（细胞生物学专业论文）nfκb结合蛋白pax5对nfκb靶向基因调控的选择性作用.pdf

摘要 摘要 转录因子n f k b 在炎症和免疫反应、细胞牛长和增殖、以及细胞凋亡中都起到 十分重要的作用。作为介导分予，n f k b 通过参与调节下游基因的表达以及蛋白 蛋白相互作用而在许多重要信号通路中起着作用。n f k b 除了参与重要牛殚功能外， 还发现在肿瘤、风湿等重大疾病的发生和发展中起重要和关键性的作用。 已发现n f k b 参与约两百多个基因的转录调控。另外，在应对外界各种刺激时 n f k b 可与1 2 0 多种蛋白发牛相瓦作用。大量的研究发现，n f 1 出结合蛋白能够通 过与n f k b 蛋白亚基相互作用起到调节n f k b 转录活性的作用。因此认为一种可 能性机制是，n f k b 结合蛋白可能通过与n f k b 相瓦作用并调节n f k b 的转录活 性，而在n f k b 转录调节的细胞或基因特异性方面起到重要的作用。 核转录因子p a x 5 是b 系早期前定向细胞( p r e b ) 到成熟b 细胞( m a t u r eb ) 阶段特异性表达的蛋白，在细胞定向发育方面起关键的调节作用。p a x 5 一方面抑 制b 系发育中不适合基因( 如x b p 1 、m c s f r 和n o t c h l ) 的表达；同时激活b 系 特异性基因( 如c d l 9 和b l i m p 1 等) 的表达。此外还发现p a x 5 在多种肿瘤中非 正常表达及参与肿瘤的发生和发展，其中包括脑肿瘤如星型胶质瘤细胞和多发性骨 髓瘤等。 在本课题的研究中，结合r n a i 和d n a 基因芯片技术，我们筛选和鉴定了p a x 5 调控的部分重要基因，其中包括p 5 3 、c m y c 和x b p 1 等参与细胞凋亡，细胞周期 和分化的基因。深入研究发现，p a x 5 可直接通过参与p 5 3 基因的转录调控来抑制 p 5 3 的基因表达，从而导致细胞的抗凋亡和增殖。结果迸一步阐释了p a x 5 在肿瘤 中的作用。 关键词：n f k bp a x 5信号转导 细胞凋亡癌恶性肿瘤 p 5 3c m y c x b p 1 摘要 a b s t r a c t 量j f k bh a sb e e nf o u n dt op i a ya ni m p o 九a n tr o i ei ni n f l a m m a t i o n ，i m m u n o l o g y r e s p o n s e ，c e l lg r o 、v t h ，p r o ii f e r a t i o na n da p o p t o s i s i ti sc o n s i d e r e da sam e d i a t o rt h a t i n v o i v e di nm a n yi m p o r t a n ts i g n a l i n gp a t h w a y st h r o u g hr e g u l a t i n gi t sd o w n s t r e a mt a r g e t g e n e sa n dp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n s i na d d i t i o nt o i t si n v o l v e m e n to fp h y s i o i o g i c a l p r o c e s s ，n f k bi sa l s oi n d i c a t e di nt h ed e v e l o p m e n to fm a n yd i s e a s e ss u c ha sc a n c e ra n d r a t h e r ea r ea b o u t2 0 0g e n e sh a sb e e nr e c o g n i z e da sn f - k b d r i v e ng e n e st h a tt h e i r t r a n s c f i p t i o n a lr e g u l a t i o na r ed e p e n du p o no f n f k ba c t i v i t y m o r e o v e r t h e r ea r em o r e t h a n12 0c e l l u l a rp r o t e i n sc a nj n t e r a c tw i t hn f - k bi nv a r i o u sc e i l si nr e s p o n s et ov a r i e t y s t i n l u l u s n u m b e r so fi n d i v i d u a ls t u d i e sh a v es u g g e s t e dt h a tn f k ba s s o c i a t e dp r o t e i n c a ni n f l u e n c et h et r a n s c “p t i o na c t i v i t i e so fn f - k bt h r o u g hi n t e r a c t i n gw i t ht h es u b u n i to f n f - ( b t h u s ，ap o s s i b l ec o m m o np r i n c i p l ei st h a tn f k b a s s o c i a t e dp r o t e i n sp l a ya r o l e i nd e t e r m i n et h ec e l lo r a n dg e n es p e c i n c i t yo f n f k bt a 唱e t e dg e n e se x p r e s s i o nt h r o u g h i n t e r a c t i o na n dm o d u l a t i n gt h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo fn f k b t h et r a n s c r i p t i o nf 配t o rp a x 5i se s s e n t i a if o rc o m m i t m e n to fl y m p h o i dp r o g e n j t o r s t 0 也ebl y m p h o c y t el i n e a g e p a x 5f u l f i i sad u a lr o l eb yr e p r e s s i n gbl i n e a g e i n a p p r o p r i a t e g e n e s ( e g x b p 一1 ，m c s f r ，n o t c h1 ) a n ds i m u l t a n e o u s l ya c t i v a t i n gb l i n e a g e _ s p e c i f l cg e n e s ( e g c d19 ，b l i m p - 1 ) a b n o 肿a le x p r e s so fp a x 5h a sb e e n i n d i c a t e di nan u m b e ro fc a n c e r ss u c ha sb r a i nm a li g n a n c i e s ，a s t r o c y t o m aa n di n v o i v e d i nt h et u m l o r i g e n e s i s 要nt h ep r e s e n ts t u d y ，w eh a v em a p p e dt h ee x p r e s s i o np r o f i l eo fap a n e io fi m p o r t a n t g e n e sb yah i g h r e s o l u t i o nd n am i c r o a r r a yi nap a x 5k n o c k d o w nm ul t i p l em y e l o m a c e l l1 i n ea n df o u n dt h a tp a x 5r e g u l a t e dg e n e si n v o l v e di nv a r i o u sb i o l o g i c a lp r o c e s s e s i n c i u d i n ga p o p t o s i s ， c e l l c y c l e a n dd i f 俺r e n t i a t i o n f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s o nt h e t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no fp 5 3t h a tw a ss i g n i n c a n t i yu pr e g u l a t e di ni ) a x 5k n o c k d o w n c e l l ，r e v e a l e dt h a ti tw a si n d e e ds u p p r e s s e db yf ：a x 5t h r o u g ht r a n s c r i p t i o n a lr e g u i a “o n m 0 r e o v e r ，p a x 5k n o c k d o w nc e l ls h o w e da n n c r e a s e da p o p t o s i sa n ds l o wg r o w t hr a t e s t h a nt h ec o n t r o lc e l i ，p a r t i c u l a r l yi n c r e a s e ds e n s i t i v i t yt oa n t i c a n c e rd m g s ，i m p l i c a t i n g t h a tj 巳x 5m e d i a t e dp 5 3s u p p r e s s i o n ，a tl e a s tp a r t i a l l y ，p r o m o t et h ea n t i - a p o p t o s i sa n d i i 摘要 p r o l i f e r a t i o na c t i v i t yi nm u l t i p l em y e l o m a k e yw o r d s ：n f k b ，p ：a x 5 ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，c e l la p o p t o s i s ，c a n c e r ，m a l i g n a n c y ， p 5 3 ，c m y c ，x b p - l i i i 论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名： 年月日 论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名： 年月日 第l 章绪论( 文献综述及课题背景介绍) 第一章绪论( 文献综述及课题背景介绍) 1 1 转录因子n f 1 c b 1 1 1 概述 最近的二十年里，转录因子n f k 8 成为许多重要的研究工作所关注的焦点，这 是因为n f k b 不仅在炎症反应和免疫系统中起到重要的作用，同时还在肿瘤发生， 对于d n a 损伤的反应，对于外界信号刺激的响应以及细胞增殖等方面发挥作用。 在生物学效应方面，n f k b 作为转录因子既调节细胞的牛长，分化，增殖，同时也 参与调节细胞的免疫应答机制。大量的工作发现n f k b 在细胞凋亡的过程中起到重 要作用，但是这种作用却是同时存在于两个对立的方面，在血液细胞中n f 。k b 能够 诱导抗凋亡作用，而在很多的上皮类细胞中n f k b 更多的参与诱导凋亡的过程，对 于肿瘤细胞而言，n f k b 的作用更加的多样化，既能促进癌细胞增长，抑制细胞凋 亡( f r e u d 】s p e r g e rc ，2 0 0 8 ) ，同时也在一定情况下诱导细胞凋亡( l e es h ，2 0 0 7 ) 。 同样地，n f k b 还能够调节许多免疫系统以外的基因表达，因此可以影响正常 组织或疾病组织生理功能的各个方面。关于n f k b 有无数相关的研究工作，但作者 针对于这一课题更多地将关注于n f k b 在转录调节上的分予机制，以及与其他转录 因子相互协同作用调节某一些具体的基因表达的机制。 1 1 2n f 1 c l 家族 n f k b 蛋白家族由五个成员组成( s a n k a rg h o s h ，2 0 0 2 ) ，即p 6 5 ( r e l a ) ，r e l b ， c r e l ，p 5 0 p 1 0 5 洲f k b1 ) 和p 5 2 p 1 0 0 洲f 1 ( b2 ) ，这些蛋白质都是有一个约3 0 0 个氨 基酸组成的氨基末端，称为r e l 同源区，包括d n a 结合部位，二聚化部位，k b 抑 制蛋白结合区及核定位序列，相互之间能够形成同二聚体或异二聚体，并且在静息 的细胞中n f k b 和i k b 家族蛋白结合在一起，n f k b 的转录活性被抑制。n f k b 蛋白n 端的r e l 同源结构域( r h d ) 功能在于参与n f 1 ( b 蛋白的二聚化，并且能够结 合d n a ，n f k b 蛋白通过r h d 和i k b 结合。n f k b 与i k b 的结合形成n f k b ：1 1 c b 复合物，这一复合物因为核定位信号洲l s ) 被掩盖，不能转移到核内发挥转录活性， 因此留在胞浆内处于非激活状态。当i k b - a l p h a 被降解后，该状态被打破，因为降 解作用去除了l l ( b a l p h a 上的n e s 的功能，而同时将p 6 5 上的n l s 释放出来，促 第l 奄绪论( 文献综述及课题背景介绍) 使了p 6 5 p 5 0 向核内的转移。i k b 的降解有着精细的调控机制，是由活化的i k bk i n a s e ( i k k ) 特异性的磷酸化作用所启动的。 图1 ：n f k b ，i k b ，l k k 蛋自家族成员 n o t e ：r h d ，r e fh o m o l o g yd o m a i n ；下a d ，t r a n s a c t i v a t i o nd o m 撕n ；l z ， l e d c i n ez i p p e rd o m a i n ；g r r ，g l y c j n e - r i c hr e g i o n ；h l h ，h e l i x l o o p - h e l i x d o m a i n ；z ，z i n cf i n g e rd o m a i n ；c c l 2 ，c o i l e d - c o i ld o m a i n s ；n b d ， n e m 0 - b i n d i n gd o m a i n ：m o d u b d ，m i n i m a lo l i g o m e r i z a t i o nd o m a i na n d u b i q u i t i n - b i n d i n 2d o m a i n ：a n dd d ，d e a l hd o m a i n 1 1 3n f k b 信号通路 在传统的细胞生物学中，将n f 。k b 信号通路分成两类，即经典的( c l a s s i c a l ) 信通 路和替代的( a l t e m a t i v e ) 信号通路。经典的信号通路指细胞接受到上游来自t n f r l 2 ， t c r 和b c r ，t l r i l 1r ，g f r s 等受体信号，活化i k bk i n a s e ( 1 k k ) 后，对于p 5 2 的产生和p 5 2 n f k b 复合物的释放起到重要作用。i k b 被降解之后，n f k b 释放出 来，进入核内结合在含有k b 位点的肩动了或者增强_ 了区域，保守序列是 第l 帝绪论( 文献综述及课题背景介绍) g g g r l 州y y c c 。n f k b 二聚体的晶体结构展示了i g 1 i k e 结构域组成的r h d 和 k b 位点上d n a 的相互结合。n f k b 通过n 端的i g 1 i k e 结构域识别特异性的序列， 而c 末端结构域的疏水残基形成了二聚化的交界面。r e l b ，c r e l 和p 6 5 在c 端有一 个转录激活结构域( t a d ) ，对于n f k b 蛋白的转录活性十分重要。实际上p 5 2 或者 p 5 0 的二聚体结合在k b 位点上会抑制一些基因的表达，p 5 2 和p 5 0 这些抑制的功能 提示n f 1 c b 的转录活性可以通过表达和加工p 1 0 0 和p 1 0 5 这两个蛋白前体来得到调 节。同样当n f k b 被化学修饰之后，例如磷酸化，乙酰化，t a d 的功能和活性被 大大提高了，这是在另外的一个层面上调节n f k b 介导的转录应答。 在非经典信号通路中，细胞接受的上游刺激是来自l t b e t a r ，b a f f r ，和 c d 4 0 r ，通过n i k 激活i k k a l p h a ，然后磷酸化p 1 0 0 ，之后p 1 0 0 被泛素化降解成 p 5 2 ，被释放的r e l b p 5 2 复合物进入核内，调节转录过程活化的n f k b 能够结合在 一些基因的启动予或者增强予区域的特定序列上，激活下游基因的转录。同时n f k b 能够诱导i k b a l p h a 的表达，增强n f k b 向核外的转运，这对于n f 1 ( b 信号通路的 激活起到负反馈的效果。 1 1 4 激活n f 1 c b 的上游信号 众多的信号通路能够导致n f 1 c b 的激活( m a t t h e ws h a y d e n l ，2 0 0 8 ) ，通过活 化i k k ，降解i k b ，增强n f k b 的转录活性。然而不同路径对于n f k b 的激活却有 本质的不同，例如由肿瘤坏死因予受体l ( t n f r l ) 接受t n f a l p h a 刺激所产生的激活 在i o 分钟中内就能完成i k b a l p h a 的降解，而来自t 细胞受体( t c r ) 的信号却要在 4 5 分钟才起作用。而且不同的路径活化不同的n f k b 二聚体，自然导致不同的下 游基因转录。因此n f k b 的活化有很大程度的细胞特异性，特别是在免疫细胞和肿 瘤细胞中有很大的差别。研究得最为透彻的是t n f r ，t l r i l 1 r ，t c r 和b c r 介 导的上游活化路径( 如图2 所示) 。 l 、t n f r 途径 t n f r 途径激活n f k b 是最为经典的n f k b 上游活化通路，研究得也最为广泛。 t n f r 超家族至少包括l9 个配体和2 9 个受体，这些反应主要通过如n f k b 和a p - 1 等可诱导的转录因子的激活。 2 、t o l l i l 1 受体( t i r ) 信号通路 n f k b 对于通过t o l l 样受体( t l r ) 介导信号传递的早期天然免疫应答有着重 要作用。t l r 的信号传递需要通过下游的一些接头分了( a d a p t e r ) ，m y d 8 8 是第一个 具有t 0 l l i l l 受体( t i r ) 结构域的接头分子，能够通过同源作用和t l r i l 一1 受体胞 第l 章绪论( 文献综述及课题背景介绍) 内区的t i r 结构域相互结合，并在由i l l ，i l 1 8 以及l p s 引起的n f k b 的激活中 起到重要作用。 3 、l y m p h o t o x i n - b e t ar ，b a f f r 以及c d 4 0 介导的信号通路 l t _ b e t ar ，b a f f r ，c d 4 0 虽然同样是t n f r 家族成员，但是在活化n f k b 时是 通过非经典的信号途径。 4 、b c r 和t c r 信号通路 由b c r 和t c r 引发的信号传递，对于适应性免疫反应来讲异常重要。n f k b 的激活能够使得淋巴细胞进行抗原特异性扩增和成熟并转变成效应细胞。由t c r 和 b c r 引发的信号传递在很大程度上有相似之处，虽然存在一些分子上的差异。 。墨鬻。黟 ，意甜 ： 、tt r # 稍川目 淼葡：二麟i 爱鬻缪 ； 黪黧琴熬餐簌雾囊i 薹黟掣黪。 i i 谚誊 i 。| | 紫。 拳二曩妒 r 一”j lk y m # 嚼口o n # 瓣1 j f l 蚰珂蝴蛳引i 嘲钒j 啪秘锄渤1 渤，f 谢耐，p 涮懒a 啦8l bc 酬船倦t l o n 图2 ：n f 一1 ( b 信号通路概况 第l 章绪论( 文献综述及课题背景介绍) 1 1 5n f 1 c b 的生物学功能 n f 1 c b 进入细胞核内后诱导许多因子的转录，包括细胞因了：t nf i f n b ，i l 1 b ，i l2 2 和l l2 6 等：趋化因子：i l2 8 ，r a nt e s ，巨噬细胞趋化性肽；粘附分了： e 选择素，i c a m 1 ，v c a m 1 ：急性反应期蛋白：c 2 反应蛋白，补体b f 、c3 ，a 1 2 酸 性糖蛋白；生长因子：i l2 3 ，g m c s f ，g c s f ，m c s f ；膜分子：e d g 2 ，g j a l ， h m o x l ，r h o a ，v a p a ；配体和受体：f 2 r ，l t b r ，t i c a m 2 ，t n f r sf ，t n f sf ，t r i f ； 免疫受体：免疫球蛋白k a p p a 轻链、i 类丰要组织相容性复合物、t 细胞受体b e t a 链；炎性酶：诱导性一氧化氮合酶( n os ) 、i i 型环氧酶、1 2 脂氧酶、磷脂酶a2 ；激 酶：a k t l ，c c l 2 ，m a p 3 k l ，m a p k 3 ，m a p k 8 ；转录因了：i k b a i p h a ，p 1 0 5 ，p 1 0 0 ， c r e i ，b c l 一3 ，e g r l ，e l k l ，f o s 。 n f 1 ( b 与凋亡关系十分密切。n f k b 能刺激i l 一1 b e t a 转化酶蛋白酶、c m y c 、 t n f - a l p h a 基因的表达，从而引起细胞凋亡。但是又有大量的证据表明，n f k b 有抗 凋亡作用，例如n f k br e l a 基因敲除小鼠因大面积肝细胞死亡导致了胚胎致死， n f k b 通过激活抗凋亡基因t r a f l ，t r a f 2 ，c i a p l ，c i a p 2 阻断半胱天冬酶 ( c a s p a s e 8 ) 的激活，从而介导细胞存活。其原因可能是不同的n f k b 组成介导不同的 信号，导致细胞生或死，也可能n f k b 引起凋亡或抗凋亡依赖于细胞类型或外界刺激 激活的信号途径是同时还是不同时进行。 越来越多的证据表明，n f k b 不仅与b 细胞发育和功能有关，还与t 细胞、胸 腺细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、神经元的发育和功能有关。n f k b 也参与细胞的 周期调控。 n f k b 可以引起哮喘、类风湿性关节炎、牛皮癣、肠炎等许多慢性炎症性疾病 炎性蛋白的表达。以哮喘为例，炎性因子i l 1 b e t a ，t n f a l p ha i l 2 2 ，i l 2 6 可以加重 气道的炎症，g m c s f 延长酸性粒细胞的存活时间，i n o s ，c o x 2 ，p l a2 等酶增加 炎症中介物的产牛。这些蛋白的表达均由n f k b 调节。n f k b 与许多病毒和非病毒 的恶性肿瘤有关，如t b 细胞淋巴瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌等。绝大多数资料显示， n f k b 导致癌症的发生是因为细胞因子或其受体基因转录的激活，这样促进了非 调节性淋巴细胞的生长或阻断了凋亡。此外，n f - k b 直接作用于细胞周期和d n a 复 制也可能会导致癌症的发生。体外实验表明，化疗和放疗能激活n f k b 的转录是诱 导性肿瘤化疗耐药性的主要机制，抑制n f k b 能促进肿瘤细胞发生凋亡。 1 2n f - 1 ( b 结合蛋白 第1 章绪论( 文献综述及课题背景介绍) 1 2 1n f k b 基因调节特异性的分子基础 尽管n f k b 的上游活化通路在不同细胞中几乎没有差别，但活化后的n f k b 在 特定豹条件或时段内可以靶向作用的基因却有不同，引起的牛物效应亦不同。例如， r r n r a i p h a 可通过激活n f k b 而提高f a s 的表达来诱导细胞的凋亡。但在肿瘤细胞中， n f - k b 成为抗细胞凋亡的诱导因子而导致肿瘤的抗药性。另外，n f k b 可诱导多种 细胞因子的表达( 如i l 6 、i l 8 、t n f _ a l p h a 、v e g f 、l f n g a m m a 等) 。但有时，n f k b 只对其中一部分进行调节如i l 。6 和i l 8 ，而几乎不影响其它的因子的表达。上述现 象说明，n f 1 ( b 对基因表达的调控具有选择性。即特定的细胞中及条件下，只有一 部分基因受到n f k b 的调节。提示在很多疾病中所见n f k b 靶向基因的异常表达很 有可能是n f k b 的这种靶向选择性出现紊乱的结果。 综合近期的研究进展发现，n f k b 对靶基因的选择性调控可能与下述三个因素 有关，但其中n f 1 ( b 结合蛋白可能起到更关键的作用。 1 、不同n f k b 二聚体对靶基因调控予的选择性结合：n f k b 家族共有5 个成员， 通常以家族成员间形成二聚体的方式存在并发挥其转录因了的活性( 如复合物 p 5 0 ：p 5 0 、p 6 5 ：p 5 0 、及r e l b ：p 5 2 等) 。由于这些二聚体对不同基因启动予中的特异性 d n a 结合位点具有不同程度的亲和力，因此可通过激活不同二聚体而选择性的使一 部分基因受到调节。这一选择性调节方式被发现在免疫系统中可能起到区分天然免 疫和获得性免疫的作用。 2 、n f k b 亚单位蛋白的翻译后修饰改变与靶基因的结合能力：磷酸化或乙酰化 修饰可改变n f 1 出与启动予d n a 的结合能力。在n f k bp 6 5 蛋白分子上已发现至少 有四个磷酸化及五个乙酰化位点可被不同的磷酸激酶( k i n 2 l s e ) 或辅助活化物 ( c o t i v a t o r ) 磷酸化或乙酰化。这些磷酸化或乙酰化修饰又会对n f k b 的基因转录调 控的时效产生不同的作用。 3 、n f 。k b 结合蛋白对n f k b 靶向摹因调控的选择性作用：最近的些研究表明， n f k b 不能独立的完成基因表达的调控。它的调控作用依赖于与其它转录因子共同 的合作或受其结合蛋白的影响。例如，前列腺癌和多发性骨髓瘤的发牛和发展依赖 于自分泌i l 6 。研究发现，持续高活性i l 6 的表达，在骨髓瘤细胞中是由转录因子 c - j u n 与n f 一1 c b 相互结合后靶向性的完成的，而在前列腺癌中却是由c e b p p 与n f 1 c b ； 合作的。这种合作不仅是必需的，而且导致不同的转录效率( x i a 0w ，2 0 0 4 ) 。另外 的报道证实，前列腺肿瘤中r e p s 2 可与n f k bp 6 5 结合并影响其转录调控的活性 ( p e n n i n k h o ff ，2 0 0 4 ) 。以上的结果说明在基因的转录水平上n f k b 的活性受到与其合 作的转录因子的制约，这些合作因子可对n f k b 的作用起到决定性或效率上的影响。 6 第l 章绪论( 文献综述及课题背景介绍) 甚至即使是同一个基因，在不同的组织细胞中参与协同作用的因了也可以是不同的。 综上所述，n f k b 对靶基因的选择性调控可能表现在多个层次上，包括在细胞 传导通路、翻译后修饰、以及n f k b 结合蛋白的选择上。另外，基因表象的变化也 有可能起到选择性调控的作用。 1 2 2n f 1 c b 结合蛋白对n f 1 c b 的转录活性的影响 广泛的研究发现n f k b 在细胞内至少有1 2 0 种结合蛋白，这些结合蛋白的表达 在组织和细胞之间具有很大的差异性，同样n f k b 调节基因的表达情况在组织和细 胞之间也具有很大的差异性。这为我们提供了一种很大的可能性，即在不同的组织 和细胞中，n f k b 可能会结合不同的蛋白( 这些蛋白很可能是转录因了) ，来共同 调节一些基因的表达，这样就表现出不同组织或细胞中，不同基因表达的特异性。 例如，在h e k 2 9 3 细胞中发现( z h a n g u og a o ，2 0 0 5 ) ，作为n f k b 的共抑制因了 ( h d a c l ，h d a c 2 ，h d a c 3 ，s m r l j 和n c o r ) 和共激活因了( s r c i ，s r c 2 ，和 s r c 3 ) 能够同时结合与i k bq 的肩动子上，且都是通过n f k b 的结合而形成复合体， 进两调节i k ba 的活性。从中可以看出，基因的调控结果在于n f k b 与共抑制因予 或激活因子的相互结合，以及两者间的动态平衡过程。 另外，在同一种细胞中，n f k b 也并不是调节所有的下游基因，而且对很多基 因来说n f k b 单独也无法完成对其的调节作用，这就将n f k b 和其结合蛋白以及 共同调节的基因联系起来，如p i a s 3 ( j a n gh d ，2 0 0 4 ) ，形成n f k b 调节机制的基因 特异性。 相信对上述n f k b 调节作用的组织细胞特异性以及基因特异性的研究，将会 推动人们对于n f k b 作用机制的深入研究，并为n f k b 靶向治疗提供理论基础。 第l 荦绪论( 文献综述及课题背景介绍) 1 3 转录因子p a x 5 1 3 1p a x 5 家族蛋白 p a x 5 属于p a x 基因家族成员。p a x 基因家族由9 个基因组成，编码一组在细胞 发育及疾病形成过程中起重要作用的p a x 转录因子。p a x 基因对于组织发育，细胞 分化，细胞增殖，细胞迁移和存活等起着重要的调节作用。p a x 基因由于其含有d n a 结合配对结构域而命名。p a x 5 基因定位于人的9 p 1 3 号染色体，编码p a x 5 蛋白， 即b 细胞特异性激活蛋白，含有3 9 】个氨基酸。鼠与人的p a x 5 具有高度周源性， 仅差3 个氨基酸。p a x 5m r n a 包含外显子1 s ( 1 a 和l b ) 分别由各自的启动子调控， 通过剪接产生两种转录产物：i a 1 0 和i b i o ( r 妇a 1 1m ，2 0 0 1 ) 。鼢5 表达在最 早期b 系定向前体细胞( p r o b ) 到成熟b 细胞( m a t u r eb ) 过程中，终末分化的浆 细胞中并不表达。p a x 5 ( p a x 5 ) 位于细胞核内，作为b 细胞定向分化发育的关键 转录因子，通过于多种b 细胞分化特异性基因( c d l 9 ，v p r e b ，r a g 2 ，m b 1 ，b l n k 等) 启动子或增加子上的p a x 5 结合位点结合，对这些基因的表达起到重要的正向 调控作用( n u t ts l ，1 9 9 8 ) 。同时又可以抑制髓系，t 系等非b 细胞基因表达，在 b 细胞的早期定向分化中发挥关键性作用。p a x 5 缺失可造成早前期b 细胞( p r o b ) 到前期b 细胞( p r e b ) 的发育阻断，不能生成成熟的b 细胞。p a x 5 缺失的p r o 。b 细胞具有类似造血干细胞的自我更新好向髓系，n k 细胞等多种细胞多向分化潜能。 1 6 8 - 1 d 1 馏1 丑2 2 9筋2 8 3 c e n t f a id o m 盎；n 图3 ：p l a x 5 蚩臼结构 p a x 5 为转录因子，具有1 2 8 个氨基酸的d n a 结合序列，主要包括( 如图3 所 示) ( f i t z s i m m o n sd ，2 0 0 1 ) 配对结构域，同源结构域，转录激活结构域，抑制结构 域等结构域，在每个亚基结构域中，每一个0 l 螺旋包含了螺旋转角螺旋结构域 ( h t h ) ，该结构域主要为d n a 大沟及磷酸基团结合区域，在蛋白的氨基端为p 发夹 结构域，该结构域主要与d n a 小沟相互作用。p 似5 蛋白的配对结构域中双结构域 使得特殊d n a 能够被p a x 5 所识别，p a x 5 所识别的d n a 保守序列为 5g ，a n g c a t ( 、c a a t g c g t g g 几轧a c c a ( b u s s l i n g e rm ，1 9 9 5 ) 。 8 第l 章绪论( 文献综述及课题背景介纠) s c h e b e s t am ，2 0 0 2 h o r c h e rm ，2 0 0 1 ) 。p a x 5 在早期b 淋巴细胞的定向分化发育中起 着关键性的作用，但b 细胞的早期分化是多个转录因子复杂调控的过程，p a x 5 在 其中的具体作用还需从其分子调控机制角度分析，进一步明确内在复杂的调控网络。 此外，p a 义5 在b 细胞的增殖、同型转换和晚期分化等方面也起着重要的调节作用。 图5 ：p a x 5 在细胞发育中的作用 d e l o g u 及他的同事正事了受p a x 5 抑制的1 1 0 个基因的表达情况，这些基因所 编码的蛋白往往在细胞相互作用，粘联，迁移，细胞代谢等起着重要作用 ( d e l o g u ，a ，2 0 0 6 ) ，一些基因( 如c d 2 8 ) 在细胞向浆细胞分化过程中，优先于p a x 5 表达，且在p a x 5 下调后又重新表达。许多实验证实了p a x 5 调节的基因，包括， m b l ，c d l 9 ，b i n k ，b c l 2 i 和i g k 等。最新的实验数据证实，p ：a x 5 能够调节许多细胞表 明分子受体，信号转导分子，核蛋白等，这些核蛋白包括s p i b ，i r f 4 ，i r 趣，b a c i l 2 及 l k z f 3 ( a i o l o s ) 。一些实验也证实了能与p a x 5 相互作用的调节因子e b f 在细胞中的 调节回路( r o e s s i e r s 2 0 0 7 ) 。 p a t t yz w o l l o w 报道( p a t t yz w o l l o ，1 9 9 8 ) ，在b l k 启动子上，具有p a x 5 以及 n f 。k b p 5 0 ，结合序列，通过实验证实，b l k 结合位点部分与n f 1 c b p 5 0 结合序列相 互重合，而n f k b d 5 0 即是n f k b r e l 家族成员之一。在l p s 刺激下的b 细胞以 及浆细胞中n f k b p 5 0 表达升高。相反，在l p s 刺激下，前体b 细胞p r e b 细胞 系( 7 0 3 z ) 能够诱导形成具有p 6 5 和n f k b p 5 0 的复合物，研究显示该复合物能 够与b l k 启动子上临近p a x 5 结合位点序列相互重合。从而在b l k 启动子上产生p a x 5 对n f 1 ( b p 5 0 边界转录因子效应。但在该研究中，作者并未证实p a x 5 和n f k b p 5 0 具有相互作用，作者认为在目前所发现的p a x 5 结合位点附近总有n f 1 ( b 的结合位 点，值得进步研究。 在b 细胞系i g 重链基因的3 0 【增强子上具有两个n f 曲p 5 0 结合位点。在该 l o 第1 章绪论( 文献综述及课题背景介纠) 增强子上有n f k b 及p a x 5 结合位点，y l v al i n d e r s o n 等证实p a x 5 能够抑制该增 强子活性，k r i s t e nj o i h l s o n 报道了在b 细胞发育中，转录因子的调节网络，其中p a x 5 ， n f 一1 ( b ，b l i n l p l ，x b p 1 等蛋白因子起着重要的信号调节作用，p a x 5 在b 细胞及 抗体可变区v h d j 重组起着重要作用，作者证实在浆细胞及b 细胞的发育调节依 赖于b 1 i m p l ，而b l i i n p l 的又受着b c l - 6 ，p a x 5 ，n f k b 的直接调控作用。如图6 所示。 厂沁：、y 丫i 毒一 图6 ：p a x 5 在b 细胞系中信号转导作用 1 3 3p a x 5 与肿瘤 p a x 5 的非正常表达与许多肿瘤发生发展有着重要联系，其中有血液性疾病及 非血液性疾病。据报道，在b 细胞非霍奇金淋巴瘤中，p a x 5 基因在b 细胞中存在 高频突变，易位，重排，缺失等形式的异常表达。尤其是t ( 9 ；1 4 ) ( p 1 3 ；q 3 2 ) 易位。多发性骨髓瘤细胞( m m ) 是浆细胞异常增生的恶性肿瘤，目前认为，m m 细胞起源于前b 细胞或更早阶段，检测m m 患者中p a x 5 的表达情况发现，相对于 正常的浆细胞，m m 的b 细胞全长处于低水平表达状态。在正常b 细胞的晚期分化 阶段，b 细胞诱导成熟蛋白( b l i m p 1 ) 高表达以及p a x 5 的低表达或不表达是促进 b 细胞向浆细胞转化的关键环节。在所有检测的m m 患者b 细胞中发现有b l i m p 一1 的表达，而正常个体的b 细胞中却未见表达。因此在m m 中，由于b l i m p 1 的过早 表达以及p a x 5 的异常表达使正处于增殖阶段的b 细胞过早的分化到类浆细胞阶 段，而绕过了正常b 细胞分化到浆细胞的 x 第l 章绪论( 文献综述及课题背景介纠) i 检测p a x 5 表达及其与n f 。k b 作用 l 构建s i i 埘a - p a x 5 质粒 f转染细胞i m 9 ，敲低该细胞p a x 5 表达量，建立稳转细胞系 i m i c r o a r r a y 检测n f - k b 相关基因表达情况，细胞周期基因表达情况等 ir t p c r 御虾游基因表达隋况 二至三至三至兰至圈图8 ：研究路线 1 4 第2 章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 1 细胞培养及培养基：前列腺癌细胞d u l 4 5 ，p c 3 在含有1 0 小牛血清的 d m e m 培养基( g i b c o b r l ) 中培养；多发性骨髓瘤细胞i m 9 ，k a s 6 在含有1 0 小 牛血清的r p m i 1 6 4 0 培养基( g i b c o b r l ) 中培养。k a s 6 细胞在培养中需加入终浓度 为1 n g m l 的i l 一6 ，以维持其培养。 2 质粒的构建： 1 ) 针对p a x 5 编码基因的s h r n a 表达载体的构建 图9 ：p u 6 + 2 7 载体图谱 实验中使用的s i r n a 质粒系统来自于美国p a n o m i c s 公司，原始的质粒是p u 6 + 2 7 ， 图谱如图9 ，利用的是真核细胞中h u m a nu 6 启动子，在本课题中，主要的技术方 法是人工合成含有i 埘a i 序列的双链d n a ，并插入到p u 6 + 2 7 质粒的多克隆位点， 选择的是x b ai 和s a l i 之间，引入的序列在u 6 启动予之后，设计的