（高分子化学与物理专业论文）蛋白质分子印迹聚合物的制备及性能研究.pdf

中文摘要 本工作以大孔壳聚糖球为载体，分别采用镶嵌法和接枝改性法，以血红蛋白为印迹分 子，丙烯酰胺为功能单体、n ，n - 亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以过硫酸钾一亚硫酸氢钠氧 化还原体系作为引发剂来制备血红蛋白分子印迹聚合物( m i p ) 。洗脱掉壳聚糖球周围的聚 丙烯酰胺凝胶即可得到分子印迹聚合物。印迹聚合物对印迹分子血红蛋白的吸附吻合 l a n g m u i r 和f r e u n d l i c h 吸附模型。l a n g m u i r 分析表明在m i p 上形成等级吸附并计算出其平 衡吸附常数和最大吸附容量。通过与化学组成相同的非印迹聚合物对比，该印迹聚合物对 印迹分子具有较高的吸附容量和较好的选择性。在低浓度下，该印迹聚合物的再生性能良 好。 关键词：分子印迹蛋白质壳聚糖球聚丙烯酰胺凝胶 s t u d y o nt h ep r e p a r a t i o no fp r o t e i n i m p r i n t e dp o l y m e r m a t e r i a l s m a j o r ：p o l y m e rc h e m i s t r y a r i dp h y s i c s n a m e ：x i a y o n g q i n g t u t o r ：p r o f z h a n gb a n g h u a a b s t r a e t t w o s i m p l ym o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m m ) m a t e r i a l s w e r e p r e p a r e du s i n g h e m o g l o b i na st h ei m p r i n t e dm o l e c u l e ，a c r y la m i d e a st h ef u n c t i o n a lm o n o m e ra n dc r o s s l i n k e d c h i t o s a nb e a d so rm a l e i c a n h y d r i d e m o d i f i e dc h i t o s a nb e a d sa st h e s u p p o r t i n gm a t r i x ， r e s p e c t i v e l y t h ec h i t o s a nb e a d sw e r e f r e e df r o mt h e s u r r o u n d i n gp o l y a c r y l a m i d eg e lb yw a s h i n g t h el a n g m u i ra n df r e u n d l i c ha d s o r p t i o nm o d e l sw e r ea p p l i e dt od e s c r i b et h ee q u i l i b r i u m i s o t h e r m s l a n g m u ka n a l y s i ss h o w e dt h a ta l le q u a lc l a s so fa d s o r p t i o nw a sf o r m e di nt h em i p a n dt h ea d s o r p t i o ne q u i l i b r i u mc o n s t a n ta n dt h em a x i m u m a d s o r p t i o nc a p a c i t yw e r ee v a l u a t e d t h em i ph a sm u c hh i g h e ra d s o r p t i o nc a p a c i t yf o rh e m o g l o b i nt h a nt h en o n i m p r i n t e dp o l y m e r w i t ht h es a m ec h e m i c a lc o m p o s i t i o n ，a n dt h em i pa l s oh a sah i g h e rs e l e c t i v i t yf o rt h ei m p r i n t e d m o l e c u l e t h em i pc a nb er e u s e di na l le a s yw a ya n dt h er e c o v e r yc o e f f i c i e n tw a sv e r yh i g ha t l o wc o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：m o l e c u l a ri m p r i n t i n g p r o t e i n c h i t o s a nb e a d s p o l y a c r y l a m i d e j 6 3 3 4 0 8 南开大学学位论文电子版授权使用协议 ( 请将此协议书装订于论文酋页) 论文矮自负公于印选象合拘韵崩j 备反社能石斤霓 系本人 在南开大学t 作和学习期间创作完成的作品，并己通过论文答辩。 奉人系奉作品的唯一作者( 第一作者) ，即著作权人。现本人同意将本作品 收录丁“南开大学博硕士学位论文全文数据库”。本人承诺：已提交的学位论文 电子版与印刷版论文的内容一致，如因不同而引起学术声誉上的损失由奉人自 负。 本人完全了解直珏太堂图盘熊差王堡盔：焦旦堂焦途塞鳆筐理盘选。同 意南开大学图书馆在下述范围内免费使用本人作品的电子版： 奉作品呈交当年，在校同网上提供论文目录检索、文摘浏览以及论文全文 部分浏览服务( 博士论文前2 4 页硕士论文前1 6 页) 。公开级学位论文全文电 子版于提交1 年后，在校园刚上允许读者浏览并下载全文。 注：本协议韩对于“非公开学位论文”在保密期限过后同样适用a 院系所名称：焉分手研 作者签名：夏一永清 学马： 。| o 驴1 日期： 2 0 0 4 年乡月s j 南开大学硕士研究生学位论文 第一章蛋白质分子印迹聚合物的研究进展 1 1 分子印迹技术简介 分子印迹( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) 是指制备对菜一特定分子( 模板分子或印迹分 子) 具有选择性的聚合物的过程。它通常可描述为制造识别“分子钥匙”的人工“锁” 的技术。在天然生物体如酶、受体和抗体中分子识别在生物活性方面发挥着重要作用， 这种高选择性来源于与印迹分子相匹配的空穴的存在。为获得这样的空穴，人们应用小 分子环状或桶状化合物如冠醚、环番【2 】、环糊精3 1 、杯芳烃 4 1 等来模拟生物体系。应用分 子印迹技术同样可以在聚合物中制造相似的空穴。如果以一种分子为印迹分子，选用适 当的功能单体与之依据共价或非共价键的方式预组装后，用交联剂交联聚合，当印迹分 子除去后，聚合物中就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种分子印迹聚 合物就象锁对钥匙一样具有专一选择性。因此分子印迹技术是一种非常有效的制备具有 专一选择性的吸附分离材料的方法。 分子印迹的出现源于免疫学，早在二十世纪三十年代b r e i n l 和h a u r o w i t z 提出了 当抗原侵入时生物体产生抗体的理论，后来由p a u l i n g 做了进一步说明p 】，它的基本点是 抗体在形成时其三维结构会尽可能的同抗原形成多重作用点，抗原作为一种模板就会“铸 造”在抗体的结合部位。后来“克隆选择”理论否定了p a u l i n g 的抗体形成学说，但这 种学说却为分子印迹理论奠定了基础。 从p a u l i n g 理论出发，科学家们对分子印迹进行了各种尝试，但直到二十世纪七、 八十年代这一技术才真正有所突破。1 9 7 2 年w u f f 小组l 。”首次报导了其成功制备出的分子 印迹聚合物。经过二三卜年的努力，分子印迹技术日趋成熟，并在分离提纯、免疫分析、 模拟酶以及生物传感器等方面显示出应用潜力和广泛的应用前景。 分子印迹聚台物( 简称m i p ) 的制备一般为：印迹分子与功能单体相互作用形成超 分子复合物，在交联剂的作用下形成聚合物然后在定的条件下除去印迹分子，聚合 物中就形成了与印迹分子空间结构互补的具有多蕈作用的空穴。这样的空穴具有“记忆” 功能，可以选择性她吸附待分离混合物中的印迹分子，从而达到分离、纯化的目的( 如 图1 1 所示) 。 南开大学硕士研究生学位论文 a m c t i c m a d 0 n 0 e r | p o l 洫t i o n m a s h i n g f i g u r e l 1p r i n c i p l e so f t h e m o | e c u l a xi m p r t a t 岫t e c h n i q u e 1 1 1 识别机理 根据功能单体与印迹分子的作用机理，分子印迹技术可分为共价分子印迹技术m 1 ( 利 用共价键作用) 、非共价分子印迹技术斟( 利用超分子作用，如离子作用、氢键、疏水作 用等) 以及半共价分子印迹技术呻1 ( 共价键与非共价键共用) 。 在共价结合型的分子印迹聚合物中，印迹分子与功能单体之间具有可逆的共价键作 用，如形成硼酸酯、亚胺、缩醛等衍生物，然后再与交联剂作用，聚合后在一定条件下 水解除去印迹分子后就形成了共价分子印迹聚合物。1 。d a m e n i “圾其合作者最早报道了 利用共价键作用合成对手性异构体具有识别孔穴的大分子，他们以叔丁氧羰基- l 一脯氨酸 ( t b o c l p r o l i n e ) 为模板先与乙烯基氯甲苯作用生成酯类，脱去一分子的氯化氢( h c i ) 后与交联剂聚合生成聚合物，用三氟乙酸与溴化氢的混合物对聚合物进行洗脱除去模板， 再与d ，l 型的混合物作用，再次水解后，溶液中l - 构型的脯氨酸衍生物要多于d 一构型 的，l d 为1 0 2 5 ，证明所制备的聚合物对t - b o o l p r o l i n e 具有一定的选择吸附能力。w u l 讲“】 以甘氨酸为模板，利用氨基酸中的羧基与4 乙烯基一苯胺作用形成酰胺键，氨基与4 一乙烯 基苯甲醛作用形成甲胺键，聚合后除去模板，所制各出来的分子印迹聚合物也表现出 了很好的选择分离能力。 在非共价分子印迹聚合物中，聚合前印迹分子通过分子间作用力，如氢键、偶极、 静电、电荷转移、金属配位、疏永作用等，与功能单体形成超分予复合物，在进步聚 ， 南开大学硕士研究生学位论文 合交联后除去印迹分子，得到非共价键的分子印迹聚合物，由于其结合机理类似于天然 生物分子，因此是分子印迹技术研究的热点，绝大多数的分子印迹技术都是以这种作用 形式为基础的 1 3 - 1 9 】。a n d e r s s o n 等人1 最早将这种非共价分子印迹技术应用在氨基酸衍生 物的手性分离方面。他们首先利用对乙烯基苯甲酸( p v b ) 作为功能单体，二乙烯苯( d v b ) 作为交联剂合成了商交联的聚合物，利用p v b 中的羧基与l 苯丙氨酸乙酯( l p h e o e t ) 中氨基的离子作用，制备出的聚合物对l p h e o e t 有一定的选择性。 1 1 2 制备方法 分子印迹技术已成为一种制备具有预定选择性填料的技术，其制各主要有以下几种 方法： ( 1 ) 溶液聚合法，其简要方法如下：将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定 比例溶解在惰性溶剂( 通常是氧仿或甲苯) 中，然后移入一玻璃安培瓶中，超声波脱气 通氮气除氧，真空下密封安培瓶，经热分解( 6 0 c 一1 2 0 c ) 或紫外光照射引发聚合一定 时间( 通常2 4 小时) 可得块状聚合物。经粉碎、磨细、筛选等过程得合适大小的粒子， 洗脱除去印迹分子，真空干燥后即可应用。该法制各的印迹聚合物具有满意的“记忆功 能”，对印迹分子具有良好的选择性和识别特性。由于其制备条件简单，易于控制，所以 目前为止，绝大多数用于高效液相色谱填料的分子印迹聚合物均采用这种方法制备。但 是，这种方法所制备出来的聚合物是块状的，需要研磨、过筛选取大小合适的颗粒，不 仅费时费力，而且对于材料还有一定的损失，造成浪费。 ( 2 ) 悬浮聚合法：传统的悬浮聚合虽然能够在严格的聚合条件控制下制备出球形颗粒 状的聚合物，但是颗粒粒径仍然有一个较宽的分布，这导致所填充的柱子柱效低，而且 不稳定，细的颗粒一般还会使得柱压升高从而使得柱寿命变短。 为了避免以上聚合方法的不利之处。k e nh o s o y a 及其合作者们瑚1 将比较成熟的两部 溶胀与聚合联用的方法s l 入到了分子印迹聚合物的制备中来，制备出与以往非极性溶剂 为反应介质所制备出来的连续棒型聚合物2 1 1 具有同样的识别能力的聚合物。用这种方法所 制备出来的均匀的球形印迹聚合物可以直接用于色谱柱的填装，所需的后处理仅为抽提 出模板分子，简便，省时。而且，由于颗粒很均匀，没有细小的颗粒，所以在色谱分析 时可以在较低的柱压下得到较高的柱效，同时还能使得由于流动相的分散而使得峰变宽 的现象得以减弱。 ( 3 ) 表面印迹法：n o r r l o w 等m 1 和d h a l 等1 分别在硅胶和聚t r i m 粒子表面嫁接印迹 南开大学硕士研究生学位论文 层获得成功。先将印迹分子与功能单体在有机溶剂中反应形成加合物然后将此加合物 与表面活化的硅胶、聚t r i m 粒子和玻璃介质反应嫁接，这样获得的分子印迹聚合物解决 了传统方法中对模板分子包埋过深或过紧而无法洗脱下来的问题。 分子印迹技术中使用的单体包括共价型单体和非共价型单体。前者包括乙烯基官能 团的硼酸合二醇、键合有含硼酸官能团的硅烷混合物的硅胶颗粒、键合有氨基的硅烷凝 胶颗粒。后者包括丙烯酸、丙烯酰胺、对乙基苯乙烯、亚甲基丁二酸、二丙烯酰胺- 2 - 甲 基一1 一丙磺酸、4 一乙烯基吡啶、2 一乙烯基吡啶。使用的交联剂有n ，n - 亚甲基双丙烯酰胺、 二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、三丙烯酸季戊四醇酯、三甲氧基丙烷三甲基丙爝 酸酯、季戊四醇四甲基丙烯酸酯等。 1 1 3 应用 1 1 3 3 1 色谱分离 m l p 最广泛的研究领域之一是利用它的特异识别性去分离纯化混合物。其适用的印 迹分子范围宽广，无论是小分子( 如氨基酸、药物) 还是大分子( 如蛋白质) 己被用在 各种印迹技术中，并且将制备的介质用在h p l c 、t l c 和c e 分离中。 另外，分子印迹技术在药物的手性拆分中有相当重要的应用前景。目前市场上大约 有5 0 0 多种旋光性药物，9 0 被作为外消旋混合物管理，而手性混合物是一种旋光性药 品，往往具有毒副作用。正是基于这一事实这些年来，一些国家食品和药物管理局对 新的手性药品提出了要求，对映体必须被分离和分别管理，并进行各自的毒理和药理实 验，这就要求提高分离技术。大量研究表明，分子印迹技术可能满足这一技术要求，能 将手性混合物拆分，并有可能实现商业化、规模化。 1 1 3 2 抗体和受体模拟物 印迹聚合物被研究的另一个应用领域是它作为抗体和受体模拟物的适用性。研究发 现，m i p 具有类似于抗体和受体的高度特异识别性，因此可被用来代替抗体而用于免疫 测定中。1 9 9 3 年，m a t a k i s 等l 首先在这一领域做了报道，他们用支气管扩张药品茶碱和 安神药安定值得的印迹聚合物显示出惊人的专一识别性。通过竞争性放射免疫测定发现， m i p 的相关识别结构是不存在的或远低于印迹分子，但它们的交叉反应同单克隆抗体一 致。由于分子印迹聚合物的物理化学性质稳定，保证了识别性质的高度稳定性。m a , m a k e m p e 等2 s 1 用印迹聚合物代替抗体在放射免疫测定中检测药物中的吗啡、茶碱等。但值 4 南开大学硕士研究生学位论文 得注意的是某些天然抗体的印迹聚合物是难以获得的，如免疫抑制性药品和小分子非免 疫性物质。对于小分子化合物通常需连接一个载体分子，但这样可能会导致抗原性质 发生相当大的变化。 分子印迹聚合物也可看作受体模拟物。除了药品的交叉反应研究外，受体模拟物还 可用于新药品的检测库。 1 1 3 3 固相萃取 s e l l e r g r c n ：”首次报道了将分子印迹聚合物用于固相萃取。近年来，相继有一些报道”7 】 出现，这种方法可用于医药、食品和环境分析样品的制备。通常，样品的制各都包括溶 剂萃取，由于分子印迹技术的出现，这可以用固相萃取代替，并且可利用分子印迹聚合 物选择性富集目标分析物。由于印迹聚合物既可在有机溶剂中使用，又可在水溶液中使 用，故与其他萃取过程相比，具有独特的优点。 1 1 3 4 生物传感器 特殊识别现象在传感器技术中扮演了一个重要的角色。化学或生物传感器，都是由 识别元件和与其紧密接触的转换器组成的，它将对分析物产生的应答信号转变成输出信 号。关于环境监测、生物医疗、食品分析等的传感器都是将生物分子( 如酶、抗体) 作 为其特异识别元件。由于生物分子物理化学稳定性差，从而导致了人造受体得到了广泛 的重视。分子印迹系统的有利之处在于其识别位是“特制的”，并且同时引入了固相聚合 支撑物。正是考虑到m i p 有非常高的特异性及物理化学稳定性，科学家们在这一方面做 了大量的尝试。m i n g i d i 等人己利用印迹高分子作为感应物质，制出了一种感应器，用 于印迹分子的检测。 1 1 3 5 在催化和合成中的应用 1 1 3 5 1 催化作用 长期以来，化学家们梦想着生产酶模拟物或人工酶作为新型的催化剂但取得的进展 及其微小。而随着分子印迹技术的出现，使这一状况大为改观。在1 9 8 7 年，l e o n h a r d t 等 利用硝基苯甲基磷酸酯为模板制备得到分子印迹聚合物，并将其用于对硝基苯苯乙酸 酯的水解，所得的m i p 加速了水解过程。接着又有大量报道出现，利用具有催化活性的 m i p 作为底物，过渡状态或产品模拟物显示出其有利之处。 南开大学硕士研究生学位论文 1 1 3 5 2 在合成中强化反应 1 9 9 3 年，m o s b a c h 等阐述了将m 脾用于化学合成的原理，尽管制得的m 不具有催 化活性，但是由于其具有特殊的键台性恧加速反应物的台成。最近，有人报道将类似的 系统用于改善不太理想的酶反应的热力学平衡，原理是利用以产物为模板制备的m 去 连续吸附产物，而将其清除掉。 1 2 蛋白质分子印迹聚合物的制备 1 2 1 蛋白质分子印迹聚合物的制备条件 目前用于印迹的蛋白质种类多种多样，较为常用的有牛血清蛋白( b s a ) 1 2 9 1 3 1 坤“、 血红蛋白( h b ) | 2 9 1 1 3 4 1 1 3 7 、核耱核酸酶o 1 1 33 1 口目【州和溶菌酶1 4 0 1 1 4 。l 等等。 蛋白质是水溶性生物大分子，对其识别主要发生在水体系中，所以选择合适的单体 使得到的m i p 在水中识别蛋白质显得尤为重要。对蛋白质的印迹目前常采用的单体有丙 烯酸3 5 】 、甲基丙烯酸3 0 】叫、丙烯酰胺m 1 3 “、n 一( 4 一乙烯苄基) 亚氨基二乙酸铜( i i ) 3 3 1 ，n ，n 一二甲基氨基丙基丙烯酰胺f 3 5 3 6 等。在实际中为了使印迹分子与单体间作用力 的种类和数量增加，也可以将不同韵功能单体混合使用，如甲基丙烯酸与2 一乙烯基吡啶”“ 共用，丙烯酸与丙烯酰胺 3 蚰共用等。另外，也可以采用天然聚合物如壳聚糖作为功能 单体制备m i p 2 9 1 。在众多功能单体中较为常用的为甲基丙烯酸和丙烯酰胺。前者的羧基 可以以离子键方式与胺发生作用，也可以以氢键方式与酰胺、羧基发生作用。后者是色 谱和电泳中常用的惰性凝胶单体，适于蛋白质的分离纯化。它的酰胺功能团即使在极性 溶剂中也可以形成较强的氢键，另外和羧基不同的是，酰胺基在水溶液不会离子化。以 蛋白质为印迹分子时，蛋白质中豹肽键可以和酰胺形成较强的作用力。因此，迄今为止， 选择性较好的蛋白质印迹聚合物是以丙烯酰胺为功能单体制各的。 印迹聚合物的选择性与交联剂的种类和用量有密切的关系。对交联剂的选择既要考 虑其应具有适当的柔性以使孔穴具有良好的可近性，又要有一定的刚性和交联度以维持 孔穴的形状。根据选择的功能单体吖i 同可以选择不同的交联剂，只前常用的有双甲基丙 烯酸乙二醇酯( e g d m a ) n 0 1 、n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺m ”、n ，n - l ，2 一羟基亚甲基双丙 烯酰胺 3 5 f 3 6 、二甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r i m ) ”等。m 1 p 的制备通常是通过自 由基引发聚合而成的。根据不同的制各方法，采用刁i 同的引发剂。考虑到蛋白质分子的 活性，目前常用偶氮二异丁腈( a i b n ) 引发m m ”( 低温或光引发) ，或用水溶性的过硫 南开大学硕士研究生学位论文 酸盐一四甲基亚乙二胺( t e m e d ) 。”1 的氧化还原体系引发。引发聚合反应前，反应混 合液要通氮气除氧，因为氧气的存在会淬灭自由基，使聚合反应不完全，甚至不能反应。 1 2 2 蛋白质印迹聚合物的聚合方法 目前制备蛋白质印迹聚合物的方法大致可分为三类；包埋法、表面印迹法和抗原决 定基法。 1 2 2 ，1 包埋法 目前采用较多的聚合方法仍为包埋( 溶液聚合) 法，也就是将印迹分子、功能单体、 交联剂和引发剂按一定比例溶解在溶剂中，通过脱气、除氧，经引发聚合后得到块状聚 合物，然后再粉碎、过筛，得到小颗粒，进行后续操作。这种制备方法得到的m p 具有 满意的记忆功能，对蛋白质分子具有良好的选择性和识别特性，且合成操作条件易于控 制，实验装置简单，便于普及。 h j e r t 6 n 等”8 采用该法，以丙烯酰胺为单体合成了低交联度的凝胶( 单体总浓度t = 6 ( w v ) ，( w 指参加反应单体质量，v 指反应液体积) 交联度c = 3 ( w w ) ) ，对血红蛋白、 生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶等进行了印迹。经过含1 0 s d s 的乙酸 ( 1 0 ) 溶液洗脱印迹分子，得到具有良好选择性的m i p ，不同的印迹分子能被相应的印 迹聚合物凝胶所吸附而非印迹蛋白质则不能被吸附。例如对于氨基酸序列和空间结构 相似的鲸鱼的肌红蛋白和马的肌红蛋白，以马肌红蛋白为印迹分子的m 口只能选择性地 吸附马的肌红蛋白而不能吸附鲸鱼的肌红蛋白，说明其特异性程度很高。但是这种低 交联度的凝胶在色谱应用中只能允许很低的流速。为了提高流速，h j e r t 6 n 通过改变单体 总浓度和交联度来提高凝胶的硬度。实验表明，当t = 2 0 ，c = 3 时，凝胶吸附蛋白质的 选择性虽然较低，但可获得较高的流速。将这两种凝胶混合起来，可同时得到高选择性 和高流速。 d t o n g 4 2 1 在h j e r t 6 n 的基础上，筛选了吸附量最大的反应条件，如引发剂的浓度，p h 值的大小，阻及凝胶颗粒的大小。为了提高流速，将丙烯酰胺在刚性的、交联的琼脂糖 凝胶孔中进行聚合，得到的m i p 不仅流速可提高4 倍，而且吸附量也可提高3 4 倍。 v e n t o n 等合成了印迹分子分别为脲酶和牛血清清蛋白的聚硅氧烷聚合物，印迹分 子用链霉蛋白酶降解，每种m i p 都对其印迹分子显示出了较弱的特异性吸附。 尽管溶液聚合印迹技术比较简单，但由于印迹位点分布在整个介质而具有如下弊端： 1 ) 聚合物形态不规则，要得到小颗粒，需对聚合物进行粉碎、过筛等附加程序。 南开大学硕士研究生学位论文 2 ) 在粉碎过程中，不可避免地毁坏部分印迹位点。 3 ) 即使粉碎后。仍有部分印迹位点被包埋在颗粒内，不能发挥作用。 4 ) 印迹分子不易洗脱，颗粒内部扩散阻力大。 1 2 2 2 表面印迹聚合物的制备 表面印迹技术是使识别位点处在颗粒的表面，能克服溶液聚合的弊端。通常采用的 表面印迹技术是在微球上进行涂层印迹聚合物，得到的较均匀的球形颗粒适于各种操作， 尤其是色谱操作。 一种早期的蛋白质表面印迹聚合物的制备嘲是将糖蛋白转铁蛋白在溶液中与硼酸酯 硅烷发生作用，然后在多孔硅胶颗粒上进行聚合。由于硼酸酯基团能通过酯基与糖和糖 蛋自发生可逆反应，因此硼酸酯硅烷与转铁蛋白的预结合使得硼酸酯基团能正确排歹b ， 因此保证了印迹位点对转铁蛋白的特异性。通过高效液相色谱( h p l c ) 的检测，该聚合 物对转铁蛋白显示出微弱的特异性。( 图1 2 ) f i g u r e1 2p r e p a r a t i o no f s u b s t m t es e l e c t i v es i l o x a n ep o l y m e r s o ns i l i c ab ym o l e c u l a ri m p r i n t i n g w i t hd y es u b s t r a t e s 南开大学硕士研究生学位论文 另一种表面印迹技术是在金属离子( c u 2 + ) 和核糖核酸酶a 1 3 3 l 存在的情况下( 图1 3 ) 利用金属螯合单体在活化的硅胶颗粒上进行聚合。由于核糖核酸酶a 存在两个暴露在分 子表面的组氨酸可以与两个金属整合分子进行螫合作用在聚合过程中金属螫合分子固 定到硅胶表面并生成特异性结合部位。相似的例子是膜表面印迹技术，s e r a ps e n e l 等f 4 1 1 将 染料c i b a e r o nb l u ef 3 g a 固定在聚酰胺中空纤维膜上，用金属离子如z n “、c u ”、n i 2 + 螫 合以吸附溶菌酶。实验表明，金属螯合的中空纤维吸附能力有显著的提高( 用z n 2 + 螯合 的最大吸附量可达1 “2 m g g ) ，而且被吸附的溶菌酶9 7 以上可在一小时内被1 0m n a s c n 和2 5 r a me d t a 洗液洗脱。用金属螫合的方法印迹蛋白质的缺陷为蛋白质表面必 须有暴露的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基等，从 而使该方法广泛应用受到限制。 f l g u r e l 3c r e a t i o no f ab i n d i n g s i t ef o rr n a s eao nt h es u r f a c eo f as i l i c ap a r t i c l eb ym o l e c u l a ri m p r i n t i n g 以活化的硅球为基质的另一个例子是用硅胶表面的乙烯基与丙烯酸和丙烯酰胺共聚 】得到的葡萄糖转化酶( g o d ) 印迹聚合物对g o d 具有识别能力。k a z u k oh i r a y a m a 等用同样的方法对溶菌酶进行了印迹，得到的m i p 对溶菌酶具有识别能力，且可多次重 复使用而不破坏识别位点( 图1 4 ) 。 9 t - - 哪妒 一_ 自_ h ，一“、 6b 洲o h f 崩， f x 童o 峰l f i g u r e l as c h e m a t i cr e p r e s 咖d o no f p r o t e i n sr o l ei nd i r e c t i n gt h ep o l y m e r i z a t i o np r o c e s s 还有一类表面印迹技术1 3 9 1 是蛋白质首先被吸附在云母上，然后用一薄层的二糖分子 包在被吸附的蛋白质上，糖层与蛋白质通过氢键结合，再在糖分子表面聚合上一层荧光 聚合物薄层，最后除去云母，溶解掉蛋白质分子，就生成了具有蛋白质形状孔穴的聚二 糖表面印迹聚台物( 图1 5 ) 。吸附试验显示在混合蛋白质溶液中，清蛋白、免疫球蛋白、 核糖核酸酶a 和溶菌酶的印迹聚合物都能更特异性地吸附相应的印迹蛋白质。 f j g u n l 5p r o t o c o lf o rt e m p l a t ei m p r i n t i n go f p r o t e i r t s h 纛奴 南开大学硕士研究生学位论文 1 2 2 3 抗原决定基法 a l e x a n d r er a c h k o v 划提出的抗原决定基法是一种分子印迹的原理。其原理来源于自 然界中的相似方法，即抗体在识别抗原时，抗体只与抗原的一小部分，即抗原决定基相 作用。该法是采用与蛋白质结构中暴露在表面的肽链( 抗原决定基) 相同的短肽作为印 迹分子，得到的大孔m i p 不仅可识别该肽，也可以识别整个蛋白质分子( 如图1 6 所示) 。 ：h ，p ” m “f 十m 吨 。斓删”一。 “一“l ，。二= 。 黜口f s h r i f tp e ，l k “t e ；，i h _ d j 鲁 f - 默o p 商【蹦- d h q 面j a 口f 1 _ 尊 p - p h f i g u r e l 6s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ee p i t o p ea p p r o a c h a l e x a n d r er o c h k o v 采用该法，以m a a 为单体，e g d m a 为交联剂，首先对y p l g ( v y r p r o l e u - g l y n h ：) 四肽进行印迹，h p l c 检测表明，以y p l g 为印迹分子得到的聚 合物不仅可识别y p l g ，亦可识别以p l g ( p r o l e u g l y n h ：) 为决定基的催产素分子。该法 的优点在经济上极为有利，因为小肽通常并不昂贵，而且比蛋白质易得。对于8 0 - 9 0 的 蛋白质而言，通常其c 端的7 - 9 个氨基酸就可以作为其特征结构的决定基。 1 2 3 蛋白质印迹分子洗脱液的选择原则 用于洗脱印迹分子的洗液的选择也很重要，洗脱的效果决定了印迹聚合物的重复使 用和吸附容量。日前所用的洗脱剂可分为两大类：一类是缓冲溶液p 5 1 3 6 t 一般为磷酸 1 i 蒸一溪蠛 南开大学硕士研究生学位论文 盐，b u r o w 等用其直接冲洗m 口，认为表面的印迹蛋白质能被洗脱。另一类是用解离肽 链的试剂，如蛋白酶、含1 0 s d s 的乙酸( 1 0 ) 溶液m 1 ”、e d t a 和尿素川1 等使蛋白质 洗脱，尽管这些洗脱液可实现印迹介质的重复使用，但活性蛋白质分子却无法回收。 1 2 4 蛋白质分子印迹的识别机理 目前对蛋白质分子印迹的识别机理的研究还比较少，h i e r t 6 n f 删认为蛋白质分子上带 有带电的或和非极性基团，如果介质上也有大量的同类基团，则相互之间可形成离子作 用和疏水作用而使蛋白质被吸附，但这是一种非特异性吸附，因为该介质也可以通过键 合作用来吸附其他的非印迹蛋白质，这种替换作用在离子交换色谱和疏水色谱中被用于 常规梯度淋洗。对于蛋白质而言，其大多数m 口的特异性没有想象的高的主要原因是配 位基( 如酶底物、抗体) 和功能单体( 如甲基丙烯酸) 是带电的和或非极性的，因此， 所生成的介质在一定程度上或多或少地带有传统离子交换色谱( 带电) 和或疏水( 非极 性) 色谱的作用，即因为许多强键通常与特异性不吻台而导致特异性丧失，当离子作用 和疏水作用同时发生时，这种情况尤其严重。这意味着必须用能和蛋白质产生弱的相互 作用的功能单体，这些弱的相互作用包括氢键、电荷转移、微弱的诱导偶极作用和非极 性作用等否则很容易造成非特异性吸附。 被吸附的蛋白质很难被完全洗脱，对于以硅胶为载体的m 碑而言，v e n t o n t ”1 认为是 由于硅胶具有多孔和褶合的表面，因而蛋白质与聚合物之间存在多种关系；蛋白质可被 完全包埋在聚合物中，也可被吸附在聚合物的表面，也可被半包埋在聚合物中。当用洗 液洗脱时，只有表面和半包埋的蛋白质可被完全洗下来而包埋的蛋白质还保留在聚合 物中。因此对介质吸附容量有贡献的只是很少一部分的印迹蛋白。对于凝胶中被吸附的 肌红蛋白很难被完全洗脱，h j e 嘣【3 8 1 认为可能是由于蛋白质一蛋白质之间的作用。目前不 能完全排除这种吸附机理，因为蛋白质在聚合物( 如聚丙烯酰胺、葡萄耱、聚乙二醇等) 中沉淀。当与聚合物接触或当其交联成凝胶时，蛋白质倾向于聚集成团。 1 2 5 结语 日前蛋白质印迹技术的发展虽然比较迅速，但仍然存在许多问题。首先，蛋白质分 子印迹过程和识别过程的机理是亟待解决的问题。其次，目前使用的功能单体、交联剂 和聚合方法都有较大的局限性，尤其是没有令人满意的聚合方法以得到高吸附量的m 1 p ， 这就使得分子印迹技术远远不能满足实际应用的需要。第三，如何寻找到温和而有效的 南开大学硕士研究生学位论文 洗脱剂也是亟待解决的问题。现阶段，蛋白质印迹分子尚未找到合适的方法进行洗脱， 活性蛋白质很难得到回收利用。 尽管蛋白质分子印迹技术还存在诸多问题，但其优异的性能在下列领域有着潜在的 吸引力： 1 分离领域的应用。蛋白质分子印迹技术提供了一种简单、直接制备对蛋白质分子具 有识别能力的材料的方法。其对目标分子的特异性吸附具有高选择性的优点在医学分析 中尤为重要，如血红蛋白在胆红素和许多酶的测定中有干扰作用，而以血红蛋白为印迹 分子的m m 可在不同溶液中除去血红蛋白分子。 2 模拟抗体。利用蛋白质分子印迹聚合物制备的模拟抗体可代替天然抗体用于免疫分 析中，经过分子印迹的球形聚丙烯酰胺凝胶颗粒可能在放射免疫分析( r i a ) 和酶联免疫 分析( e l i s a ) 中有所应用，这样可不需要用于制备抗体的实验动物及相应的免疫技术。 另外，天然抗体难于回收再利用，而模拟抗体可重复利用。 3 、生物传感器。特殊识别现象在传感器技术中极为重要，以蛋白质为印迹分子的高 特异性凝胶在此领域有着诱人的前景。根据不同的机理，以酶或抗体作为其特异识别元 件，m p 对分析物产生的结合可通过转换器做出快速反应。以蛋白质印迹分子印迹聚合 物制成的传感器除了传统生物传感器的优点外，还有制作成本低、耐受性高、寿命长等 优点，可大规模应用。这些还有待于人们进一步研究开发。 1 3 研究课题的提出 采用带有电荷的功能单体( 如甲基丙烯酸) 制各出的分子印迹聚合物的选择性并不 理想，这主要是因为印迹所用的单体是带电荷或者是非极性的，从而使色谱床或多或少 地带有离子交换色谱或疏水色谱的性质。用中性的丙烯酰胺为功能单体制备的蛋白质分 子印迹聚合物对印迹分子具有良好的选择性，但用溶液聚合的方法得到的聚合物没有规 则的几何形状，而且硬度极低，在色谱应用中只允许很低的流速。为此，我们选择比较 刚性的大孔壳聚糖球为载体，与柔性的具有良好选择性的聚丙烯酰胺相互结合，刚柔并 济，期望得到的蛋白质分子印迹聚合物不仅具有规则的球形颗粒，而且具有良好的选择 性。 翌堑查兰堡主堑塞生兰堡丝茎 参考文献 1 ，c r a md ，j ，a n g e w c h e m i n t e d e n 9 1 1 9 8 8 ，2 7 ：1 0 0 9 2 ，l e h nj m ，a n g e w c h e m i n t e d e n g l ，1 9 8 8 ，2 7 ：8 9 3 w e n z g ，a n g e w c h e m ，i n t e d e n g l1 9 9 4 ，3 3 ：8 0 3 4 s c h n e i d e rh j ，a n g e w c h e m i n t e d , e n g l ，1 9 9 1 ，3 0 ：1 4 1 7 5 p a u l i n gl ，a m c h e m s o c 1 9 4 0 ，6 2 2 6 4 3 6 w u l f f g ，s a r h a na ，a n g e w c h e m 1 9 7 2 ，8 4 ：3 6 4 7 w u | f f g ，s a r b a na ，a n g e w c h e m ，i n t e d e n 9 1 1 9 7 2 ，1 1 ：3 4 1 8 w u l f f g ，s a r h a na ，z a b r o c k ik j t e t r a h e d r o nl e t t ，1 9 7 3 ，4 4 ：4 3 2 9 - 4 3 3 2 9 ，n o r r l o w o ，g l a d v l ，m o s b a c h k j j c h r o m a t o g r , 1 9 8 4 ，2 9 9 ( 1 ) ：2 9 4 1 1 0 ，w h i t c o m b m j ，r o d r i g u e z m e e ta 1 j 】j a m c h e m s o c ，1 9 9 5 ，1 1 7 ：7 1 0 5 7 1 1 1 1 1 d a m e nj ，n e c k e r s d c ，t e t r a h e d r o n l e t t ，1 9 8 0 ，2 1 ：1 9 1 3 1 2 w u l f f g ，b e s tw ，a k e l a ha ，r e a c t i v ep o l y m e r s ，1 9 8 4 ，2 ：1 6 7 1 3 d e r s s o nl ，e k b e r gb ，m o s b a c hk ，t e t r a h e d r o nl e f t ，1 9 8 5 ，2 6 ：3 6 2 3 1 4 a n d e r s s o nl ，s e l l e r g r e nb ，m o s b a c hk ，t e t r a h e d r o nl e t t ，1 9 8 4 ，2 5 ：5 2 1 1 1 5 s e l l e r g r e n b ，s h e a k j ，c h r o m a t o g r ，1 9 9 3 ，6 3 5 ：3 1 1 6 o s h a n n e s s yd j ，e k b e r gb ，a n d e r s s o nl i e ta 1 zc h r o m a t o g r 1 9 8 9 ，4 7 0 ：3 9 1 1 7 s e l l e r g r e nb ，l e p i s t om ，m o s b a c hk ，a m c h e m s o c ，1 9 8 8 ，1 1 0 ：5 8 5 3 1 8 a n d e r s o nl i ，m i y a b a y a s h ia ，o s h a n n e s s yd j e ta 1 zc h r o m a t o g r ，1 9 9 0 ，5 1 6 ：3 2 3 1 9 s e l l e r g r e nb ，s h e ak j ，c h r o m a t o g na ，1 9 9 3 ，6 5 4 ：1 7 2 0 h o s o y ak ，y o s h i z a k ok ，t a n a k an e ta 1 j c h r o m a t o g r a ，1 9 9 4 ，6 6 6 ：4 4 9 2 1 m a t s u ij ，k a t ot ，t a k e u c h it e ta 1 a n a l c h e m ，1 9 9 3 ，6 5 ：2 2 2 3 2 2 n o r r l o wo ，g l a dm ，m o s b a c hk a c r y l i cp o l y m e rp r e p a r a t i o nc o n t a i n i n gr e c o g n i t i o ns i t e s o b t a i n e db yi m p r , i n t i n gw i t hs u b s t f a t e s 。j c h r o m a t o g r a p h y , 1 9 8 4 ，2 9 9 ( 1 ) ：2 9 4 1 2 3 d h a lpk ，v i d y a s a n k a rs ，a r n o l dfh s u r f a c eg r a f t i n go ff u n c t i o n a lp o l y m e r s t o m a c r o p o r o up o l y ( t r i m e t h y l l o l p r o p a n et r i e t h y a c r y l a t e ) c h e mm a t e r , 1 9 9 5 ，7 ( 1 ) ：1 5 4 1 6 2 2 4 v l a t a k i sg ，a n d e r s s o nl ，m u l l e rr ，e ta 1 d r u ga s s a yu s i n ga n t i b o d ym i m i c sm a d eb y m o l e c u l a ri m p r i n t i n g n a t u r e ，1 9 9 3 ，3 6 1 ( 3 ) 6 4 5 6 4 7 2 5 ，m a r r i ak e m p e ，k a l u sm o s b a c h ，s e p a r a t i o no fa n i m oa c i d s ，p e p t i d e