（食品科学专业论文）天然甜味剂罗汉果皂甙的制备、分析及特性研究.pdf

华中农业大学二零零五届硕士研究生学位论文 摘要 罗汉果为我国传统药食同源植物，罗汉果皂甙是其主要的功能成分，作为一类 高甜度、低卡路里的理想天然甜味剂，因其具有多种生物活性而备受人们关注。本 文在本实验室研究的基础上，建立了不同罗汉果皂甙的h p l c 制备方法，并运用现 代分析手段对其结构进行了鉴定；同时采用h p l c 分析方法，系统研究了不同品种、 果实的不同部位以及干燥方法对罗汉果皂甙含量的影响；此外，还采用等甜度法， 对罗汉果皂甙的甜味特性进行了研究；并对罗汉果皂甙提取物对食品中主要成分淀 粉和蛋白质理化性质的影响进行了探讨。 1 罗汉果皂甙的高效液相制备及结构鉴定 高效液相制备的色谱条件为：制备柱，c 1 8s h i m p a c kp r e p o d s ( 2 5 0 m m 2 0 0 m mi d ) ； 流动相，2 0 5 乙腈水溶液；流速，8 m l m i n ；柱温，3 0 ；灵敏度： 2 5 6 a u f s ；检测波长：2 1 0 n m 。收集主要色谱峰的洗脱液，经浓缩、冷冻干燥、重 结晶后得到白色结晶粉末，除己鉴定出的罗汉果皂v ，其它三种组分经m p 、u v - v i s 、 i r 、e s i m s m s 以及1 h - n m r 和”c n m r 等方法鉴定，分别为1 1 o 罗汉果皂甙v 、 赛门甙i 以及罗汉果皂甙i v 。 2 罗汉果皂甙的h p l c 分析 建立了同时分析l1 o 一罗汉果皂甙v 、罗汉果皂甙v 、赛门甙i 以及罗汉果皂甙 i v 的h p l c 法，其最佳色谱条件为：色谱柱，o d s c l 8 柱( 2 5 0 m m 4 6 m m i d ，5 岬) ； 流动相，乙腈：水= 2 3 ：7 7 ( v v ) ；检测波长：2 1 0 n m ；流速：1 0 m l m i n ：灵敏度： 0 0 4 a u f s 。研究结果表明该方法可同时分析罗汉果及罗汉果皂甙提取物中1 1 - o - 罗 汉果皂甙v 、罗汉果皂甙v 、赛门甙i 以及罗汉果皂甙i v 的含量；且该方法线性关 系好，回收率高，精密度及重现性良好，简便，准确，快速。 罗汉果皂甙各组分的含量随罗汉果品种、果实的部位不同而不同。结果表明， 白毛果中除1 1 - o 一罗汉果皂甙v 外，其他三种皂甙组分的含量均低于青皮果，但总 皂甙含量略高于青皮果；而果肉中除赛门甙i 的含量低于果皮，其他三种皂甙组分 及总皂甙含量明显高于果皮。 罗汉果的干燥方法对其皂甙含量的影响较大。分析结果表明白毛果和青皮果最 佳的干燥方式为先晒后烘干。 罗汉果皂甙提取物中总皂甙及四种主要皂甙组分的稳定性分析表明，其稳定性 天然甜味剂罗汉果皂甙的制各、分析及特性研究 好，受加热温度、加热时间、p h 值及放置时间等因素的影响小。 3 罗汉果皂甙甜味特性评价 采用等甜度法评价了罗汉果皂甙粗提物、精提物以及1 1 o 罗汉果皂甙v 、罗汉 果皂甙v 的甜味特性以及与其它甜味剂混合使用时的协同效应。结果表明，提取物 中罗汉果皂甙的含量越高，相对甜度越大；不同罗汉果皂甙提取物的r s ( 相对甜度) 值随样品浓度增加而明显下降，表明甜味剂的浓度越低，其相对甜度越大；罗汉果 皂甙v 的相对甜度r s 远远高于11 一o 一罗汉果皂甙v ，且甜味也较11 0 罗汉果皂甙 v 清爽纯正，这可能与二者在c l l 位上所连接的基团类型有关；罗汉果皂甙与甜蜜 素和蛋白糖有一定程度的负协同效应，但可改善口感；与阿斯巴甜之间的协同作用 不明显；与a k 糖之间有明显的增效作用，增效系数最高可达2 4 5 ，且大大地改 善口感和风味。 4 罗汉果皂甙提取物对淀粉、蛋白质理化性质的影响 分别采用旋转粘度计、r v a 特性粘度仪、质构仪等方法，分析了玉米淀粉糊中 添加罗汉果皂甙提取物后，其表观粘度、糊化特性以及凝胶特性的变化。结果表明， 由于罗汉果皂甙提取物易溶于水，使淀粉颗粒在较少的水中糊化，从而增加了淀粉 糊的粘度、糊化温度以及淀粉凝胶的硬度。 采用高速组织捣碎机、旋转粘度计、质构仪等方法，分析了添加罗汉果皂甙提 取物后大豆蛋白的起泡性、表观粘度以及其凝胶特性的变化。结果表明，由于罗汉 果皂甙的起泡性强但泡沫稳定性差，所以大豆蛋白中添加罗汉果皂甙提取物后起泡 性增强但泡沫的稳定性减弱；同时由于罗汉果皂甙提取物易溶于水，使大豆蛋白溶 于较少的水中，所以罗汉果皂甙提取物的添加使其粘度以及凝胶的硬度、强度、粘 性以及粘滞力都有所增加。 关键词：罗汉果皂甙；制各；鉴定；分析；甜味特性 v 华中农业大学二零零五届硕士研究生学位论文 a b s t r a c t m o g r o s i d e sw e r ep r o v e dt ob et h em a i na c t i v ec o m p o n e n t so ff r u i t so fs i r a i t i a g r o s v e n o r i ，at r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n a lp l a n t , w h i c hw a sak i n do ft o w - c a l o r i e ， h i 曲- s w e e t ，h e a l t h ya n dn a t u r a ls w e e t e n e r o nt h eb a s i so ft h es t u d yo fo u rl a b o r a t o r y , i n t h i s p a p e r , t h ep r e p a r a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n da n a l y s i s o fd i f f e r e n tm o g r o s i d e sw e r e s t u d i e d ，a tt h es a m et i m e ，t h ee v a l u a t i n gt h es w e e t n e s sa n df l a v o ro fm o g r o s i d e s ，a n dt h e i n f l u e n c e so fm o g r o s i d ee x t r a c to np h y s i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fc o r ns t a r c ha n ds o yp r o t e i n w e r ea l s od i s c u s s e d 1 p r e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm o g r o s i d e s t h eh p l cm e t h o df o rt h ep r e p a r a t i o no f “一o x o m o g r o s i d e v , m o g r o s i d e i v , a n d s i m n e n o s i d e1w a ss t u d i e d t h ec h r o m a t o g r a mc o n d i t i o nw a s c o l u m n ，s h i m p a c k p r e p o d s ( 2 5 t m n 2 0 0 m mi d ) ；m o b i l es o l v e n t ，a c e t o n i t r i l e ：w a t e r = 2 3 ：7 7 ( v v ) ； f l o w r a t e ，8 m l m i n ；s e n s i t i v i t ys e t t i n g ，2 5 6a u f s ；w a v e l e n g t ho fu v d e t e c t i o n ，2 1 0 n m 1 1 1 ew h i t ec r y s t a lp o w e r sw e r eo b t a i n e db yc o l l e c t i n g c o n c e n t r a t i n ga n df r e e z e - d r y i n g e l u t i n gs o l u t i o na c c o r d i n gt ot h ec h r o m a t o g r a mp e a k s a n dt h e1 1 - o x o m o g r o s i d ev m o g r o s i d ei va n ds i a m e n o s i d e1w e r ei d e n t i f i c a t e db ym p , u v - v i s ，i r ，e s i m s m s ，1 h n m ra n d c n m r 2 t h ea n a l y s i so fm o g r o s i d e sb yh p l c a nh p l ca n a l y s i sm e t h o do fd e t e r m i n a t i o n11 - o x o m o g r o s i d e v , m o g r o s i d e v m o g r o s i d e lv a n ds i a n a e n o s i d eih a db e e ne s t a b l i s h e d t h ec h r o m a t o g r a mc o n d i t i o nw a s ： c o l m n n ，c l so d s ( 2 5 0 m m x 4 6 m mi d ，5 r t r n ) ；e l u t i n gs o l v e n t ，a e e t o n i t r i l e w a t e r , 2 3 ：7 7 ( v v ) ；f l o w r a t e ，1 0 m l m i n ；t e m p e r a t u r e ，2 5 c ；s e n s i t i v i t ys e t t i n g ，0 0 4 a u f s ； w a v e l e n g t ho fu v d e t e c t i o n ，2 1 0 n m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h i sa n a l y s i sm e t h o dw a s s i m p l e ，a c c u r a t ea n dh a dag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep e a ka r e a sa n dt h e c o n t e n to f m o g r o s i d e s ，h i 曲r e c o v e r i e sa n db e t t e rr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n t h ec o n t e n t so fm o g r o s i d e sw e r ed i f f e r e n ti nd i f f e r e n tv a r i e t i e sa n dp a r t s i nt h e f r u i t so fb a i m a o ，e x c e p tl1 - o x o - m o g r o s i d ev ，t h ec o n t e n t so fm o g r o s i d ev m o g r o s i d e i va n ds i a m e n o s i d e1w e r el o w e rt h a nt h a to fq i n - p if r u i t s f u r t h m o r e ，t h ec o n t e n t so f 11 - o x o m o g r o s i d ev m o g r o s i d ev m o g r o s i d ei va n da l lm o g r o s i d e si np u l pw e r eh i g h e r t h a nt h a ti np e e l ，b u tt h ec o n t e n t so fs i a m e n o s i d eii np u l pw e r el o w e r v 天然甜味剂罗汉果皂甙的制备、分析及特性研究 t h ei n f l u e n c e so f d i f f e r e n td r ym e t h o d so nt h ec o n t e n t so f m o g r o s i d e sw e r eo b v i o u s f o rt h e s et w ov a r i e t i e s ，t h eb e s td r y i n gm e t h o dw a st h a tt h ef r e s hf r u i t sw e r ed r i e db y h e a t i n ga f t e ri n s o l a t i o n i na d d i t i o n ，m o g r o s i d e sw e r es t a b l e ，a n dt h ev a r i a t i o no f p hv a l u e ， h e a t i n gt e m p e r a t u r e ，h e a t i n gt i m ea n dk e e p i n gt i m eh a df e wi n f l u e n c e so nt h e i rc o n t e n t s 3 e v a l u a t i n gt h es w e e t n e s so fm o g r o s i d e s u s i n gc o m p a r i s o ne v a l u a t i o nt e s t s ，t h ee q u i s w e e ts u c r o s ec o n c e n t r a t i o n ( e s ) a n dt h e r e l a t i v es w e e t n e s s ( r s ) o fm o g r o s i d e sh a d b e e nd e t e r m i n d e d t h em o r ec o n t e n t so f m o g r o s i d e s ，t h eh i g h e rr s w h e nt h ed i f f e r e n ts w e e t e n e r sw e r ea tl o w e rc o n c e n t r a t i o n ，a n a p p r o p r i a t ep r o d u c tc a l lb eo b t a i n e dw i t hah i g h e rs w e e t n e s s ，g o o dt a s t ea n df l a v o r t h e r sa n dt h ef l a v o ro fm o g r o s i d evw e r eb e r e rt h a nt h a to f11 - o x o m o g r o s i d ev ，b e c a u s e t h e r ei sd i f f e r e n c eo f t h e i rs t r u c t u r e t h es y n e r g i s m sb e t w e e nm o g r o s i d ee x t r a c ta n do t h e r s w e e t e n e r sh a db e e nm e a s u r e d ，ag r e a to fs y n e r g i s m sw a sf o u n di nm i x t u r e so fs a m p l e a n da c e s u l f a m ekw i t has y n e r g i s t i cr a t eo f2 4 5 ，a n daf e ws y n e r g i s m s 谢t ha s p a r t a m e ， b u tan e g a t i v es y n e r g i s mw i t hc o m b i n e ds w e e t e n i n ga n dc y c l o m a t e 4 i n f l u e n c e so fm o g r o s i d ee x t r a c to np h y s i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fc o r n s t a r c ha n ds o yp r o t e i n u s i n gr o t a t i n gv i s c o m e t e r , r a p i dv i s c o - a n a l y z e ra n dt e x t u r ea n a l y z e r , t h ei n f l u e n c e s o fm o g r o s i d ee x t r a c to nt h ea p p a r e n tv i s c o s i t y , g e l a t i n i z a t i o n ，a n dt h eg e lt e x t u r eo ft o m s t a r c hw e r ed e t e r m i n e d b e c a u s em o g r e s i d e sc o u l dd i s s o l v ei nw a t e re a s i l y , s t a r c hw a s g e l a t i n i z e di nl i t t l ew a t e r s o ，t h eg e l a t i n i z a t i o nt e m p e r a t u r e ，p c a kv i s c o s i t y , b r e a k d o w n v a l u e ，a n dg e lv a l u eo fc o r ns t a r c hi n c r e a s e ds l i g h t l y t h ei n f l u e n c e so fm o g r o s i d ee x t r a c to nt h ev i s c o s i t y , f o a m i n gp r o p e r t ya n dg e l c h a r a c t e r i s t i co fs o yp r o t e i nw e r ea n a l y s e dw i t hr o t a t i n gv i s c o m e t e r , h i g hs p e e dt i s s u e t r i t u r a t o r , a n dt e x t u r ea n a l y z e r b e c a u s et h ef o a ms t a b i l i t yo fm o g r o s i d ee x t r a c tw a sb a d w h i l ei t sf o a m i n gs t r o n g ，a n da tt h es a m et i m ei tc a nd i s s o l v ei nw a t e re a s i l y , t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ev i s c o s i t y , f o a m i n gp r o p e r t y , h a r d n e s s ，b r i t t l e n e s s ，c h e s i o no fs o yp r o t e i n g e li n c r e a s e ds l i g h t l y , a n dt h ef o a ms t a b i l i t yo f i td e c r e a s e ds l i g h t l y k e yw o r d s ： m o g r o s i d e s ；p r e p a r a t i o n ；i d e n t i f i c a t i o n ；a n a l y s i s ；s w e e t n e s sc h a r a c t e r i s t i c v l i 天然甜味剂罗汉果皂甙的制各、分析及特性研究 第一章文献综述 罗汉果皂甙的制备、鉴定、分析以及特性研究 罗汉果，学名“光果木鳖” s i r a i t i a g r o s v e n o r i i ( s w i n g l e ) c j e f f r e y ，又名汉果、 罗晃子、拉汉果、假苦瓜等，为葫芦科 c u c u r b i a t a c e a e 罗汉果属多年生草质藤本植 物的成熟果实( 齐一萍，2 0 0 1 ；蒋世琼，1 9 9 9 ) ，原产于广西、广东、湖南、江西等 省( 区) 的热带、亚热带山区，是我国传统的药用植物，在广西民问的药用历史已 有3 0 0 多年( 陈迪华，1 9 9 2 ) 。据中药志等文献记载，罗汉果味甘、性凉、有清 热解暑、润肺止渴作用，临床上可用于治疗高血压、肺结核、哮喘、胃炎、百日咳、 急慢性气管炎和急慢性扁桃腺炎等疾病( 林岩香，1 9 9 7 ) 。目前，对于罗汉果皂甙的 药理活性研究仍主要集中在对于呼吸系统疾病的治疗以及消炎杀菌等传统药效的研 究上。 罗汉果营养价值高，富含糖、蛋白质、维生素、脂肪酸以及多种氨基酸和微量 元素。近年的研究表明，强甜味的非糖物质三萜类成分罗汉果皂甙( m o g r o s i d e ) 是 其主要的有效成分( 李俊，1 9 9 7 ；曹东宁，1 9 9 9 ) ，其中罗汉果皂甙v 的含量最为 丰富。且因罗汉果皂甙提取物的甜度高，热量低，色泽浅，水溶性及稳定性好，食 用安全，我国于1 9 9 6 年批准该产品为食品添加剂，可作为甜味剂部分或全部代替蔗 糖而广泛用于各类食品，尤其是作为肥胖病及糖尿病患者的代用糖( 陈肇锬，1 9 9 5 ； 竹本常松，1 9 9 8 ) 。 1 国内外研究进展 1 1 罗汉果皂甙的成分 上世纪7 0 年代，就有人开始研究罗汉果皂甙。1 9 7 5 年，l e e 首先报道了罗汉果 果实中含有三萜甜味甙。1 9 8 3 年日本学者竹本常松等从澳门购得的罗汉果中分离并 鉴定了7 种罗汉果甙( 竹本常松，1 9 8 3 ：m a t s u m o t ok1 9 9 0 ) ，从云南西双版纳产的 翅子罗汉果中也得到过4 种罗汉果甙( k a s a ir ，1 9 8 9 ) 。另外，中国学者王雪芬、斯 建勇等还从罗汉果根的脂溶性部分分离得到一系列的葫芦烷型四环三萜酸( 王雪芬， 】9 9 6 ；王雪芬，1 9 9 8 ；斯建勇，1 9 9 9 ) 。目前，己从罗汉果果实中分离并鉴定了罗汉 果皂甙1 v ( m o g r o s i d ei v ) 、罗汉果皂甙v 、罗汉果皂甙i i i 、罗汉果皂甙i ie 、罗汉果 皂甙i i i e 、罗汉果皂甙v i 、罗汉果皂甙a 、罗汉果新甙m e o m o g r o s i d e ) 、赛门甙 i ( s i a m e n s i d ei ) 、1 1 - o 罗汉果皂甙v ( 1 1 - o x o m o g r o s i d e v ) 、罗汉果二醇苯甲酸酯 ( m o g r o e s t e r ) 等共11 种葫芦烷三萜甙类( c u c u r b i t a n eg l y c o s i d e ) 化合物。 研究表明罗汉果皂甙是一种三萜烯葡萄糖甙，其配糖甙原是三萜烯醇。两条由 四个以下葡萄糖单位组成的葡萄糖甙侧链，以b 一糖苷键与甙原相连，侧链葡萄糖之 华中农业大学二零零五届硕士研究生学位论文 间的连接键为p 一1 ，6 和d 一1 ，2 糖苷键( 鞠伟，2 0 0 1 ；蒋世琼，1 9 9 9 ) 。罗汉果皂甙属 葫芦素烷型化合物，它们具有共同的甙原罗汉果醇( m o g r 0 1 ) ，结构见图1 - 1 ，其主 要差别在于连接的糖基数目以及连接方式不同，同时个别甙的c 1 l 位一o h 被氧化成 = o ，其基本结构见图1 2 。 图1 - 1 罗汉果醇的结构 f i g 1 - 1 t h es t r u c t u r eo f m o g r o l 图1 - 2 罗汉果皂甙的基本结构 f i g l - 2 t h eb a s i cs t r u c t u r eo f m o g r o s i d e s 1 2 罗汉果皂甙的提取、分离、纯化研究 1 2 1 提取 传统的提取工艺多使用溶剂浸提。提取溶剂一般用水或5 0 7 0 的乙醇水溶液， 温度多在常温或7 0 c 左右进行多次浸提( 李雁群，1 9 9 5 ；李俊，1 9 9 9 ；贺根生，2 0 0 0 ； 鞠伟，2 0 0 1 ) 。李军生等研究采用超声波法处理罗汉果，以提高罗汉果甜甙的提取率 ( 李军生，2 0 0 4 ) 。朱晓韵等首次探索了微波技术提取罗汉果甜甙的方法，并优选出 提取工艺。与常规水煮法比较，微波提取罗汉果甜甙效率高，且省时、省能、操作 简便( 朱晓韵，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 分离 李雁群等应用a b 8 吸附树脂、a m b e r l i t ex a d 一2 树脂、活性炭及硅藻土柱、 d a 一2 0 1 丙烯酸型树脂等为固定相，以不同浓度的极性溶液为流动相对罗汉果总皂甙 进行了初步分离( 李雁群，1 9 9 3 ；齐一萍，2 0 0 1 ；李典鹏，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 精制 斯建勇等以大孔树脂吸附总皂甙、硅胶柱层析分级的工艺，分离制备出罗汉果 皂甙i i i 、i v 、v ( 斯建勇，1 9 9 6 ；斯建勇1 9 9 9 ) ；竹本常松等以活性炭及硅藻土柱 吸附总皂甙、硅胶柱层析分级的工艺分离得到罗汉果皂甙i v 、v 、v l 。此外，余丽 娟等建立了高效液相色谱法制备罗汉果皂甙v 的方法，即将a b 8 吸附树脂分离、 d 2 8 0 离子交换树脂脱色后的罗汉果水提物，上a l l t e c h e c o n o s p h e r e n h 2 柱，用乙腈 一水( 6 8 ：3 2 ，v v ) 溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥结晶得罗汉果皂甙v ( 余丽娟， 2 0 0 3 ) 。 天然甜味剂罗汉果皂甙的制各、分析及特性研究 1 3 罗汉果皂甙的含量测定 1 3 1 香草醛显色法 罗汉果皂甙的甙元为三萜烯醇，具有与香草醛硫酸试剂起显色反应的性质，并 且此反应受葡萄糖的影响极小，因此可以利用这个反应来定量测定罗汉果皂甙。根 据这一原理，李雁群通过正交实验确定了香草醛硫酸比色法测定罗汉果皂甙的条件 ( 李雁群，1 9 9 3 ) 。常琪建立了用香草醛高氯酸比色法测定罗汉果皂甙的条件( 常 琪，1 9 9 5 ) 。 1 3 2i t p l c 法定量分析罗汉果皂甙v hc m a k a p u g a y 等建立了采用氨基柱定量分析罗汉果皂甙v 的h p l c 方法。但 前处理繁琐，首先将干罗汉果粉碎，水煮，过滤及氯仿洗脱所得的水溶性洗脱液减 压浓缩后，过b o n d e dh i f l o s i l 柱，用水洗脱除去极性杂质后用5 0 乙腈水溶液洗脱 后才得到进行h p l c 分析的样品( hcm a k a p u g a y ，1 9 8 5 ) 。 1 4 罗汉果皂甙提取物的理化特性 1 4 1 甜度高、热量低、水溶性好 当罗汉果皂甙提取物含量大于8 0 时，其甜度是5 蔗糖溶液甜度的2 0 0 倍左 右，达到相同甜度时，热量只有蔗糖的五十分之一。此外，颜色淡黄，水溶性好( 李 俊，1 9 9 7 ) 。 1 4 2 热稳定性好 在1 0 0 的中性水溶液中连续加热2 5 小时，或在1 2 0 c 空气中长期加热，罗汉 果甜甙结构稳定。 1 4 3 属非发酵物质、不易霉变 罗汉果皂甙提取物在干燥的环境下，单独存放或与其他物质混合存放，1 8 个月 内不会发生任何发酵或霉变现象( 李俊，1 9 9 7 ) 。 1 4 4 受酸碱度的影响小 罗汉果甜甙受酸碱度影响小，在p h 于2 0 - 一1 0 0 范围内保存2 年不会发生任何 变化( 李俊，1 9 9 7 ) 。 1 5 罗汉果皂甙v 的甜昧特性 陈肇锬等对罗汉果皂甙v 的甜昧特性进行研究，结果表明，罗汉果皂甙v 甜味 华中农业大学二零零五届硕士研究生学位论文 品质良好，味道持续时间长，后味持久。其甜度为蔗糖的2 5 0 - 3 5 0 倍，且随浓度的 增大而甜度减弱；在p h 值为2 - 9 ，温度0 - 1 8 0 。c 范围内，甜味稳定，甜度变化不大。 ( 陈肇锬，1 9 9 5 ) 。 1 6 罗汉果皂甙提取物的药理活性研究进展 1 6 1 镇咳、祛痰、平喘 罗汉果甜甙有化痰镇咳平喘作用( 王勤，2 0 0 1 ；王勤，1 9 9 9 王雯，1 9 9 9 ) ，实 验表明：罗汉果水提物可明显抑制二氧化硫诱发的小鼠咳嗽；对小鼠气管酚红排泌 量和大鼠排痰量均有明显增加，有较好的祛痰作用；能促进青蛙食道黏液移动，但 并不影响枸橼酸诱发的豚鼠哮喘。 1 6 2 抗炎镇痛抑菌作用 以罗汉果提取物制成的咽喉片对小鼠棉球肉芽肿的形成，二甲苯致小鼠耳壳水 肿及角叉菜胶引起的足肿胀具有明显的抑制作用：醋酸扭体法实验表明它有明显的 镇痛作用( 王勤，1 9 9 9 ) 。罗汉果水浸出液在5 的浓度下，可抑制变链菌的生长、 产酸和粘附能力，比甜菊糖的抑制作用还强，具有成为无致龋性天然甜味剂的应用 前景。体外实验中发现，罗汉果叶对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌及卡那双球菌 有较好的抑制作用( 钟树权，1 9 8 5 ) 。 1 6 3 调节消化道运动 罗汉果水提物对乙酰胆碱或氯化钡所致家兔或小鼠离体回肠痉挛均有拮抗作 用，对肾上腺素所致家兔离体回肠松弛也有拮抗作用，提示罗汉果有调节消化道运 动的作用( 王勤，1 9 9 9 ) 。 1 , 6 4 增强免疫 罗汉果水提物对免疫低下小鼠的单核细胞吞噬功能有增强作用，即可增强免疫 低下机体的非特异性免疫功能。罗汉果提取物还可增强大鼠体液免疫和细胞免疫功 能( 王雯，1 9 9 9 ) 。 1 6 5 抗氧化活性 对于罗汉果的抗氧化作用，日本学者作了一定研究，研究表明：罗汉果水提取 物能降低d p p h 的活性，猝灭次黄嘌呤黄嘌呤氧化系统中的0 2 一以及芬顿反应中产 生的o h ，并能抑制f e ( i i ) 的活性。在体外实验中，罗汉果水提物能减少小鼠皮质匀 浆的脂质过氧化且成剂量一效应关系( s h ih o n g l i a n ，1 9 9 6 ：w a n gx i a o y a n ，1 9 9 5 ) a 基于罗汉果水提取物的抗氧化活性，日本已将它作为自由基猝灭剂添加到功能食品 天然甜味剂罗汉果皂甙的制各、分析及特性研究 和化妆品中( y o s h i d ah i r o h i ，2 0 0 1 ；s e i b u ，2 0 0 1 ) 。 1 6 6 毒性 罗汉果冻干水提取物对小鼠的l d 5 0 超过1 0 9 k g ；小鼠口服冻干水提物的溶液， 每天3 1 0 。3 m l k g 体重，连续给药一周，无一死亡；小鼠口服罗汉果粗水提物，在 剂量1 5 9 k g 体重时，出现轻度镇静和缓泻，以上结果表明罗汉果水提物的毒性较低、 安全系数较大( 李典鹏，2 0 0 0 ) 。 2 罗汉果开发应用现状 因罗汉果中的主要活性成分罗汉果皂甙提取物为一种天然低热量高甜度的功能 性甜昧剂，且具有多种生物活性，所以对罗汉果产品的开发成为近年来研究的热点。 2 1 传统药用 罗汉果果实性凉味甘，无毒，有清热解毒、化痰止咳、凉血舒胃、清肺润肠和生津 止渴等功能，是我国的传统中药。可治疗急慢性支气管炎、咽喉炎、哮喘、百日咳、 胃热、便秘、急性扁桃体炎等症，由此开发了多种功能性利咽润喉茶。同时，它还 可以替代甘草矫味，因而在许多中药的配方中与其它成分配伍；此外，罗汉果果实上的 绒毛是较好的刀伤药。 2 2 味剂 罗汉果中的甜甙成分甜度高，平均约为蔗糖的2 5 0 3 0 0 倍，甜味纯正，低热量，是 肥胖病人及不适于用糖食的糖尿病人理想的调味品。我国于1 9 9 6 年7 月的全国食品 添加剂标准化技术委员会第1 7 次会议上批准将罗汉果皂甙提取物作为食品添加剂， 目前已作为功能性替代糖添加到果味饮料、功能性保健品以及糕点等面点的制作中， 并在国内申请了多项专利。因此，罗汉果甜甙产品在国际市场上价格居高不下。 2 3 其它 目前，由于罗汉果皂甙提取物具有抗氧化特性，可以有效的清除体内的自由基 从而达到美容保健的目的。因此，以罗汉果提取物为原料，研制美容产品成为开发 罗汉果资源的新途径。 3 研究目的与意义 罗汉果作为我国的传统药食同源植物，具有很高的研究价值。但是，目前国内 华中农业大学二零零五届硕士研究生学位论文 外只着重研究了罗汉果皂甙粗提物的分离与纯化；对于罗汉果皂甙含量的测定，普 遍采用的分光光度法存在定量不准，稳定性差等缺点，而文献报道的罗汉果皂甙v 的h p l c 定量分析方法( hcm a k a p u g a y ，1 9 8 5 ) 也存在样品前处理过程繁杂、色 谱柱通用性差等不足之处，无法简便、准确地对罗汉果皂甙类产品进行分析检测。 我国于1 9 9 6 年7 月已经批准罗汉果皂甙提取物作为食品添加剂，但罗汉果皂甙的甜 味特性及其对食品中主要成分的影响还没有系统的研究报道。 针对上述问题，本实验室对罗汉果皂甙提取物的纯化、制备以及生物活性等方 面进行了研究，已制备并鉴定了罗汉果皂甙v ；本研究在此基础上进一步制备及鉴 定了其它三种主要罗汉果皂甙；并采用所建立的高效液相分析方法系统研究了主要 罗汉果皂甙组分的稳定性及不同品种，不同部位，不同干燥处理后罗汉果中主要皂 甙成分的含量。同时对不同罗汉果皂甙提取物、罗汉果皂甙v 和1 l o 罗汉果皂甙 v 的甜味特性，以及罗汉果皂甙提取物对淀粉、蛋白质理化性质的影响也进行了探 讨。这一研究将为罗汉果这一传统优势资源的进一步开发利用提供一定的理论依据。 天然甜味剂罗汉果皂甙的制各、分析及特性研究 第二章罗汉果皂甙的制各与鉴定 罗汉果中除了含量和甜度均较高的组分罗汉果皂甙v 外，还含有其他罗汉果皂 甙组分，各组分的含量是评价罗汉果甙类产品的重要质量指标之一，因此制备罗汉 果皂甙组分对照品，对罗汉果皂甙含量的准确定量分析具有重要的意义。余丽娟等 建立了用a l l t e c h e c o n o s p h e r e n h 2 柱制备罗汉果皂甙v 的方法( 余丽娟，2 0 0 3 ) ，但 此方法的样品前处理过程繁杂，采用的制备柱通用性较差，且仅能制备一种组分。 因此，本文在本实验室制备并鉴定了罗汉果皂甙v 的基础上，研究其他罗汉果皂甙 组分的制备，并运用高效液相、熔点、紫外、红外、质谱以及核磁共振等技术对所 制备的组分进行结构鉴定。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 仪器与试剂 v a r i a n2 7 0 0m i t c h e l ld r i v e 高效液相分析仪( d a d 检测器) v a r i a nc o ，u s a a g i l e n t11 0 0 系列液质联用仪( d e1 4 9 1 5 0 8 5d a d 检测器) a g i l e n tc o , u s a l c 一6 a 高效液相色谱仪( s p d 6 a v 检测器) s h i m a d z uc o ，j a p a n n e x x u s6 7 0 傅立叶红外光谱仪 m a d ei nu s a b r u k e rd m x 一5 0 0 超导核磁共振仪m a d ei nu s a h e i d o l p h 旋转蒸发器 m a d ei ng e r m a n y b ”型熔点测定管中药集团上海试剂公司 乙腈a r天津化学试n - 厂 乙腈色谱级 f i s h e rc h e m a l e r tc o ，u s a 1 1 2 材料 罗汉果皂甙粗提物( m gi ) ：由桂林莱茵生物制品有限公司提供。 罗汉果皂甙精提物( m g i i ) ：由本实验室制备。 罗汉果皂甙v ：由本实验室制备。 青皮果、白毛果：购于广西永福县。 1 2 实验方法 1 2 1h p l c 法制各罗汉果皂甙各组分 配制定浓度的m g i i 水溶液，进行h p l c 制备。色谱条件为：色谱柱，s h i m p a c k 华中农业大学二零零五届硕上研究生学位论文 p r e p o d s ( 2 5 0 m m 2 0 0 m mi d ) 柱：检测波长，2 1 0 n m ：流速，8 0 m l m i n ；灵 敏度，2 5 6 a u f s ：进样量，1 5 0 9 l ，研究不同浓度的乙腈水溶液为流动相时，对罗 汉果皂甙各组分的分离效果，以确定最佳分离条件。然后根据图谱，收集主要色谱 峰的洗脱液，经浓缩、冷冻干燥、重结晶得四种不同组分。 1 2 2 结构鉴定 1 2 2 1h p l c 分析 色谱条件为：色谱柱，h y p e r s i lo d sc 1 8 柱( 2 5 0 m m 4 6 m mi d ，5 1 a m ，大连 伊利特科学仪器公司) ；流动相，乙腈：水= 2 3 ：7 7 ( v ，v ) ；流速，1 0 m l m i n ；柱温， 2 5 。c ；灵敏度，0 0 4 a u f s ：检测波长，2 1 0 r m l ：进样量，1 0 0 9 l 。运用浙江大学智 达色谱工作站进行数据采集与分析。以保留时间进行定性。 1 2 2 2e s i m s m s 分析 e s i m s 分析 e s i 离子源电离，喷射电压：5 0 0 0 v ；毛细管温度：2 5 0 。c ；喷射压力：2 5 0 p s i ： 干燥气流速：8 0l m i n ；干燥气温度：2 5 0 c ；扫描分子量：1 0 0 1 7 0 0 。正负离子模 式。 e s i m s m s 分析 e s i 离子源电离，喷射电压：3 5 0 0 v ；毛细管温度：2 5 0 。c ；喷射压力：2 0 0 p s i ： 干燥气流速：8 0l m i n ：干燥气温度：3 5 0 c ；扫描分子量：1 0 0 1 7 0 0 。负离子模式。 1 2 2 3 熔点测定 样品采用毛细管熔点仪进行测定。 1 2 2 4 紫外扫描 取适量样品溶解于2 3 乙腈水溶液中，以2 3 乙腈水溶液为参比，在 1 9 0 n m 一4 0 0 n m 之间进行扫描，分析所制备各组分的紫外光谱特征。 1 2 2 5 红外分析 样品和溴化钾以2 的比例混合研磨压片后，于n e x x u s6 7 0 傅立叶红外光谱 仪上进行扫描分析，扫描范围为4 0 0 0 4 0 0 c m 。 1 2 2 6 核磁共振法 将罗汉果皂甙样品溶于重水( d 2 0 ) 中，以四甲基硅烷( t m s ) 为内标物，在 b r u k e r 核磁共振仪上进行6 0 0 m 氢谱( 1 h n m r ) 与1 2 5 m 碳谱( 1 3 c - n m r ) 的分析。 2 结果与分析 天然甜味剂罗汉果皂甙的制各、分析及特性研究 2 1 高效液相法制备罗汉果皂甙各组分 本文研究了2 0 2 5 乙腈水溶液对罗汉果皂甙组分的h p l c 分离制备的效果， 结果表明，2 0 5 l 腈水溶液作为流动相时，分离效果较好，各色谱峰能较好的分离， 结果见图2 1 。根据色谱图收集主要色谱峰的洗脱液，将洗脱液浓缩，冷冻干燥，及 重结晶后可制备得到四种白色结晶性粉末，分别为组分1 、2 、3 、4 。 2 1e 0 17 _ 5 1l u 07 5 0e 0 0 ：5 nr n t i m eh i n ) 图2 1 m g i i 的高效液相制备色谱图 f i g2 - 1 p r e p a r a t i v eh p l cc h r o m a t o g r a mo f m g i i 柱型：s h i m p a c k p r e p - o d s ( 2 5 m m 2 0 o m m i d ) 柱；流动相：乙腈：水( 2 0 5 ：7 9 5 ，v v ) 检测波长：2 1 0 n m ；流速：8 0 m l m i n ；灵敏度：2 5 6 a u f s ；进样量：1 5 0 1 a l 。 2 2 罗汉果皂甙的结构鉴定 前期的研究已表明，由峰2 制备得到的组分2 为罗汉果皂甙v 。因此，本文进 一步对组分1 、3 、4 进行结构鉴定。 2 2 1 组分1 的结构鉴定 2 2 1 1h p l c