（遗传学专业论文）人lc3bβ的鉴定及其对lc3bα的负反馈调节机制.pdf

复日大学博+ 论文缩写词表 缩写词表 缩写全称 a a b l a s t b p k d a c d n a g s t h r p i p t g p a g e p b s 乙c 3 m a p e s t o r f m d p e g a t e - 1 6 g a b a r a p a t g 4 a m i n oa c i d b a s i c l o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b a s ep a i r k i l o d a l t o n ( s ) c o m p l e m e n t a r yd n a g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y l b d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e p 0 1 y p r o p y l e n ea c y lg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a li n e 1 i g h tc h a i n3 m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n e x p r e s s e ds e q u e n c et a g o p e nr e a d i n gf r a m e m o l e c u l a rd y n a m i c s p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e g o l g i - a s s o c i a t e da t p a s ee n h a n c e ro f1 6 k d y - a m i n o b u t y r i c a c i d r e c e p t o r a s s o c i a t e d p r o t e i n u t c i p h a _ g y - r e l a t e d4 复巨大学博士论文 摘要 摘要 大鼠微管相关蛋白1 轻链3 ( l c 3 ) 经过一系列翻译后修饰，最后定位到自 噬体膜上，目前已经作为自噬体的分子标记广泛应用于自噬过程和与之相关的许 多生理，病理过程的研究中。我们以前报道了3 个人l c 3 家族的新成员，l c 3 a ， l c 3 b 和l c 3 c 。l c 3 a 和l c 3 c 与酵母a t 9 8 和大鼠l c 3 相类似，经历了一系列的翻 译后修饰，包括羧基末端的切割；但l c 3 b 羧基末端不被切割，产生了一种不同 于大鼠l c 3 的依赖于羧基末端未被切割的赖氨酸( l y s l 2 2 ) 的新的翻译后修饰方 式。最近日本学者报道人l c 3 b 的羧基末端也能被切割，并进一步在g l y l 2 0 产生 修饰，与大鼠l c 3 类似。 为了阐述清楚这个问题，我们首先证明人l c 3 b 由于可变剪接产生了两种亚 型，l c 3 b a 和l c 3 b 一6 ，分别具有或缺失a r 9 7 0 。l c 3 b _ a 和l c 3 b - j 3 在人的多种 组织中都广泛表达。l c 3 b - a 发生了典型的羧基末端切割反应，而且定位到自噬 体膜上；l c 3 b b 不能。当l c 3 b a 的g l y l 2 0 突变时，其羧基末端不能切割，此时 l c 3 b - a 的电泳行为与l c 3 b - p 相同，且都受l y s l 2 2 1 2 1 的影响。通过质谱分析， 我们发现尽管l c 3 b - 3 和l c 3 b - p - k 1 2 1 a 在电泳上表现为相差2 k d ，但它们的分子 量几乎相同，也就是说l c 3 b b 上没有发生修饰。我们还对l c 3 b - 硼l c 3 b p 的结 构进行同源模拟，结果表明l c 3 b 一泖l c 3 b 一6 的羧基末端具有不同的结构：l c 3 b - a 的羧基末端游离于其蛋白主体之外，不停的运动；而l c 3 b 一6 的羧基末端与其蛋 白主体紧密结合在一起，是固定不动的，进一步从结构水平上解释了为什么 l c 3 b - a 和l c 3 b - p 的羧基末端具有不同的切割反应。g s tp u l l d o w n 实验证明 a t g 4 b 与l c 3 b - a 和l c 3 b 一6 都能相互作用，而且 t g 4 b 能在体外切割l c 3 b - a 的羧 基末端。将l c 3 b - a 和l c 3 b - p f 司时转染细胞，发现l c 3 b b 能抑制l c 3 b - a 羧基末 端的切割，并影响l c 3 b - a 的修饰和自噬体膜定位，提示l c 3 b b 在体内可能具有 负调节自噬体形成的功能。 此外，本文还对本实验室以前克隆的大鼠l c 3 a 和l c 3 b 的翻译后修饰方式进 行了进一步的研究。发现大鼠l c 3 a 和l c 3 b 经过了与大鼠l c 3 相同的翻译后羧基 末端切割和修饰反应，并且都能定位到自噬体膜上。而且羧基末端保守的甘氨酸 复日- 大学博士论文摘要 ( g l y l 2 0 ) 是大鼠l c 3 a 和l c 3 b 翻译后羧基末端切割和修饰，以及自噬体膜定位 所必须的。因此我们认为大鼠l c 3 a 和l c 3 b 能作为新的自噬体分子标记，广泛 应用于对自噬过程以及与之相关的生理和病理过程的研究之中。 关键词：l c 3 b a ，l c 3 b b ，可变剪接，羧基末端切割，结构模拟，自噬作用 2 复巨大学博七论文 a b s t r c t a b s t r a c t r a tm i c r o t u b u l e a s s o c i a t ep r o t e i n s11 i g h tc h a i n3 ( l c 3 ) u n d e r g o e sa s e r i e so fp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s a n df i n a l l yl o c a l i z e st o a u t o p h a g i cm e m b r a n e s a1 i p i d a t e df o r mo fl c 3 ，l c 3 一i i ，h a sb e e ns h o w nt o b ea na u t o p h a g o s o m a lm a r k e ri nm a m m a l s ，a n dh a sb e e n u s e dt os t u d y a u t o p h a g yi np h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i cp r o c e s s e s w eh a v er e p o r t e d t h r e eh u m a nm e m b e r so fl c 3f a m il y ，n a m e dl c 3 a ，l c 3 b ，a n dl c 3 c l c 3 aa n d l c 3 cu n d e r g ot h es a m ep o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o na sy e a s ta t 9 8a n d r a tl c 3 w h i c he n t a i l st h ec h a r a c t e r i s t i cc - t e r m i n a lc l e a v a g ea f t e ra c o n s e r v e dg l y c i n er e s i d u e ，b u tt h i sc - t e r m i n a lc l e a v a g ew a sn o to b s e r v e d i nl c 3 b w ed e t e c t e dan o v e lt y p eo fm o d i f i c a t i o nf o rl c 3 b ，a n dt h es i t e o fp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o nf o rl c 3 bi sl y s l 2 2r a t h e r t h a nt h e c o n s e r v e dg l y l 2 0i nt h eo t h e rt w op r o t e i n s h o w e v e r ，ar e c e n ts t u d y r e p o r t e dt h a tt h ec - t e r m i n u so f l c 3 bc o u l db ec l e a v e dt oe x p o s et h e c o n s e r v e dg l y l 2 0f o rf u r t h e ru b i q u i t y l a t i o n - 1 i k er e a c t i o n s t oc l a r i f yt h et w oi n c o n s i s t e n t o b s e r v a t i o n s ，w ep r o v e d t h a t a l t e r n a t i v es p l i c i n gl e a d st ot w oh u m a nl c 3 bi s o f o r m sw i t ha n dw i t h o u t a r 9 7 0 ( d e s i g n a t e da sl c 3 b - aa n dl c 3 b 一8 ，r e s p e c t i v e l y ) i tw a sf u r t h e r d e m o n s t r a t e dt h a tl c 3 b au n d e r g o e st h ec h a r a c t e r i s t i cm o d i f i c a t i o n s t r i g g e r e db yc t e r m i n a lc l e a v a g ea f t e rg l y l 2 0a n dl o c a l i z e st o a u t o p h a g o s o m a lm e m b r a n e s1i k er a tl c 3 ，w h e r e a sl c 3 b ph a sn o t ，s u g g e s t i n g t h a tt h eh r 9 7 0c o n t r o l st h ec t e r m i n a lc l e a v a g ea n dc e l l u l a rl o c a l i z a t i o n o fh u m a nl c 3 t h r o u g hm a s ss p e c t r u ma n a l y s i s ，w ef o u n da l t h o u g ht h el y s l 2 1 m u t a t i o no fl c 3 b bc a na f f e c tt h ee l e c t r o p h o r e s i so ns d s p a g e ，t h e m o l e c u l a rw e i g h t so f l c 3 b p a n dl c 3 b p - k 1 2 1 aa r ea l m o s t i d e n t i c a l ， s u g g e s t i n gt h a tt h e r ei sn om o d i f i c a t i o no nl c 3 b b t og a i nt h e m e c h a n i s t i ci n s i g h ti n t ot h ed i s t i n c tc t e r m i n u sc l e a v a g eo fl c 3 b - aa n d 3 复巨大学博士论文 b s t r c t l c 3 b 一艮w ep e r f o r m e dm o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n st oi n v e s t i g a t et h e e f f e c t so fa r 9 7 0o nt h ec o n f o r m a t i o no ft h ec t e r m i n i i tw a sr e v e a l e d t h a tt h ec - t e r m i n u so fl c 3 b ai sf l e x i b l ea n dd i s o r d e r e d w h e r e a st h a t o fl c 3 b bi st i g h t l yb o u n dt ot h em a i nb o d yo ft h ep r o t e i n ，e x p l a i n i n g t h ei n a b i l i t yo fl c 3 b bt ou n d e r g oc t e r m i n a lc l e a v a g e b o t hl c 3 b aa n d l c 3 b bc a ni n t e r a c tw i t ha t g 4 b ，t h ec y s t e i n ep r o t e a s e st h a tc l e a v et h e c - t e r m i n a lo fl c 3 m o r e o v e r ，l c 3 b p m o d i f i c a t i o no fl c 3 b o l s u g g e s t i n g a u t o p h a g y c a ni n h i b i tt h ep o s t t r a n s l a t i o n a l t h a tl c 3 b 一6c a nn e g a t i v er e g u l a t e a d d i t i o n a l l y ，w ef o u n dr a tl c 3 aa n dl c 3 b ，t w on o v e li s o f o r m so fr a t i 上3 。u n d e r g ot h es a m ep o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n sa n dl o c a l i z et o a u t o p h a g i cm e m b r a n e sa sr a tl c 3 m o r e o v e rt h ec o n s e r v e dg l y l 2 0r e s i d u e s o fr a tl c 3 aa n dl c 3 ba r ea l s oe s s e n t i a lf o rt h e i rc h a r a c t e r i s t i c c - t e r m i n a lc l e a v a g ea n dl o c a l i z a t i o nt oa u t o p h a g i cm e m b r a n e s p r e s e n t d a t as u g g e s t e dt h a tr a tl c 3 aa n dl c 3 bc o u l da l s ob eu s e da st w on o v e l a u t o p h a g o s o m a lm a r k e r s k e y w o r d s ：l c 3 b - a ，l c 3 b 一瞰a l t e r n a t i v es p l i c i n g ，c - t e r m i n a lc l e a v a g e ， m o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n s ，a u t o p h a g y 4 复巨大学博士论文第一章人l c 3 b b 的鉴定及其对l c 3 b n 的负反馈调节机制 第一章人l c 3 b p 的鉴定及其对l c 3 b c t 的 负反馈调节机制 前言 自噬是降解细胞内蛋白质和衰老或多余细胞器的一个重要途径 1 。自噬作 用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键【2 】，对防止 某些疾病如肿瘤【3 】、肌病【4 】、神经退行性疾病 s f a 及对抵御病原微生物的感染 【6 】和延缓衰老、延长寿命【7 】等方面发挥重要作用。随着参与自噬过程的关键分 子的鉴定成功，我们对其分子机制、生理功能和在病理过程中的作用有了进一步 的了解。一份全新的国际性杂志 a u t o p h a g y 己在2 0 0 5 年4 月份出版，有关自 噬研究的第一次国际性会议也已于2 0 0 5 年4 月在意大利召开。估计正如当年对 细胞凋亡的研究一样，对自噬的关注很快会在生命科学领域形成一个新的研究热 点，例如2 0 0 4 年科学杂志曾预测对自噬的研究会成为2 0 0 5 年生命科学领域 的六大热点之一。 目前关于自噬的研究进展主要得益于对酵母自噬的研究。酵母的分子遗传 表明类泛素化蛋白a t 9 8 与磷脂酰乙醇胺( p e ) 的结合是酵母自噬体形成所必须 的 8 一i l 。为此，h t 9 8 必须经历一系列翻译后修饰：新合成的h t 9 8 蛋白的羧基 末端被半胱氨酸蛋白酶h t 9 4 切割，暴露出羧基末端的甘氨酸 1 2 ，然后被一种 e 1 类似的酶h t 9 7 激活 1 3 ，1 4 ，转运到e 2 类似酶h t 9 3 1 5 ，最后与磷脂酰 乙醇胺( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e ) 结合，定位到自噬体膜上 9 。 与自噬相关的类泛素化结合系统在真核生物中是非常保守的。已经有3 种 h t 9 8 哺乳动物同源物被鉴定出来并得到广泛研究：分别是l c 3 ( m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i nl i g h tc h a i n3 ) 1 6 ，1 7 ，g a b a r a p ( 7 - a m i n o b u t y r i ca c i dr e c e p t o r a s s o c i a t e dp r o t e i n ) 1 8 和g a t e - 1 6 ( g o l g i a s s o c i a t e da t p a s ee n h a n c e ro f1 6k d a ) 1 9 。其中，大鼠l c 3 与自 噬的关系研究得最多。新合成的l c 3 的羧基末端立即被半胱氨酸蛋白酶a t g 4 b 切割，暴露出羧基末端的甘氨酸( g l y l 2 0 ) ，这种形式的l c 3 被定义为l c 3 一i ， 定位在细胞质中 2 0 一2 2 。i j c 3 一i 进一步被a t 9 7 和h t 9 3 激活，最后与磷脂酰乙 5 复黾大学博士论文第一章人l c 3 b b 的咎定及其对l c 3 b a 的负反馈调节机制 醇胺( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e ) 结合，定位到自噬体膜上 2 3 ，2 4 。结 合在膜上的l c 3 被定义为l c 3 一i i ，目前已经作为自噬体的分子标记广泛应用于 许多生理过程和疾病的研究中。而且，在哺乳动物中已经鉴定出四种酵母a t 9 4 的同源物( a t g 4 a d ) ，它们都包含一个保守的半胱氨酸残基，被认为是c 5 4 半胱 氨酸蛋白酶家族的新成员 2 5 。目前已经证明人a t g 4 b 能在体外切割l c 3 ， g a b a r a p 和g a t e 1 6 的羧基末端 2 0 2 2 。 我们以i j 报道了3 个人l c 3 家族的新成员，分别命名为l c 3 a ，l c 3 b 和l c 3 c 2 6 。l c 3 a 和l c 3 c 与酵母a t 9 8 和大鼠l c 3 相类似，经历了一系列的翻译后修 饰，包括羧基末端的切割；但l c 3 b 羧基末端不被切割，在电泳上只有一条与 l c 3 一i i 大小相似的条带，当其l y s l 2 2 突变时电泳行为改变，大小与l c 3 一i 相似， 因此我们猜测人l c 3 b 可能产生了一种不同于人l c 3 a 和l c 3 c ，依赖于未被切割 羧基末端的赖氨酸( l y s l 2 2 ) 的新的翻译后修饰方式 2 6 。但是，最近日本学者 报道人l c 3 b 的羧基末端也能被切割，并进一步在g l y l 2 0 产生修饰，与大鼠l c 3 类似 2 7 。 为了阐述清楚这个问题，我们重新检查了所有与人l c 3 b 相关的核苷酸序列， 意外的发现在人e s t 数据库中有两种人l c 3 b 的核苷酸序列。其中较少e s t 序列 支持的那种与很多e s t 序列支持的相比较，缺少了3 个碱基a a g 。进一步对l c 3 b 基因组分析发现这种差异是由于l c 3 b 的信使r n a 第四号内含子的3 末端序列为 a g a a g ，有两个剪接受体位( a g ) ，结果剪接时在a g 的选择上发生了可变剪接而 导致的。两种l c 3 b 的亚型一种编码1 2 5 个氨基酸，在6 8 7 0 位具有3 个连续的 精氨酸( a r 9 6 8 - 7 0 ) ；另一种与之相比，只编码1 2 4 个氨基酸，在氨基酸序列上 缺少了a r 9 7 0 ，虽然从核苷酸序列上体现为缺少了编码a r 9 6 8 的3 个碱基。我们 以前报道的并用于实验的实际是缺少a r 9 7 0 的亚型。 在本文中，我们首先证明由于可变剪接，人l c 3 b 产生了两种亚型，l c 3 b a 和l c 3 b b ，分别具有或缺失h r 9 7 0 。l c 3 b - a 和l c 3 b - p 在人的多种组织中都广泛 表达。将l c 3 b 一硼l c 3 b b 瞬时转染细胞，w e s t e r nb l o t t i n g 发现l c 3 b - a 发生 了羧基末端切割反应，而l c 3 b b 不能。当l c 3 b - a 的g l y l 2 0 突变时，其羧基末 端不能切割，此时l c 3 b - a 的电泳行为与l c 3 b b 一致，都受l y s l 2 2 的影响。通 过质谱分析，我们发现l c 3 b p 和l c 3 b b k 1 2 1 a 的分子量几乎相等，说明l c 3 b p 6 复巨大学博士论文 第一章人l c 3 b b 的鐾定及其对l c 3 b a 的负反馈调节机制 没有发生任何形式的修饰，l y s l 2 1 突变影响其电泳行为可能是改变了l c 3 b p 电 泳时的构型所致。分子动态模拟表明l c 3 b - a 的羧基末端游离于其蛋白主体之外， 不停的运动；而l c 3 b b 的羧基末端与其蛋白主体紧密结合在一起，是固定不动 的，进一步从结构水平上解释了为什么l c 3 b - a 和l c 3 b 一6 的羧基末端具有不同的 切割反应。 g s tp u l 卜d o w n 实验证明a t g 4 b 与l c 3 b a 和l c 3 b b 都能相互作用，而且 a t g 4 b 能在体外切割l c 3 b a 的羧基末端。将l c 3 b 一断口l c 3 b p 同时转染细胞，发 现l c 3 b p 能抑制l c 3 b o t 羧基末端的切割和修饰，并影响其自噬体膜的定位，提 示l c 3 b b 在体内可能具有负调节自噬体形成的功能。 7 复且大学博士论文第一章人l c 3 b 一8 的箍定及其对l c 3 b a 的负反馈调节机制 一材料 材料与方法 1 c d n a 文库，质粒载体，宿主菌和细胞株 1 ) c d n a 文库：克隆用的人脑的c d n a 文库购n g i b c o b r l 公司；人体1 8 种组织 c d n ap a n e l ( b i o c h a i ni n s t i t u t e ，i n c ) 2 ) 质粒载体 表1 实验中所用的质粒载体 3 ) 宿主菌 大肠杆菌d h 5o本室保存 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 购于s t r a t e g e n e 公司 4 ) 细胞株 表2 实验中所用的细胞株 8 复日i 大学博士论文第一章人l c 3 b b 的磐定及其对l c 3 b a 的负反馈调节机制 2 引物： 表3 ，实验中所有引物( 由上海博亚生物工程公司合成) p r i m e r s s e q u e n c e s f o rp c ra r r d l i f i c a t i o n l c 3 b r a l c 3 b 一6 - a l c 3 b a l c 3 b b b l c 3 b a l c 3 b b b z m g a d 2 一粥一b t _ a t 6 4 b a t a 1 f g 4 b - b g s t a t g 4 b - a g s t 一 t g 4 b b f o rm u t a t i o na n a l y s i s l c 3 b _ a _ a l c 3 b a - b l c 3 b - a - g 1 2 0 l c 3 b - 1 3 - g 1 1 9 a - l c 3 b a - 6 1 2 0 a 一 l c 3 b 一6 - 6 1 1 9 a - b l c 3 b - a - k 1 2 2 a - l c 3 b - 6 - k 1 2 1 a - a l c 3 b - r k l 2 2 a - l c 3 b - b k 1 2 1 a - b l c 3 b _ a - g 1 2 0 a k 1 2 2 l c 3 b - b - g 1 1 9 a k 1 2 l a _ a l c 3 b - a - g 1 2 0 a - k 1 2 2 a l c 3 b 一 1 - - g 1 1 9 a - k 1 2 1 a - b 5 g a g c t c a t c a a g a t a a t t a g a a g 一3 5 - g a g c t c a t c 从g a t a a t t a g g c 一3 s ! 乜k k c 1 嗽g m c 峨g 讯c i g 3 5 - c t t a t t c g a g a g c a g c t c c a a c 一3 f 一矾叭 c k 觚c c 帆c n c 讯吼- 3 5 一a t g a g t a t g o c t g c c g t g t g a a c - 3 5 一t g t g 6 a g c a a c c l c i a g t c - 3 5 g a a l 广r c a t g g a c g c g c t a c 一3 5 - g g c t o g a g t c 从a g g g a c g g 一3 5 一c g g a c l 伽a a g a t g g c g c a g 一3 5 - 。g a g c c c c a g g c t c t c a c a g g t g 一3 5 伽a t c 从g a t m m g 从g g c g c t t a c a g c t c 一3 5 书a ( r ( 玎 a ：g c ( t r c t m t ( 耵g a t g a g c 一3 5 - c t c c c a g g a g a c g t t c g c g a t g a a a t t g t c a g t g 一3 5 - c a c t g a c a a t t t c a 幽a a c g t c t c c t g g g a g 一3 5 - g a g a c g t t c g g g a t g g c a t t g t c a g t g c a t c a t c 一3 5 - g a t g a t g c a c t g a c a a t g c c a t c c c g a a c g t c t c 一3 5 - c t c c c a g g a g a c g t t c g c g a t g g c a t t g t c a g t g - 3 5 - c a c t g a c a a t g c c a t c g c g a a c g t c t c c t g g g a g 一3 带下划线的核苷酸编码突变氨基酸某一氨墓酸的点突变以该氨基酸的缩写字母表示第一 个字母表示野生型氨基酸，中间的数字代表该野生型氨基酸的位置，最后一个字母表示该野 生型氨基酸被突变成的目的氨基酸。a ：正义引物b 反义引物 3 实验材料和试剂盒 1 ) d n ah i n di i i e c o ri 双酶切d n a 标准分子量( 上海华美生物工程公司) 2 ) p c r 产物纯化试剂盒( 上海w a t s o n 公司) 3 ) 限制性内切酶( b i o l a b s 和上海华美公司) 9 复日i 大学博士论文第一章人l c 3 b b 的鉴定及其对l c 3 b n 的负反馈调节机制 4 ) d n a 连接试剂盒( p r o m e g a 和t a k a r a 公司) 5 ) 凝胶回收纯化试剂盒( b o e h r i n g e r 公司) 6 ) 质粒抽提试剂盒( r o c h e 公司) 7 ) d n a 测序试剂盒：b i g d y e t e r m i n a t o rc y c l es e q u e n c i n gr e a d yr e a c t i o n ( p e 公司) 。 8 ) 蛋白标准分子量b e n c h m a r k e r ( l i f et e c h n o l o g y 公司) 9 ) 磷酸钙转染试剂盒和l i p o f e c t i n a m i n o ( g i b c ob r l 公司) 1 0 ) 新生小牛血清和胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料公司) 1 1 ) 抗鼠免疫球蛋白g ( h + l ) h r p 结合物( p r o m e g a 公司) ：抗兔和山羊免疫球蛋白 g ( h + l ) h r p 结合物( c a l b i o c h e m 公司) ：抗鼠免疫球蛋白g r o d a n m i n e 结合物 ( u p s t a t e 公司) 1 2 ) 免疫沉淀b e a d s ：p r o t e i ngp l u s p r o t e i naa g r o s es u s p e n s i o n ( o n c o g e n e 公司) 1 3 ) p h o t o p e h r pw e s t e r n d e t e c t i o nk i t ( c e l ls i g n a l i n gt e c h n o l o g y ) 1 4 ) g l u t h i o n es e p h a r o s e t m4f a s tf l o w ，h m e r s h a m 公司产品 1 5 ) 小鼠抗f l a g 单克隆抗体，美国s i g m a 公司产品 1 6 ) 辣根过氧化物酶联兔抗小鼠二抗，s a n t ac r u z 公司产品 1 7 ) e c l 显色试剂盒，s a n t ac r u z e 公司产品 1 8 ) p h o t o p e h r pw e s t e r nd e t e c t i o nk i t 购于c e l ls i g n a l i n gt e c h n o l o g y 4 实验试剂 1 ) 3 0 丙烯酰胺凝胶贮存液：将2 9g 丙烯酰胺和1gn ，n 一亚甲双丙烯酰胺 溶于总体积为6 0 m l 的水中。加热至3 7 。c 溶解，补加水至终体积l o o m l ，查证该 溶液p h 值应不大于7 0 ，置棕色瓶中保存于室温。 2 ) 1 0 过硫酸胺：1 9 过硫酸胺溶解于i o m l 的水中，4 。c 保存。 3 ) 1 5m o l lt r i s ( p h8 8 ) ：称取t r i s 碱1 8 1 6g ，加5 0m ld d h 2 0 充分溶 解，加浓盐酸调节p h 至8 0 ，加水定容至1 0 0m l ，灭菌。 4 ) 0 5m o l lt r i s ( p h6 8 ) ：8 0m l 水中溶解1 2 1 1gt r i s 碱，加入浓盐酸 调p h 至6 8 ，加水定容至1 0 0m l ，灭菌。 复巨大学博士论文 第一章人l c 3 b b 的鉴定及其对l c 3 b a 的负反馈调节机制 5 ) s d s p a g e 胶配方 6 ) 5 x t r i s g l y 电泳缓冲液：1 5 1gt r i s 碱，9 4gg l y ，5 0 m l1 0 s d s ，加水 至l l 。 7 ) 2 s d s - p a g e 上样缓冲液：2 0m l0 5mt r i s - h c l ，2 0m l 甘油，2 o m l 2 0 9 6 ( w v ) s d s ，0 5m l o 1 ( w v ) 溴酚蓝，1 om l1 3 一巯基乙醇，2 5 m ld d h 2 0 。 8 ) s d s p a g e 染色液：9 0m 1 甲醇：水( 1 ：1 ，v v ) ：l om l 冰乙酸；0 2 5g 考马 斯亮蓝r 2 5 0 。 9 ) s d s p a g e 脱色液：9 0m l 甲醇：水( 4 ：5 ，v v ) ；5 0m 1 冰乙酸。 1 0 ) s d s p a g e 电转移电泳缓冲溶液：2 9g 甘氨酸，5 8gt r i s 碱，2 0 0m l 甲醇定容至1l 。 1 1 ) 1 0 0m g m l 氨苄青霉素：0 5g 瓶装氨苄青霉素注入5m 1 灭菌水充分溶解， 分装于1 5m l 离心管中。 1 2 ) 5 0 x t a e ：t r i s 碱2 4 2g 加d d h 2 06 0 0m l 充分溶解，加冰乙酸5 7 1m l 、0 5 m e d t a ( p h8 o ) 1 0 0m l ，定容至1l ，分装灭菌 1 3 ) 1 0n i g m l 溴化乙锭( e b ) ：在1 0 0m ld d h 2 0 中加入1g 溴化乙锭，磁力搅 拌至完全溶解，然后转移至用铝箔包裹的棕色瓶中，室温保存 1 4 ) l b 液体培养基： p o l y p e p t o n 1 0 0g b a c t o - y e a s t5 0g n a c l5 0g 加双蒸水定容至1 l 灭菌条件为1 2 1 。c ，高压湿热灭菌2 0m i n ) 1 1 复巨大学博士论文第一章人l c 3 b b 的咎定及其对l c 3 b a 的负反馈调节机制 1 5 ) 5 x 磷酸盐缓冲液( 细胞用) n a c i4 0g k c i 1g n a 2 h p 0 4 5 7 5g k h z p 0 4ig 用双蒸水定容至l j 5 0 0 m l 调节p h 至7 2 7 5 ，1 2 0 。c 高压蒸汽灭菌2 0m i n ，备用。 1 6 ) e d t a 试剂；0 3ge d t a 溶解于l ll x 磷酸缓冲液中 1 7 ) 5x 胰酶： n a c l 4 0 g k c l0 2 g n a z h p 0 4 1 2 h ：00 0 6g k h 2 p 0 4 0 0 3g 葡萄糖0 5g 胰酶 1 2 5g 1 丽疆琢琵客至正一 过滤灭菌。- 2 0 。c 储存。使用时用上述的e d t a 试剂稀释至l l 1 8 ) 细胞用5 x 磷酸缓冲液( p h7 4 ) n a 2 i p o d 1 2 h z o 3 6 3 4 8g n a h z p 0 4 2 h 2 0 4 6 4 1 g n a c l 6 9 6 2 g 用0 i nn a o h 调节p h 至7 4 ，定容至3 5 l 1 9 ) 细菌用i xp b s n a t h p 0 4 。1 2 h z o3 6 3 9 k c l0 2g n a c l 8 0g k h 2 p 0 4 0 2 4 9 用0 i nn a o h 调节p h 至7 4 ，加双蒸水定容至l l 2 0 ) 洗涤缓冲液为含0 2 吐温2 0 的1 x 磷酸缓冲液 复q 大学博十论文 第一章人l c 3 b b 的咎定及其对l c 3 b a 的负反馈调节机制 2 1 ) 封闭缓冲液：含3 的b s a 的洗涤缓冲液 2 2 ) d u l b e c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m 高糖培养基，抽滤除菌。 2 3 ) 细胞裂解缓冲液a ( 储备) ： t r i s h c ip h 7 5 n a c l l e u p e p t i n n a 3 v 0 4 8 一g l y c e r o p h o p h a t e s o d i u mp y r o p h o s p h a t e t r i t o n x - 1 0 0 e g t a e d t a 加双蒸水定容至5 0 0m l 裂解缓冲液( 实际用液) ；在裂解缓冲液( 储备) 中加入1 棚的p m s f ， c o c k t a i1 一p r o t e a s e ( 4 0 u l m l 裂解液) ( r o c h e ) 2 4 ) 1 0m g m l 溴化乙锭( e b ) ：在1 0 0m ld d h 2 0 中加入lg 溴化乙锭，磁力搅 拌至完全溶解，然后转移至用铝箔包裹的棕色瓶中，室温保存 2 5 ) n o r t h e r n ( 预) 杂交液：5 0 甲酰胺，5 s s p e ，l o x d e n h a r d t s 溶液，2 s d s ， 小牛胸腺d n a ( 1 0 0 腿m 1 ) 2 6 ) 2 0 x s s c ：在8 0 0m l 水中溶解1 7 5 3g 氯化钠和8 8 2g 柠檬酸三钠，加入 约1 0 0m l5m o l ln a o h 调节至p h7 0 ，加水定容至1l 后高压灭菌。 2 7 ) 2 0 s d s ：在9 0m l 水中溶解2 0gs d s ，加热至6 8 。c 助溶，加水定容至1 0 0 m 1 后高压灭菌。 2 8 ) 1 0 0 x d e n h a r d t s 溶液：称取1 0g 聚乙烯吡咯烷酮，1 0g 水溶性聚蔗糖， 1 0g 小牛血清白蛋白，加水溶解定容至5 0 0m l ，过滤除菌，分装于离心管一2 0 备用。 3 9 ) 预杂交液：2 0 x s s c3m l ；1 0 0 d e n h a r d t s0 5m l ；2 0 s d s0 2 5m l ； 0 1m 1l om g m 1 经变性并打断的鲑精d n a ：1m o l lt r i s - h c l ( p n7 5 ) ；1m l o l i g o ( d t ) l o 垤m l ；水5 0 5m 1 。 m m m m m m 删 峙删 删枷 棚 如 坫 ， 乏 坩 复日大学博士论文第一章人l c 3 b b 的咎定及其对l c 3 b a 的负反馈调节机制 二主要仪器设备 1 p c r 扩增仪：p t c 一1 5 0 ，p t c 一2 0 0 ( m jr e s e a r c h 公司) ，p e9 6 0 0 型( p e ) 2 s u p r a f u g e2 2 型高速冷冻离心机( 德国h e r a e u s 公司) 3 t g l - 1 6 台式离心机( 上海医用仪器厂) 4 a b l 3 7 7 型全自动d n a 测序电泳仪( p e 公司) 5 m o d e l 4 0 0 1 型d n a 测序电泳仪( g i b c ob r l 公司) 6 m o d e ls a 型d n a 测序电泳槽( g i b c ob r l 公司)