（食品科学专业论文）植物乳杆菌ZJQ的鉴定及其细菌素的初步研究.pdf

浙江工商大学硕士学位论文 l l i i l ! ! l l | | l l l l | l | | 1 删 y 17 2 4 7 3 5 植物乳杆菌z j 0 的鉴定及其细菌素的初步研究 摘要 由于人工合成防腐剂和抗生素广泛使用于农产品产前产后环节所带 来的食品安全性问题，人们开始寻找天然安全的防腐刹和抑菌剂，乳酸菌 细菌素以其良好的抑凶性和来自于食品级微生物而受到了越来越多的关 注。 本实验章从婴儿粪便样品r 1t 分离到一株产细菌素的菌株，对产! i i 菌的 生理生化特征研究表明它j l ! l i 【物乳杆凶( l 臼c ，d 方臼c j 砌sp 肠，7 f 臼心z 朋) 相似， 1 6 sr d n a 序列鉴定表明它与机物乳卡f ：茼( 臼c f d 6 日c ? ，甜s ) 肠月，日朋，”s t r a i n a f l ) 有9 9 4 的同源。既i ，命名为l d c m 7 ) 臼c 洲z z vp ，绷幻心f 朋z j q 。其产乍的 细菌素则命名为p l a n t a r i c i nz j q 。d c ，d 6 口c j ，z “p 肠门，臼陀优的发酵动力学实 验表明细菌素p l a n t a “c i nz j q 的产生主要在对数期，进入稳定期后则停止 产生。蛋白酶作用实验显j ，胰蛋白酶、蛋白酶k 都能够使p l a n t a r i c i nz j q 失活。热稳定性研究表明像其它细菌素一样耐热，l o o 处理3 0m i n 仍能 保留8 0 的活性。p l a n t a r i c i nz j q 在酸性条件下活性最强，稳定性也最高， 当p h 值超过4 o 即失去活性。抑菌谱检测显示p l a n t a r i c i nz j q 属于广谱性 细菌素，能够抑制大部分革兰氏1 5 j 性试验菌和部分革兰氏阳性试验菌，如 恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、滕黄微球菌、福氏志贺氏菌、柠檬色葡萄 球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等，但对其自身生长不具有抑制作用。通过改 变发酵培养基组成和发酵条件优化三日c 幻6 口c z ，甜sp 如聊f 口地历z j q 的生长和 p l a n t 撕c i nz j q 的生产实验发现，三d 甜d 6 臼c f z f sp i 绷幻m 肌z j q 的最佳生长 条件和p l a n t a f i c i nz j q 的最佳生产条件基本一致。单因子试验和响应面法 获得p l a n t a r i c i nz j q 的最佳培养条件为葡萄糖2 、蛋白胨1 、浓缩酵母 塑江三塑奎兰婴主堂焦丝奎 一一一 粉1 、磷酸二氢钠o 2 、乙酸钠o 5 、柠檬酸三铵o 2 、氯化钠o 2 、 吐温8 0o 1 ，在3 0 、6 0m l 2 5 0m l 、初始p h 值6 5 时活性最高，该细 菌素的抑菌罔直径有原先的2 5 1c m 提高到2 7 6c m ，其抑菌活性提高显著。 采用硫酸铵分级沉淀法从发酵液中提取p l a n t a r i c i nz j q ，再经过透析除盐、 浓缩细菌素，最终经过t r i c i n e s d s p a g e 电泳确定分子量为5 k d a 左右。 关键词：植物乳杆阿z j q ；细菌素；菌种鉴定：i l 向应面：分离 浙江三塑奎兰翌圭兰堡垒茎 一 一 i d e n t i f i c a t l 0 no f 删c 巾删c 弘淞p l 么黝r z j q a n d s t u d y0 n p l a n t a r i c i nz j q a bs t r a c t b e c a u s es y n t h e t i cp r e s e r v a t i v e sa n d a n t i l ) i o t i c sa r ew i d e l yu s e d 1 np r e n a t a l a n dp o s t n a t a l a s p e c t s 。fa 酏m t u r a lp r o d l l c t s w 1 “c hc a u s e da s e r i e s o f f o 。鼍 s a f b t vi s s l i e s ，p e 。p l e s t a r t1 。k i n g f o rs a f e n a t l i r a lp r e s e r v a t l v e s a n d a n t 毒a c t e r i a la g e n t s 。t h eb a c t e r i 。c i n f r 。m 肠c f 幻d c f d6 d 讲e 力口f o ri t se x c e l i e m i nt h i ss t l i d y ，ab a c t e r i o c i n p r o d u c i n g s t r a i nw a si s 0 1 a t e df r o m1 1 1 f a n tt e c e s i tr e v e a l e dt h a tt h es t r a i n s h o w e d h o m o l o g yt ol d 础删f 扰sp 拗幻埘舢y b a s i cc h a r a c t e r i s t i c a n d 1 6 sr d n aa n a l y s i s s h o w e d t h “坞1 6 s r d n 全 s h o w e d9 9 4 h o m o l o g yt o 枷( ) 胁砌sp 伽聊s t r a i n 触l m1 t sl 蜷 r d n as e q u e n c e s 。w en a m e d t 1 1 i s s t r a i na s 砌“北j 阮s 伽幻删mz j q a n ( ： t h eb a c t e r i o c i na sp l a n t a r i c i nz j q 己口甜。6 a c j 7 f 秘sp 肠船f a 删朋z j q w a s p r o d u c e 曼 m a i n l yd u r i n ge x p 。n e n t i a lp h a s ea n d c e a s e da ts t a t i o n a wp h a s 已“k em o s 1 0 1 。t h e r b a c t e r i o c i n sp r o d u c e d b yl a b ，p l a n t a r i c i nz j q w a ss t a b l et o h e a tu n d e r 1 0 wp ha n dl a b i l eu n d e rh i g hp h 1 tc 锄r e t a i n8 0 0 f t h ea c t i v i t ya 竹e r3 0m m o f l 品o c h e 疵g ，w h e n t h ep h v a l u ew a sa b o v e4 o p l a 栅i c i nz j q w o u l d l o s t i t sa c t i v i t y p 1 a n t a r i c i nz j qw a si n a c t i v a t e db y 时p s i n a n dp r o e l n a s e k p l a n t a r i c i nz j qs h o w e dab r o a dr a n g e o fi n h i b i t o r y s p e c 仃u m ，1 tc a n m n l b l t m a i o r i t yo f t e s tg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ，a n ds o m e t e s tg r a m _ p o s i t l v eb a c 把r ：? 沁於p s e n d o m o n a sp u t i d a ，b 蒯l u ss 褂b t t l i s ，m t c r o c o c c u s s ，鼬t 昏幽a m 浙江工商大学硕士学位论文 曩e x n e r i s t d p h y l o c o c c t l sc i t r e t l s ，e s c h e r i c h i qc o l i ，s c i l m o n e l l aa n ds qq n ，1 0 m d i dn o ti n h i b i t e dt h e g r o 、机ho ft h e i ro w n b yc h a n g i n gt h ef 宅r m e n t a t i o n m e d i u ma n df e m e n t a t i o nc o n d i t i o n st oo p t i m i z et h e 伊o w t ho f 三口c f d 6 口c f ，甜s p ，绷幻肋加z j qa n dp r o d u c t i o no fp l a n t 撕c i nz j q ，w ef o u n dt h a tt h eb e s t 盯o w i n gc o n d i t i o n sa i l do p t i m a lp r o d u c t i o nc o n d i t i o n sw e r eb a s i c a l l yt h es a m e s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o dr e v e a l e dt h a tt h eb e s t c o m p o s i t i o no fm e d iu mf o rg l u c o s e2 ，p e p t o n e1 ，c o n c e n t r a t e dy e a s t e x t r a c t1 ，s o d i l i md i h y d r o g e np h o s p h a t eo 2 ，s o d i u ma c e t a t eo 5 ，3n l b b e r a m m o n i nl e m o na c i do 2 ，s o d i l i mc h l o r i d e0 2 ，o 1 t w e e n8 0a tt h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f3 0 ，6 0m l 2 5 01 1 1 l ，t 1 1 ei n i t i a lp hv a l u e o f6 5w h e nt h e h i g h e s ta c t i v i t y ，w a sl i p t ot h e o n g i n a lt w o - f 0 1 d u s i n g a m m o n i l l ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o nm e t h o dt oe x t r a c tp l a n t a r i c i nz j q 行o mt h e f e n n e n t a t i o nb r o t h ，g o i n gt h r o l i g hd i a l y s i sd e s a l t i n g ，c o n c e n t r a t i o n ，b a c t e “o c i n w a s e v e n t l i a l l y u s e dt “c i n e s d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i st od e t e n l l i n et h e m o l e c u l a r w e i g h t i tw a so fa b o u t5k d aw e i g h t k e y w o r d s ：三臼c ，f ) 6 口c z ，扰sp ，绷f 口，w 朋z j q ；p l a n t a r i c i nz j q ；i d e n t i f i c a t i o n ； r e s p o n s es u r f a c em e t h o d ；i s o l a t i o n i v 浙江工商大学硕士学位论文 第一章引言 乳酸菌与人类的生活息息相关，利用乳酸菌发酵来保存食品和饮料中的营养价值有 着悠久的历史。随着人们对其作用机制的深入研究，发现起主要抑菌作用的是乳酸菌在 发酵过程中产生的有机酸( 如乳酸、丁酸和醋酸等) 、过氧化氢和细菌素等抑菌物质。 随着化学防腐剂的危害、抗生素耐药性的发生等问题的目益加剧促使人们加快寻找一种 无毒、无副作用、无残留、无抗药性、并可以抑制或杀死多种致病菌和腐败菌的替代化 学防腐剂和抗生素的天然抑菌产品。f | 得l 酸衙细菌素以其天然特性势必在不远的将来为 人类的健康事业做j 巨大的贡献。 1 1 乳酸茵概述 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ，简称l a b ) 不是微生物分类学卜的名词，而是指一群可 发酵碳水化合物、发酵产乍大量乳酸的革! 皇氏卧盹球陌或杆阿的统称。广泛分布于人 和动物的肠道及其它与外界市f i 通的乍理叫：境。f ，许多食品、饲料以及臼然界的许多物料 中也有乳酸荫存在。自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可划分为2 3 个属1 2j ，他 们建立的乳酸菌系统进化树如图1 1 所示。其中乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属、明串 珠阿属以及舣歧杆菌属的一些菌种在发酵工业中有着广泛的应用，凶而乳酸菌被公认为 是安全的食品级微乍物( g r a s ) 1 3 4 j 。 浙江工商大学硕士学位论文 图1 1 基于1 6 sr r n a 序列分析建立的乳酸菌的系统进化树【5 】 f i g 1 一lt h ep h y l 9 9 e n yo fl a bb a s eo nl h es e q u e n c eo fl6 sr r n a 乳酸菌的主要生理功能可归结为以下五点：即维持肠道菌群的微生态平衡、增强机 体免疫功能、预防和抑制肿瘤发生和提高营养利用率、促进营养吸收和延缓机体衰老功 能。这些功能与乳酸菌在发酵过程中产生的有机酸、双乙酰、过氧化氢、胞外糖苷酶和 细菌素等多种拮抗物质紧密相关f 们。 随着科学技术的日新月异，乳酸菌已发展成一类重要的工业微生物，广泛应用于轻 工业、医药工业、发酵工业、食品工业和饲料工业上。乳酸菌具有丰富的基因库，是研 究生物多样性、分类、生理生化、遗传、分子生物学、基因工程的理想材料。发达国家 十分重视乳酸菌资源的搜集、保存及资源库和基因库的建立和基础研究，并在此基础上 对乳酸菌进行开发利用。如法国达能公司建立的乳酸菌保藏中心，共收集了乳酸菌约 2 浙江工商大学硕士学位论文 3 5 0 0 株。我国是一个乳酸菌资源丰富的国家，但至今仍未建立乳酸莳资源库。因此， 发掘、收集、保藏和研究我国的乳酸菌资源，建立乳酸菌资源库及基因库，对今后我国 乳酸菌资源可持续利用及提升我国发酵等相关工业的核心技术有着重要的意义。 1 2 乳酸茵细菌素 1 2 1 乳酸菌细菌素的概念 1 9 2 5 年g r a t i a 在研究大肠杆闭时发现，不同入肠杆菌菌株之间有抑制现象，而引 起抑制作用的物质后来被g r a t i a 和f r e d e r i c q 分离得到。这种物质类似j ：噬菌体，但不 能自主复制，f r e d e r i c q 称j 乓为大肠杆菌素i7 1 。1 9 5 3 年，j o c o b 等把由细蔺产生的对同源 细菌具有高度专一性的抗蒲货白物质统称为b a c t e r i o c i n ，即细菌素1 8 j 。目前，普遍认同 的细菌素的定义为细菌代谢过程【f i 通过核糖体合成并分泌到环境中的一类具有抗菌活 性的蛋白质或多肽，抑荫范i 列不局限于同源的细菌，产生菌对其细衙素有自身免疫性 0 1 。k o n i s k v 概括j ，细阿素的两人特征：货门阽和e l 身免疫性【l l 】。 细菌素以生产菌而命名，如人肠杆菌，k 牛的细菌素称大肠菌素，绿脓杆菌产生的细 菌素称绿脓菌素，乳酸菌产生的细菌素称为乳酸菌细菌素。乳酸菌细菌素来源非常广泛， 肉类、牛奶、奶酪、腌制黄瓜、橄榄、菠箩、葡萄汁、发酵面团、发酵木薯甚至粪便1 2 之1 l 等中分离的乳酸蔺郜能生产乳酸菌细菌素。 1 2 2 乳酸菌细菌素的分类 根据乳酸菌细菌素组成氨基酸的特点、化学结构、稳定性和相对分子质量大小等特 点，一般可将乳酸菌细菌素分为下面儿类。 1 2 2 1 羊毛硫细菌素( l a n t i b i o t i c s ) 羊毛硫细菌素是一类小分子的修饰肽，含1 9 3 8 个氨基酸分子，该类细菌素的特点 就是在翻译过程中被加工修饰，将组成性氨基酸转变成不常见氨基酸羊毛硫氨酸，翻译 后经过修饰，分子活性部位存在羊毛硫氨酸( l a n t h i o n i n e ) 、p - 甲基羊毛硫氨酸( p m e t h y l l a n t h i o n i n e ) 、脱氢酪氨酸( d e h d y r o b u t y r i n e ) 和脱氢丙氨酸( d e h d y r o a l a n i n e ) 等非编 码氨基酸。这些氨基酸以共价键形式在内部形成环状结构，一般来说在羊毛硫细菌素中 3 浙江工商大学硕士学位论文 含有1 2 个羊毛硫氨酸。含有2 个羊毛硫氨酸的羊毛硫细菌素具有较广的抗菌谱，不 仅能抑制或杀灭革兰氏阳性菌，同时对真核细胞也具有毒力作用。目前已发现的羊毛硫 细菌素依据结构和作用机理的不同，可以分为两类：a 类为延伸的螺旋状结构，带正电 荷，两亲性，能在细菌质膜上形成电位依赖性的孔隙；b 类为球形，带负电荷或不带电 荷，能抑制细菌细胞壁的合成，为酶抑制物。a 类的代表是n i s i n ，由乳酸链球菌产生， 由3 4 个氨基酸组成，含有五个硫醚环，分子量约3 5k d a 。其抗菌的机理是在敏感细菌 的质膜上形成电位依赖性的离子通道，使离子和小分子快速溢出，最终导致细菌死亡。 b 类大多由甲基羊毛硫氦酸( m e l a n ) 组成，含有4 个分子内的硫醚环，能与合成细菌肽 聚糖的重要前体l i p i di i 结合，抑制葡萄糖和d 丙氨酸渗入，从而阻i e 了细菌细胞壁单 体聚合形成具有功能的胞壁质，最终导致细菌缓慢溶解而夕e 亡。 1 2 2 2cia s si i 细菌素 一。般来说，c l a s si i 细菌素的分子晕较小( ( ) ( ) 5 ) ：“料”表，j 显著( p 【j 0 5 ) ：“料农，j ：极j 05 1 2 管( p ( j ( j 1 ) 。 n o t e ：“宰”i n d i c a t e st h a to 、e r 【1 0 5i s1 1 0 ts i g l l i n c a n t ： “宰宰”i n d i c a t c st h a tl e s st h a n 【) 0 5i ss i g n i 6 c a n t ； “木木奉”i n d i c a t e st h a tl c s st h a n ( 1 ( ) li se x t r e l l l e l ) s i g n i 6 c a n t 表4 1 2 模型可信度分析 t a b l e4 1 2f i ts t a t i s t i c sf o ry 指标结果 r - s q u a r c d a d jr - s q u a r e d c v r m s e 0 9 7 1 8 0 9 3 5 4 1 3 l 0 0 3 4 浙江工商大学硕士学位论文 ，f 穸 、i c ：蝴1 麓一一丽巧i 一彳。”5 c ：蛋白胨 0 2 、- 一币7 、- ，一。 u # 。”。” b ：酵母掰 图4 5 葡萄糖、酵母粉和蛋白胨对植物乳杆陌素z j q 合成的响应面图 f i g 4 5r e s p o n s es u i f a c e p l o to fg l u c o s e ? 、e a s te x t r a c ta n dp c p t o n ec o n c c n t r a t i o no np r o d u c t i o no f p l a l l t a r i c i nz j q 由d e s i g ne x p e r t 7 1 回归拟合实验数据所得2 次经验模型为： y = 2 7 4 + o 0 0 8 7 5 术a + o 0 4 6 木b + 0 0 3 5 木c + 0 0 4 0 木a 木b + o 0 0 2 5 木a 术c o 0 8 8 术b 术c o 1 6 水a 2 0 o 9 6 书b 2 o 0 9 8 术c 2 ( 4 2 ) 分析以上图表结果可知，表4 一l1 、表4 1 2 反映植物乳杆菌素z j q 活性的回归模型 的方差分析结果，从中可以发现该回归模型在9 9 的概率水平上是极显著的，而其失 拟项为6 4 ，不显著。该模型中葡萄糖葡萄糖、酵母粉酵母粉、蛋白胨蛋白胨、蛋 白胨酵母粉、酵母粉的影响足极其显著的；蛋白胨、葡萄糖一酵母粉的影响比较显著； 而葡萄糖、葡萄糖一蛋白胨的影响则不显著。 由d e s i g ne x p e r t 7 1 计算得该模型确定系数r 2 = o 9 7 1 8 ，表明模型与实际情况拟合很 好，因此可用方程4 2 代替真实实验点对活性进行分析和预测。根据模型导出的方程 4 2 ，二次项平方的系数均为负值，方程表达的抛物面开口向下( 见图4 5 ) ，存在极大 值点。对方程4 2 求导，可以得到模型的极值点。当葡萄糖的添加量为2 0 3 ，酵母粉 的添加量为1 0 5 ，蛋白胨的添加量为1 0 2 ，此时模型预测的最大响应值为2 7 4c m 。 4 7 浙江工商大学硕士学位论文 为了检验模型预测的准确性，在最佳发酵条件和原始发酵条件下分别进行发酵试验，所 得实际抑菌圈直径分别为2 7 6c m 和2 5 7c m ，可见该模型能较好地预测实际发酵情况。 4 4 本章小结 ( 1 ) 对培养环境条件进行了单因子的优化，结果表明在测定时间控制在2 4 h 时， 在3 0 、6 0m l 2 5 0m l 、初始p h 值为6 5 的发酵条件下，植物乳杆菌z j q 的产量和其 发酵产细菌素的生物量比优化前有较大提高。菌体的最佳生长温度和产细菌素的最佳温 度一致，均为3 0 。 ( 2 ) 时培养璀成分进行单因了研究，结果表明影响植物乳杆菌z j q 产细菌素的最 重要的素是碳氮源，葡萄糖足最佳碳源，酵母粉、蛋白胨、柠檬酸三铵组成的混合氮 源可显著提高细菌索活性。磷酸根离子有缓和发酵液产酸作用，金属离子中一定浓度的 n a + 对产：细衙素非常有利。而吐温8 0 对细菌素的合成不足必须的，但较高浓度的吐温 8 0 能促进绌菌素的合成。 ( 3 ) 采川响应面试验设计法刘起明显影响的培养基成份进行优化，获得最佳条件 为：葡萄糖2 0 3 ，酵母粉1 0 5 ，蛋白胨为1 0 2 。响应面中的产细菌素模型预测显 著性好，确定系数高达9 7 ，失拟可能性小，有很好的预测效果。 ( 4 ) 结合单因子和响应面实验，获得了发酵产植物乳杆菌素z j q 的优化培养基组 成为：葡萄糖2 、蛋白胨l 、浓缩酵母粉1 、磷酸二氢钠o 2 、乙酸钠0 5 、柠檬 酸三铵o 2 、氯化钠0 2 、吐温8 00 1 ；最佳发酵条件为：3 0 、6 0m l 2 5 0m l 、 初始p h 值6 5 。在此条件下，植物乳杆菌素z j q 的抑菌圈直径由2 5 1c m 提高到2 7 6c m ， 其抑菌活性有了显著提升。 4 8 浙江工商大学硕士学位论文 第五章植物乳杆菌素z j q 的分离 不同乳酸菌细菌素之间分子量、等电点、疏水性有差，如l a c t o c i n 2 7 的分子量为1 2 4 l ( d a ，而p l a n t a r i c i na m a k 的分子量仅为2 9l a ，最终导致其分离纯化途径有差。粗 分是分离纯化的第一步，应尽可能最大量的捕获目标物，同时应考虑其残留活性大小及 后续分离的难易。乳酸菌细菌素的化学本质是蛋白质，故其粗分常采用硫酸铵盐析、吸 附和离心等非特异性和低分辨率的分离方法。 电泳分离蛋白质一般采川p a g e ，常用系统有：大孔胶系统和t r i s t r i c i n e 系统。 人孔胶系统可征一块凝胶上分离分子最1 0k d a 4 5 0k d a 的贷i7 i 质，。门j + 允许最岛上样可 达2 0 0 肛l ，并仍能得到狭窄的条带，但大孔胶系统中蛋白质分子毓的l o g 值和其相对迁 移距离的关系f i 完全成线性，故用它测定的分子最的准确度小高；t r i s t r i c i n e 系统适 合小分子蛋白和多肽分离，分子量兀丁低至1k d a ，而日效果良好。 本章中，首先采川截留量为1 0 0 0d a 的超滤膜将发酵j ：清液分成了部分( 截留样品、 膜上样品、过膜样品) ，再选取有活性部分的超滤十￥ ( 1k d a ) 进彳硫酸铵梯度盐析， 进一步分离得到较纯的细菌素样品。经透析除盐浓缩后用t r i c i n e s d s p a g e 对植物乳 杆菌素z j q 的分子量和纯度进行测定。 5 1 材料和仪器 5 1 1 菌种 试验菌株：植物乳杆菌( 订c ，( ) 6 伽? 胁“p 砌，细1 册z j q ) ，本实验室保存；指示菌： 藤黄微球菌( 蚴删c c 甜s 助陀z ，s1 0 2 0 9 ) 购自中国工业微生物菌种保藏中心，菌种保藏 于2 0 。 5 1 2 主要试剂 m r s 培养基( o x o i d ，e n g l a n d ) 购自上海朗瑞生物科技有限公司；尿素，巯 基乙醇，过硫酸铵，t e 姬d ，丙烯酰胺，甲又双丙烯酰胺，三羟甲基氨基甘氨酸，t r i s 碱，s d s ，低分子量蛋白质标准品b m 2 0 1 ( 6 6 、4 5 、3 5 、2 7 、2 0 、1 4 4 、9 5 、6 5 、4 1 l a ) ， 4 9 浙江工商大学硕士学位论文 均购自上海生工生物工程有限公司，其他试剂均为国产分析纯。培养基及试剂配方见附 录。 5 1 3 主要仪器 m i l l i q b i o c e l 超纯水仪购自美国m i l l i p o r e 公司；e 1 2 1 4 0 电子分析天平购自美 国o h a u s 公司；洁净工作台1 0 0 级购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂：l r h 2 0 5 a 生化培养箱购自广州省医疗器械厂；手提式压力蒸汽灭菌器y x o s g 4 1 2 8 0 购自上海华 微医用核子仪器有限公司；小型垂直电泳仪购自美国伯乐公司；g s 8 0 0 扫描仪购自美 国伯乐公司；3 k 3 0 台式高速冷冻离心机购自美国s i g a m 公司；7 8h 1 | i 一1 陋温加热磁力 搅拌器购自杭州仪表电机自限公司：浓缩仪购自美【卡j 热电公司；t h z c 一1 台式冷冻恒温 振荡器购白太仓市实验设备厂；脱色摇床9 1 ；l 自太仓市实验设备厂。 5 2 实验方法 5 2 1 菌种的保存及繁殖 参照第二章2 2 1 。 5 2 2 发酵液的预处理 将培养2 4 h 的植物乳杆菌z j q 于1 0 0 0 0r p m ，4 冷冻离心2 0m i n ，取发酵上清液。 根据超滤膜的误差范围为3 5 倍，选用截流量为1 0 0 0d a 的超滤膜来截流大分子物质。 取1 5 0m l 于超滤杯中，用氮气装置增加压力( 0 0 3m p a ) ，超滤过膜样品、截留样品 和超滤膜上的样品通过牛津杯双层平板法检测各自的残留活性，选取有活性部分，进行 硫酸铵盐析。 5 2 3 硫酸铵梯度沉淀 向超滤过的发酵上清液中加入硫酸铵进行盐析试验，其饱和硫酸铵梯度设置如下： 3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 。4 下震荡过夜，l 0 0 0 0r p m 离心1 5m i n ( 下 同) ，收集沉淀和原先上清液一起检测抑菌活性，以相同硫酸铵饱和度的水及m r s 培养 浙江工商大学硕士学位论文 基的上清液及沉淀为对照。 将上述细菌素粗提液，分置于3 0 、4 0 、5 0 、6 0 4 个硫酸铵饱和梯度组中， 然后4 过夜，并离心，取上清液，各组分别追加l o 饱和度，4 过夜并离心，其上清 液和盐析沉淀检测活性，对照设置同上。 将两次盐析得到的粗提液再追加1 0 的饱和度，4 过夜并离心，其上清液和盐析 沉淀检测活性，对照设置同上。 5 2 4 透析、浓缩 发酵上清液巾的细菌素含量极低，经硫酸铵盐析后自所浓缩，但为了加强 t r i c i n e s d s p a g e 条带的清晰度，需进一步除盐浓缩。考虑尘| j | _ j 标细菌素的分子量较 小，而透析袋的误差范围为3 1 0 倍，故选取1 0 0d a 的透析袋，以免细蔺素的泄露。将 盐析后的沉淀经透析袋透析2 4h 后，冉真空浓缩虿原体积的1 2 。 5 2 5t ricin e s d s p a g e 5 2 5 1 聚丙烯酰胺凝胶的配制 分离胶( 致密胶) 是凝胶电泳系统中的核心部分，起分子筛和载体的作用，它的浓度 与交联度直接影响到样品分离效果，参考相关文献资料并考虑到本实验要求和实验条件 选用了如下浓度的分离胶、夹层胶和浓缩胶。其余缓冲液的配办见附录。 表5 1 不同的丙烯酰胺溶液的组剧9 2 】 t a b l e5 - lt h ec o m p o n e n to fd i f 亿r e n ta c q l a m i d es o l u t i o n 浙江工商大学硕士学位论文 5 2 5 2 灌胶 分离胶( 致密胶) 、夹层胶、浓缩胶自下而上连续灌胶。灌胶时有以下几点注意事 项：1 a p 是凝固剂、t e 砸d 是促进凝固剂，应在灌胶前加入，并迅速混合均匀。2 底下两层胶灌入后，需以1 s d s 压胶封顶，注意不要混进气泡。3 分离胶的高度约为 3 5c m ，室温凝固2 0m i n 以上，夹层胶的高度为lc m ，室温凝固1 0m i n 以上，浓缩胶 室温凝固3 0m i n 以上。 5 2 5 3 样品的处理及电泳 ( 1 ) 样品处理：将粗分浓缩后的样品与上样缓冲液以1 ：1 混合均匀后，1 0 0 水浴加 热5m i n ，使蛋白变性。 ( 2 ) 点样：每孔加经处理的样品2 0 江，蛋门质标准品上样量为2 此。 ( 3 ) 电泳：每孔内槽加入负极电泳缓冲液，外槽加入工f 极电泳缓冲液，形成 t r c i n e s d s p a g e 电泳系统。先设电压6 0v ，待指刁；条带跑至央层胶与浓缩胶交界处 时，再设1 2 0v 电压，电泳总汁时3h 。 ( 4 ) 染色、脱色、成像：考马斯亮蓝r 2 5 0 染1 5h ，再脱色4 5 次，间隔1 5m i n 。 脱色至背景无色后，用扫描仪扫描成像。 5 3 结果和分析 5 3 1 硫酸铵梯度沉淀 一次盐析后杂蛋白含量较高，而过高的硫酸铵饱和度不利于后期的分离纯化，寻找 一个合适的硫酸铵饱和梯度，实验通过一次盐析、二次盐析、三次盐析沉淀细菌素，结 果见表5 2 。一次盐析时，6 0 、7 0 、8 0 、9 0 的沉淀都含有细菌素，而8 0 的活性 最高；二次盐析时，只有7 0 8 0 梯度的沉淀中含有细菌素，但活性较低；三次盐析 时，3 0 一4 0 5 0 梯度的沉淀显示了很高的活性。接下来选用了8 0 、3 0 4 0 5 0 的组分进行透析浓缩、电泳分析。 5 2 浙江工商大学硕士学位论文 表5 2 硫酸铵沉淀的抑菌活性 t a b l c5 2a n t i b a c c e r i a la c l i 、i b o fa n l n l o n i u ms u l f a i cf r a c t i o i l a t i o n 5 3 2 超滤、透析处理后的抑菌活性 根据超滤膜的误差范围为3 5 倍，选川截流量为1 0 0 0d a 的超滤膜，发现过膜样品 为目标物，可初步估计该细菌素的分子量小于6 0 0 0d a 。发酵上清液过膜后，再经硫酸 铵盐析，沉淀物含盐量较高，不利于进一步的分离和分了量测定。采取透析可以在保存 较大活性的情况下迅速除盐，结果见表5 3 。 表5 3 超滤、透析后的抑菌活性 t a b l c5 - 3a 1 1 i i b a c t c r i a la c c i 、i b o fu l t r a n l t r a t i o l la 1 1 dd i a l js i s 浙江工商大学硕士学位论文 5 3 3t ric in e s d s p a g e 检测细菌素分子量 常规聚丙烯酰胺电泳方法分离1 0k d a 以下的小肽效果差。传统上分离小分子肽用 连续梯度胶，制作较麻烦，而且需要专门的灌胶设备。s c h a g g e r 等1 9 3 j 改用 t n c i n e s d s p a g e 系统后，对小分子肽的分辨率明显提高。曹佐武1 9 2 1 发现致密胶中添 加尿素可以明显改善分离效果。能有效区分分子量为1l ( d a 的小分子多肽。 2 0 髓a 一 9 5 勋a 一。 6 5 豳a 一- 啼约5 趵a 4 1 豳a 一 l ：8 0 组分；2 ：3 0 一4 ( ) - 5 ( ) ；m ：m a r k e rb m 2 0 l 图5 1 硫酸铵梯度沉淀组分的t r c i n e s d s p a g e f i g 5 - it r c i n c - s d s - p a g eo fa m m o n i u ms u l f a t ef a c t i o n a t i o n 为鉴定细菌素，对其分子量进行初步估计，实验采取8 0 、3 0 4 0 一5 0 的沉淀 组分进行进一步的t r c i n e s d s p a g e 电泳检测，结果见图5 1 。有图可知，8 0 组分中 杂蛋白成分较多，而目标蛋白含量极低，3 0 - 4 0 5 0 组分基本没有杂蛋白，根据电 泳结果初步估计此细菌素的分子量大约在5 ol ( d a 左右。 5 4 本章小结 发酵上清液经过l o o od a 膜超滤后，只有过膜部分发酵液具抑菌活性。再采用 3 0 4 0 5 0 的硫酸铵饱和梯度沉淀过膜样品可较大的捕获目标细菌素，经过透析、 浓缩后的组分进行进一步的t r c i n e s d s p a g e 电泳检测，根据电泳结果初步估计植物 乳杆菌素z j q 的分子量大约在5 ok d a 左右，属于小分子多肽类物质。 浙江工商大学硕士学位论文 6 1 工作总结 第六章结论 1 、根据z j q 菌株形态特征和生理生化特征，16 sr d n a 建立系统发育树发现该菌 株是一株新型的产细菌素菌株，命名为p 砌，伽，朋z j q 。其所产细菌素命名为 p l a n t a r i c i nz j q 。 2 、初步研究丫p l a n t a r i c i nz j q 的些摹本性质，p l a n t a r i c i nz j q 属丁广谱细菌素，包 括北致病菌，如：枯草芽孢杆菌、滕黄微球蔺、人肠淆、沙门氏荫、肠产毒性大肠 杆菌、肠致病性大肠杆菌、痢疾志贺氏阿等。p l a n t a r i c i nz j q 在酸性条件卜才表现h j 活 性，耐高温，对蛋i ，j 酶k 和腴夤自酶敏感。 3 、从茼株生长条什和牛长环境力面研究了影响j e 牛物合成的因素。结合单因了和 响应m 实验，获得了发酵产植物乳杆菌素z j q 的优化培养璀组成为：葡萄糖2 、蛋白胨 1 、浓缩酵母粉1 、磷酸氧钠o 2 、乙酸钠o 5 、柠檬睃i 铵o 2 、氯化钠o 2 、 叶温8 00 1 ；最佳发酵条件为：3 0 、6 0m l 2 5 0m l 、初始p h 值6 5 。在此条件下，植 物乳杆菌素z j o 的抑菌圈直径由2 5 lc m 提高到2 7 6c m ，其抑芮活性增加显著。 4 、初步测定了p l a n t a r i c i nz j q 的分子量，发现p l a n t a r i c i nz j q 分子晕为5k d a 左右， 属于小分子热稳定多肽。 6 2 工作展望 1 、通过指示菌作用前后的形态及内容物的流失情况，研究p l a n t a r i c i nz j q 的作用机 制。 2 、摸索进一步纯化的分离条件，制备出一定量的p l a n t a r i c i nz j q 纯品，对其进行氨 基酸全序列分析，并通过反向p c r 技术扩增出其生物合成相关基因，研究其生物合成的 全程。 3 、在分子生物学基础上对影响其生物合成的因素进行研究，争取人幅度提高其合 成水平。 浙江工商大学硕士学位论文 参考文献 【1 】 z a u n m u l l e r t ， e i c h e r t m ， c h t e rh ，u n d e ng v a r i a t i o n si nt h e e n e r g y m e t a b o l i s m o f b i o t e c h n o l o g i c a l l yr e l e v a n th e 衙o f e 咖e n t a t i v e ，口c “c 研d6 钟陀一ad 嘶n gg r o 、t ho ns u g a r s 锄d o 唱a n i ca c i d s 【j 】a p p lm i c r o b i o lb i o t e c h n o l ，2 0 0 6 ，7 2 ：4 2 1 4 2 9 【2 】凌代文，东秀珠乳酸细菌分类鉴定及实验方法【m 】北京：中国轻工出版社1 9 9 9 3 4 【3jh o s o d am h a s h i m o t oh ，h ef ，m o r i ah ? h o s o n oa e f f e c to fa d m i n i s t r a t i o no fm i l kf c n n c n t c dw i t h f ，c ，d 6 订c ? ，矗f s ( 7 f j c 坳，7 j f s l a - 2o nf e c a ln l u t a g e n i c i b + a n dl n i c r o n o r ai nt h ch u n l a ni n t e s t i n e 【j 1 j o u m a lo fd a i o s c i e n c e ，1 9 9 5 7 9 ：4 5 4 9 1 4la h n l es ? n o b a e ks ? j e p p s s o nb ? e ta 1 m o l i n t h cn o n n a i 订c ，d 6 订c f ，? “7 d ，y 7o fh c a l t h ) h u n l a nr e c t a l a 1 1 dm u c o s a i j l j o u m a lo f a p p i i e dm i c r o b i o l o g j 1 9 9 8 8 5 ：8 8 - 9 4 f 5 1 李景良植物乳杆菌z j 3 1 7 产细菌素的初步研究【d 】杭州：浙江j ：商人学食品与生物工程学 院2 0 0 9 ：2 4 【6 ll i l l d g r c nsw d o b r o g o s zwj f e m sm i c m b i o lr c 、9 9 ( ) 8 7 ：1 4 9 - l6 4 f 7 】g r a t j aa ，f r e d e r i c qp ，j o i r i se ? e ta 1 t 1 1 ci e c h n i q u eo fd o u b l el a j e ro fa g a r a g a ra n dt h cd i s t r i b u t i o no f c o l i c i n ep r o d u c i n gg e m si nn o 啪a ia n dp a t h o l o g i c a lf e c a lm a t t e ro fm a na n da n i n l a l s p 】a n t o n i e v a nl e e u 、e n h o e k ，1 9 5 0 ，1 6 ：3l - 3 7 【8 1j e n n i f e rc l e v e l a n d ，t h o m a sjm o n t 、i l