦醇的体外抗氧化活性中草药，2 0 0 3 ，2 4 ( 2 ) ：1 2 1 1 2 6 5 曹炜，尉砸军，杨建雄蜂胶对氧自由基和四氧嘧啶致小鼠肝脏损伤的保护作用中草 药2 0 0 1 3 2 ( 1 1 ) ：1 0 1 3 1 0 1 5 6 手建华，张诧，甘璐幸句杞多糖1 对羟自由基所致小鼠肝线粒体损伤的作捌。中国药学杂 志，