（食品科学专业论文）红曲色素提取及其黄色组分制备与检测技术研究.pdf

缩写 p k s s f a s s t l c h s c c c 缩略词 英文名称 p o l y k e t i d es y n t h a s e s 中文名称 聚酮体合酶 f a t t ya c i ds y n t h a s e脂肪酸合酶 t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y h i g h s p e e dc o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y 薄层色谱 高速逆流色谱 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 p h p l c p r e p a r 甜i v eh i 曲p e 向m a n c el i q u i d 制备高效液相色谱c h r o m a t o g r a p h y ”。9 。7 ”。“。“。“ m s n m r o d s e m e s i c e m a s sc h r o m a t o g r a p h y 质谱 n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e o p t i c a ld e n s i t y s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n c o l l i s i o ne n e r g y 核磁共振 光密度 扫描电镜 电喷雾离子化 碰撞能量 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论 文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东 农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名 日 期：三竺墨：! 堡 山东农业大学硕士学位论文 捅要 红曲色素( m o n a s c u sp i g m e n t s ) 是红曲菌发酵生产的天然色素，为红、 黄色调的多种单一色素的混合物，有较高的营养价值和生物活性，尤其在 肉品中代替硝酸盐类的应用研究日益受到关注。我国市场销售和使用的红 曲色素产品品种比较单一，化学成分不明确，质量规格资料较为贫乏，质 量不稳定，既给生产使用带来了安全隐患，又限制了我国的相关产品进入 国际市场。 本研究以红曲米粉为试验材料，通过对超声波辅助提取红曲色素的研 究，确立了各工艺参数对红色组分提取效果及色调的影响，然后采用制备 型液相色谱同时分离制备了红曲色素中红曲素和安卡红曲黄素纯品，并对 制备收集的两种色素纯品进行了纯度分析和结构鉴定，以制备的两种色素 纯品为标准品，研究建立了同时测定红曲混合色素中的红曲素和安卡红曲 黄素的高效液相色谱法方法，并对国内部分企业的红曲米粉和红曲红色素 产品进行了检测。 主要试验结果如下： 1 、超声波提取法具有条件温和、提出率高、速度快等优点，其独特的 机械振动作用和空化作用可达到强化提取、提高效率的效果。以6 0 的乙 醇溶液作为红曲色素的提取溶剂，探讨了不同频率、功率的超声波对色素 中不同组分提取效果的影响，结果显示各因素对红色组分提取效果的影响 程度依次为：频率 时间 功率 液料比，对色调的影响程度依次为：液 料比 频率 时间 功率，综合考虑超声波对红色组分提取效果和色调两 个指标的影响，确定红曲色素超声波辅助提取的最优条件为4 5 k h z 、 2 8 k h z 双频交替3 m i n ，功率1 2 0 w ，液料比1 5 ：1 ，时间3 0 m i n 。 2 、研究了同时分离制备红曲色素中红曲素和安卡红曲黄素纯品的制备 液相色谱法。确定了其最佳条件为c 1 8 反相制备色谱柱，流动相甲醇：水 ( v - v = 8 0 2 0 ) ，检测波长2 3 3 n m ，流速：5 0 m l m i n ，进样量l m l 。该 法所得产品用分析型h p l c 检测，归一化法定量，质量分数分别为 9 6 7 6 1 、9 9 2 3 4 ，经紫外可见光谱和二级质谱分析，确定其分子量及 分子结构，可推断为红曲素和安卡红曲黄素。本方法操作简便，产品纯度 高，红曲素和安卡红曲黄素纯品可用做分析检测方法的对照品。 红曲色素提取及其黄色纽分制各与检测技术研究 3 、研究建立了用高效液相色谱法同时测定红曲混合色素中的红曲素和 安卡红曲黄素的方法。正己烷回流提取红曲米粉中的黄色素组分，再经高 效液相色谱仪分离检测，采用s h i m p a c kh r c o d sc 1 8 色谱柱，甲醇 水溶液( v ：v = 8 0 ：2 0 ) 为流动相，流速1 0 m l m i n ，在波长3 9 4 n m 下测 定，以自制的红曲素和安卡红曲黄素对照品进行定性定量分析。该方法在 1 0 5 0 0 m g l 范围内呈良好的线性关系，回归方程和相关系数分别为：红 曲素：y = 0 0 0 0 1 5 x + 0 8 2 3 6 5 ，r 2 = 0 9 9 9 8 8 ；安卡红曲黄素：y - 0 0 0 0 3 1 x 0 4 5 ， r 2 = o 9 9 9 8 7 。多次测定的相对标准偏差均小于4 ，具有较好的重复性和 稳定性。 4 、实验还对收集到的国内部分企业生产的不同色价红曲色素产品进 行了检测，结果显示红曲素和安卡红曲黄素含量的不同可一定程度上反映 红曲色素产品的组成。 关键字：红曲素；安卡红曲黄素；超声波提取；制备液相色谱；h p l c 2 山东农业大学硕上学位论文 a b s t r a c t m o n a s c u sp i g m e n t sa r en a t u r a lp i g m e n t sf e r m e n t a t e db ym o n a s c u ss p p t h e ya r em i x t u r eo f k i n d s o fr e do ry e l l o ws i n g l ep i g m e n t ，w h i c hi sn u t r i t i o n a l a n db i o a c t i v e a p p l i c a t i o no fm o n a s c u sp i g m e n t st or e p l a c en i t r a t e si nm e a ti s c o n c e r n e dp a r t i c u l a r l y t h e r ea r eo n l yal i t t l ev a r i e t i e so fm o n a s c u sp i g m e n t s p r o d u c t sf o rs a l ea n du s ei no u rm a r k e t ，a n dc h e m i c a lc o m p o s i t i o no ft h e s e p r o d u c t i o n si s n o tc l e a r b e c a u s eo ft h el a c ko fi n f o r m a t i o no nq u a l i t y s p e c i f i c a t i o n sa n du n s t a b i l i t yo fq u a l i t y ，t h e r ea r ep o t e n t i a l , s a f e t yp r o b l e m si n p r o d u c t i o nw h i c hu s e dm o n a s c u sp i g m e n t sa sa d d i t i v e ，a n do u rm o n a s c u s p i g m e n t sp r o d u c t i o n sw e r er e s t r i c t e dt oe n t e rt h ei n t e r n a t i o n a lm a r k e t f i r s t l y , t h ee x t r a c t i o no fm o n a s c u sp i g m e n t sw i t hu l t r a s o n i ca u x i l i a r yw a s s t u d i e dw i t hm o n a s c u sr i c ep o w d e ra sm a t e r i a l s ，t h ee f f e c t so fu l t r a s o n i c p a r a m e t e r so nt h ee x t r a c t i o no fr e dc o m p o n e n t sa n dc o l o rt o n ew ed i s c u s s e d m o n a s c i n ea n da n k a f l a v i n ew e r es e p a r a t e da n dp r e p a r e db yp r e p a r a t i v e h p l c a f t e rp u r i t ya n a l y s i sa n ds t r u c t u r ei d e n t i f i c a t i o n ，p r e p a r e dm o n a s c i n e a n da n k a f l a v i n ew e r eu s e da ss t a n d a r dr e f e r e n c e ，t h em e t h o dt od e t e c t m o n a s c i n ea n da n k a f l a v i n ei nm o n a s c u sp i g m e n t sb yh i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya to n et i m ew a sd e v e l o p e d s o m ek i n d so fm o n a s c u s p i g m e n t sp r o d u c t i o n so fd i f f e r e n tc o l o rv a l u ew h i c hw e r ep r o d u c e db ys e v e r a l c o m p a n yi no u rc o n t r yw e r ed e t e c t e d t h ec o n c l u s i o n so ft h i sr e s e a r c hw e r ea sf o l l o w s ： 1 u l t r a s o n i ce x t r a c t i o nt e c h n o l o g yh a st h eh i g h e re x t r a c t i o nr a t e ，r a p i d s p e e d ，g e n t l ec o n d i t i o na n do t h e r sa d v a n t a g e s d i s t i n c tm e c h a n i c a lv i b r a t i o n a n dc a v i t a t i o no fu l t r a s o n i cs t r e n g t h e ne x t r a c t i o na n dc o n t r i b u t et h e h i g h e r e x t r a c t i o nr a t e 6 0 e t h a n o lw a su s e da se x t r a c t i n gs o l v e n to fm o n a s c u s p i g m e n t s ，t h ee f f e c t so fs u c hf a c t o r sa sd i f f e r e n tu l t r a s o n i cf r e q u e n c ya n d p o w e ro ne x t r a c t i o no fd i f f e r e n tp i g m e n t sc o m p o n e n t sw a ss t u d i e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a te f f e c t so fu l t r a s o n i cf a c t o r so nt h ee x t r a c t i o no fr e dc o m p o n e n t s w a si nt h ef o l l o w i n g o r d e r ：f r e q u e n c y u l t r a s o n i ct i m e p o w e r l i q u i d s o l i d r a t i o t h eo r d e ro fu l t r a s o n i cf a c t o r st h a ti n f l u e n c et h ec o l o rt o n ew a sa s f o l l o w s ：l i q u i d - s o l i dr a t i o f r e q u e n c y u l t r a s o n i ct i m e p o w e r c o n s i d e r i n g b o t ht h ee x t r a c t i o no fr e d c o m p o n e n t s a n dt h ec o l o rt o n e ，t h e o p t i m a l e x t r a c t i o n p a r a m e t e r s w e r ea s f o l l o w s ：d u a l f r e q u e n c y ( 4 5 k h z 2 8 k h z ) a l t e r n a t e l ye a c h3 m i n ，p o w e r1 2 0 w ，l i q u i d s o l i dr a t i 0 1 5 ：1 ( i g ) ，u l t r a s o n i c 3 红曲色素提取及其黄色组分制备与检测技术研究 t i m e3 0 m i n o 2 e s t a b l i s h e das i m u l t a n e o u sp r e p a r a t i v em e t h o do fm o n a s c i n ea n d a n k a f l a v i n ew i t hp r e p a r a t i v eh p l c n eo b j e c tc o m p o n e n t sw e r es e p a r a t e d a n dp r e p a r e dw i t hac l sp r e p a r a t i v ec o l u m na n dam o b i l ep h a s eo fm e t h - h 2 0 ( 8 0 ：2 0 ，v v ) ，t h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t hi s2 3 3 m m ，f l o wr a t ei s5 0 m l m i n t 1 l e p r o d u c t sw e r ed e t e c t e db ya n a l y s i sh p l ca n dq u a n t i t a t e dn o r m a l i z a t i o n m e t h o d ，t h ep u r i t yw a s9 6 7 6 1 、9 9 2 3 4 b yu v - v i sa b s o r p t i o ns p e c t r u m a n dm a s s m a s sc 1 1 r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s ，m o l e c u l a rw e i g h ta n ds t r u c t u r ew e r e d e t e r m i n e d ，a n dt h em o l e c u l a ro fm o n a s c i n ea n da n k a f l a v i n ew e r ec o n f i r m e d i t sas i m p l ea n de f f e c t i v ep r e p a r a t i v em e t h o d ，a n dt h ep u r ep r o d u c t so f m o n a s c i n ea n da n k a f l a v i n ec a nb eu s e da sr e f e r e n c es u b s t a n c e 3 a ne f f i c i e n tm e t h o df o rd e t e c t i n gb o t hm o n a s c i n ea n da n k a f l a v i n ei n m o n a s c u sp i g m e n t sb yh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a to n et i m e w a sd e v e l o p e d m o n a s c i n ea n da n k a f l a v i n ew e r ee x t r a c t e df r o mr e dr i c ew i t h n h e x a n e ，a n dt h e na n a l y z e dw i t ht h er e f e r e n c ep u r ep i g m e n t sw h i c hw e r e s e p a r a t e d a n d p u r i f i e db yo u r s e l f , u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s ： s h i m - p a c kh r c - o d sc l sc o l u m n ，m e t h a n o l w a t e r ( 8 0 ：2 0 ，v 加) ，1 o m l d m i n ， 3 9 4 n m t h el i n ea r r a n g eo ft h em e t h o dw a s1 0 - 5 0 0m g m l ，t h es t a n d a r dc u r v e l i n e a r i t y r e l a t i o nw a sf i n e t h el i n e a r e q u a t i o n o fm o n a s c i n ew a s y = 0 o 0 0 1 5 x + 0 8 2 3 6 5 ，w i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t 0 9 9 9 8 8 ；t h e l i n e a r e q u a t i o no fa n k a f l a v i n ew a sy = 0 0 0 0 31 x - 0 4 5 ，w i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t 0 9 9 9 8 7 t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a ss m a l l e rt h a n4 ，w i t hag o o d r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t y 4 s o m ek i n d so fm o n a s c u sr i c ep o w e ra n dm o n a s c u sp i g m e n t so fd i f f e r e n t c o l o rv a l u ew h i c hw e r ep r o d u c e db ys e v e r a lc o m p a n yi nc h i n aw e r ed e t e c t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tc o n t e n to fm o n a s c i n ea n da n k a f l a v i n ec a nr e f l e c t c o m p o s i t i o no fm o n a s c u sp i g m e n t sp r o d u c t i o n st os o m ee x t e n t k e yw o r d s ：m o n a s c i n e ；a n k a f l a v i n e ；u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ；p r e p a r a t i v e h p l c ；h p l c 4 山东农业大学硕_ 1 ：学位论文 1 引言 红曲( 又名丹曲) 是大米接种红曲菌( m o n a s c u s ) 发酵而成的一种紫 红色米曲，是我国传统的药、食两用品，其药用功效在日用本草、天 工开物、本草纲目中就有记载，具有很好的营养保健作用及研究价值 ( 陈运中，2 0 0 1 ) 。红曲菌属红曲科腐生丝状真菌，代谢产物丰富，红曲 色素是其次级代谢产物( 衣珊珊等，2 0 0 5 ) 。红曲菌的使用始于我国，在 印尼、泰国、日本等亚洲国家应用已有几百年的历史，主要是用于腐乳、 红酒、鱼等食品的发酵呈色，红曲菌易于培养，产色素能力很强。红曲色 素颜色自然鲜亮，尤其对蛋白着色力强，还具有增香抑菌、增强免疫力、 抗疲劳、降血脂、降血压、降血糖等功效( t r e i b e re ta l ，1 9 8 9 ) ，已成为 一种广泛应用于食品、医药、化妆品等行业的功能性添加剂。在合成色素 被证实具有不同程度的毒副作用后，红曲色素作为一种天然色素受到了人 们的重视。 有关红曲色素的现代研究日本起步较早，从1 8 9 0 年便开始对其进行 分离研究，2 0 世纪3 0 年代红曲色素传到了欧美，之后各国都相继开始了 对红曲菌分类鉴定、红曲色素发酵提取工艺及生产应用等方面的研究，对 其组分分离、结构鉴定及代谢机理等方面也开展了一些工作，但研究进展 缓慢。近1 0 多年来，随着微生物学的发展，中外的专家学者对红曲色素 进行了大量广泛而深入的研究，在红曲色素分离、结构鉴定及改性、生成 机理、菌种改良、液态发酵工艺优化、代谢产物基因调控、功能性及安全 性等理论和应用方面的研究都卓有成效，不断拓展着红曲色素的应用领 域。 1 1 红曲色素概述 1 1 1 红曲色素的组成及生成机理 红曲色素是红曲菌代谢过程中产生的一系列聚酮化台物的混合物( 衣 珊珊等，2 0 0 5 ) ，组成较复杂。使用不同的红曲菌株、培养基、发酵条件 所产生的红曲色素组成有较大差异，因而其生成途径也有不同。 1 1 1 1 红曲色素的组成 目前主要采用红外光谱、紫外光谱、液相色谱、质谱、核磁共振等方 法分析研究红曲色素中的各种组分，己确定结构式的有6 种：红色色素 5 红曲色素提取及其黄色组分制各与检测技术研究 ( r u b r o p u n c t a m i n c 红斑胺素或称红斑红曲胺、m o n a s c o r u b r a m i n e 红曲红 胺素或称红曲玉红胺) 、橙色色素( r u b r o p u n c t a t i n 红斑素或称红斑红曲素、 m o n a s c o r u b r i n 红曲红素或称红曲玉红素) 和黄色色素( m o n a s c i n e 红曲素、 a n k a f l a v i n e 红曲黄素或称安卡红曲黄素) ( 雷萍等，2 0 0 4 ；p a s t r a n ae ta l ， 1 9 9 5 ) ，其分子量和分子式见表1 ，结构见图1 。这六种色素的物理化学性 质互不相同，都为醇溶性色素，一般红曲色素中的黄色成分约占5 ，其 性质比红色色素稳定，但其含量少，所以一般红曲都呈现偏红色调的颜色。 表1 六种主要红曲色素成分的分子式 t a b l e1m o l e c u l a rf o r m u l ao ft h em a i nc o m p o n e n t so fm o n a s c u sp i g m e n t s o o o r 1 ：r u h o p u n c 忸m i n e o y 2 ：a n 胁v l m d o o 0 2 ：m o n a a c o c u b r l m t 图1六种主要红曲色素成分的分子结构 f i g u r e1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft h em a i nc o m p o n e n t so fm o n 勰c u sp i g m e n t s 随着液态发酵的应用，红曲衍生色素越来越受到关注。红曲衍生色素 是一类复合色素，由红曲色素与发酵基质中的氨基酸、肽、蛋白质等发生 6 山东农业大学硕士学位论文 反应形成，其组成和呈色效果更加复杂，该类色素大都呈鲜红或紫红色调， 且水溶性较好，目前已成为研究的一个热点。b l a n c 等( 1 9 9 7 ) 从红色红 曲菌( m r u b e r ) 培养液中分离出了4 种复合色素：谷氨酰红曲红胺素 ( g l u t a r y l m o n a s c o r u b r a m i n e ) 、谷氨酰红斑胺素( g l u t a r y l - r u b r o p u n c t a m i n e ) 、 葡糖基红曲红胺素( g l u c o s l m o n a s c o r u b r a m i n e ) 及葡糖基红斑胺素 ( g l u c o s y l r u b o p u n c t a m i n e ) ，研究发现，以葡萄糖为碳源，谷氨酸钠为氮源 可以产生该4 种色素。s o n i ac a m p o y 等( 2 0 0 6 ) 还分离出了另外四种红 曲色素，即黄色的y e l l o wi i ( m = 3 8 4 ) 、x a n t h o m o n a s c i n ea ( m = 3 8 6 ) 、 y 3 ( m = 4 3 0 ) 及红色的r 3 ( m = 3 7 4 ) 。 1 1 1 2 红曲色素的生成机理 红曲色素为红曲霉的次级代谢产物，从结构( 图1 ) 上看包括脂肪酸 和多聚酮两个部分，其合成也主要包括两个部分：多聚酮合成途径，产生 生色团；脂肪酸合成途径i 产生中长链脂肪酸，经转酯化作用连接到生色 团上( 赵树新等，2 0 0 3 ) 。即1 分子乙酰c o a 和3 分子丙二酰c o a 在聚 酮体合酶( p o l y k e t i d es y n t h a s e s ，p k s s ) 的作用下生成四酮化合物，四酮化 合物再与1 分子丙二酰c o a 生成五酮化合物，如此循环使酮基化合物碳 链加长产生聚酮发色团，脂肪酸与乙酰c o a 作用生成聚酮酸，聚酮酸与 发色团的羟基进行酯化反应，最后生成色素分子( 雷萍，2 0 0 4 ) 。 一般认为只有橙色素是通过生物合成途径产生的，其它两种色素是通 过各种化学反应形成的，大都是橙色素的衍生物。两种橙色素分子结构中 的色满环( c h r o m a n ) 第2 位的氧原子很容易被氨基取代，取代后分别成 为红色素( 郭芳等，2 0 0 4 ) ，因而红曲菌发酵时培养基氮源会影响色素纯 度。关于红、黄色素的形成机理，人们提出了各种假设，至今还没有公认 的理论。c a r e l s 和s h e p h e r p ( 1 9 7 8 ) 认为这几种色素都是由橙色素经氧化 而得来的，m a r t i n k o v a ( 1 9 9 5 ) 研究了各种碳源以及不同菌种对橙色素产 量的影响，结果发现橙色素的产量与菌种和碳源的种类无关，y o n g s m i t h 等( 1 9 9 3 ) 提出a n k a f l a v i n e 和m o n a s c i n e 都有属于自身的生物合成途径 的假设。r a s h e v a 等( 1 9 9 7 ) 通过对紫红曲菌的研究发现，色素合成和脂 质合成是共存的，两者存在竞争作用，当培养基中c n 高时，有利于脂 质合成。 7 红曲色素提取及其黄色纽分制各与检测技术研究 红曲色素合成过程中的关键酶是聚酮体合酶( p k s s ) ，它在结构和功能 上与脂肪酸合酶( f a t t ya c i ds y n t h a s e ，f a s s ) 有关( 衣珊珊等，2 0 0 5 ) ，目前 国内外正在通过基因工程技术，分离红曲菌p k s s 基因，对其功能进行定 性，以阐明红曲产物的合成机理，调控不同产物的生成，提高红曲产品中 所需要的目标产物的含量。西班牙科学家( 许赣荣，2 0 0 4 ) 正在进行这方 面的工作，他们分离了红曲菌中的p k s s 基因，发现不同的基因分别控制 不同的产物生成。研究红曲菌p k s s 基因的结构和功能将是今后调控红曲 菌代谢产物生产的关键。 1 1 2 红曲色素产品 目前工业化生产的红曲产品大致分为着色剂即红曲色素产品、发酵剂 及医疗保健品三大类。红曲色素产品因红曲菌的培养方式不同主要分为固 态发酵产品和液态发酵产品两种，发酵培养之后进行提取精制，产品主要 是呈红色调的红曲混合色素。 1 1 2 1 固态发酵产品 固态发酵是以大米、面包粉等为原料直接接种红曲菌的生产方法，产 品主要包括红曲米和红曲红色素，红曲米即发酵后的米干燥后直接以粒状 或粉碎成粉状形式出售，红曲红色素是原料发酵后提取得到的醇溶性红曲 色素，或之后添加豆粉酶解液等含氮物质与之反应，生成水溶性的红曲红 色素。红曲米中除了红曲色素以外还含有未被微生物利用的大量残余淀粉 和粗蛋白，因而色素纯度不高，限制其在许多领域的应用( 中国食品配料 网，2 0 0 5 ) 。 长期以来，我国及东南亚一些国家和地区多采用传统的固态发酵法， 且较多的停留在手工作坊形式。该方法生产红曲色素能耗低，设备要求简 单，成本较低，废水废渣少，不易造成二次污染，但是操作繁琐，劳动强 度大，。生产周期长且产品质量稳定性不高，不适宜大规模机械化生产。2 0 世纪8 0 年代我国朱文锦( 1 9 8 5 ) 、魏建明等( 1 9 8 9 ) 研究报道了厚层机械 通风制曲工艺以改进传统的固态发酵生产，该工艺是在纯种制曲工艺基础 上，采用以池代窑，改人工翻曲为机械通风、自动控温的办法，使红曲的 生产达到机械化、纯种化，生产周期从原来的7 天缩短到5 天。近年来， 我国还创新性地采用了适合大型红曲厂的圆盘固体发酵法，采用圆盘固体 8 山东农业大学硕士学位论文 发酵制曲设备与种子罐、蒸饭机、干燥机配套，提高了其机械化、自动化 水平，实现了固态法生产红曲的机械化( 傅金泉，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 2 液态发酵产品 2 0 世纪9 0 年代以来国内外在红曲色素的液态发酵生产方面做了大量 工作，研究已取得突破性进展。液态发酵生产的红曲红色素，主要成分是 水溶性的“复合色素”。采用这种生产方式具有周期短、产量高、杂质少、 产品质量稳定等优点，有助于实现生产自动化，提高产品质量稳定性，扩 大生产规模。目前，我国采用液态深层发酵的企业中，年产量较大的可达 8 0 吨( 粉状红曲红) ，发酵液中的色价最高可达4 5 0 u m l ( 顾玉梅，2 0 0 1 ) 。 液态发酵法生产的红曲色素色价偏低，这是制约其工业化生产的重要 原因之一，为此，国内外广泛开展了液态发酵菌种改良和工艺条件优化的 研究。目前，提高红曲色素色价的途径主要有：提高红曲菌的生物量、添 加促进色素形成的物质等。具体措施有：菌种诱变、固定化细胞技术、葡 萄糖流加培养、菌种联合培养、添加抗氧化剂和金属离子、添加植物油、 青霉素以及使用超声波处理等( 雷萍，2 0 0 4 ) 。 另外，红曲色素发酵生产中使用的原料多以大米或，台糖、葡萄糖、淀 粉、大豆蛋白粉等为主，导致粮食消耗量大或生产的综合成本较高，目前 国内外已开发利用马铃薯、玉米、小米等为主要原料进行生产的研究。黄 前美等( 1 9 9 4 ) 用紫红红曲霉3 5 3 2 菌种，以价格低廉的马铃薯、造纸工 业废弃物甘蔗渣和生产特级面粉的副产物普副粉为原料，添加适量的无机 氮源以代替大米，进行固态发酵生产红曲色素，色素产量可提高约1 0 。 刘玺等( 2 0 0 5 ) 以小米为原料，研究了液态发酵生产红曲色素的发酵培养 基组配及相关工艺参数的选择，结果显示用小米为原料；经制醪后液态发 酵生产比固态发酵产率高、耗能低，产品使用方便。s i l v a n a 等( 2 0 0 7 ) 以葡萄皮籽为原料，研究确定了液态发酵生产红曲色素的工艺条件。由此 可见，以农业工业废弃物为原料生产红曲色素有很大的潜力，这将是红曲 色素生产的发展方向之一。 1 1 2 3 红曲色素系列产品 红曲色素是混合物，一般所得的产品都含有三种颜色的多种组分，由 于这三种色素水溶性不好，对光稳定性较差，近年来许多学者通过化学修 9 红曲色素提取及其黄色组分制各与检测技术研究 饰和结构改性的方法来改造红曲色素，获得不同色调的纯色素，扩大红曲 色素的应用领域。 1 1 2 3 1 水溶性红曲色素 作为食品添加剂，水溶性色素应用最为便利，因此众多学者开展了红 曲色素水溶性技术研究。日本专利报道，将色素和水溶性蛋白质或核糖核 酸作用后，再用蛋白分解酶、或核糖核酸分解酶处理，或者用纤维素酶处 理含有色素的菌体后用蛋白质处理均可以增加色素的水溶性( 单成双， 1 9 8 3 ) 。我国有报道对红曲色素的成分分离、结构改性进行了大量系统研 究，开发了不同溶解性的红曲色素衍生产品。以碱解法制备水溶性红曲红 色素，证实碱解过程可使红斑素和红曲红素分子中的内酯键打开，生成羧 酸盐，提高其亲水性( 张金彪等，1 9 9 9 ) 。用乙酐处理醇溶性红曲红、黄 色素可分别得到憎水性红曲红、黄色素，经傅立叶变换红外光谱测定推测 可能发生了酮与酸酐的缩合反应，反应后的红曲红、黄色素均可以溶于多 种较低极性的溶剂，红曲红色素在p h 7 5 1 2 0 的碱性缓冲溶液中，具有较 好的溶解性( 谢晓琼等，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 3 2 热稳定性和光稳定性红曲色素 红曲色素对热较稳定，在1 1 0 以上时色调才会发生变化，对大多数 食品都较适用。日本有研究将耐热性欠佳的虫胶酸色素与红曲色素以 0 5 2 ：1 的比例配合使用，二者的热稳定性都有所提高( 单成双，1 9 8 3 ) 。 红曲色素对光不稳定，在光照( 太阳光、紫外光和可见光等) 下会逐渐 分解导致褪色，国内外对其褪色机理及增强稳定性的措施也进行了探索研 究。f a b r e 等( 1 9 9 3 ) 研究发现，自然光下照射5 0 天红色色素仅存2 0 ， 黄色素的吸光度没有变化，认为黄色素可能是光接受者。连喜军等( 2 0 0 5 ) 通过对红曲色素中红、橙、黄三类色素光稳定性实验分析发现，三类色素 间光稳定性差别很大，黄色素的光稳定性最强，其次为红色素，橙色素对 光最不稳定。 红曲色素在光照下褪色的原因较复杂。目前认为主要是自由基反应的 光敏氧化过程，在有氧条件下，红曲红色素的水溶液褪色主要受到三种自 由基作用：羟自由基( o n ) 、超氧阴离子和脂肪族侧链断裂产生的自由基。 因此，对红曲红色素水溶液有护色作用的抗氧化剂可抑制这三类自由基产 1 0 山东农业大学硕士学位论文 生或能与这三类自由基进行反应，消除其对红曲红色素的作用。研究显示 氨基酸与橙色素反应进行化学修饰，红色素中添加抗氧化剂维生素c 、海 藻酸钠、明胶、b 环状糊精等都能不同程度的提高光稳定性( 连喜军等， 2 0 0 4 ) 日本还有添加美拉德反应产物防止红曲色素光敏氧化褪色的专利报 道( 单成双，1 9 8 3 ) 。 1 1 2 3 3 红曲橙色素 近年来人们对红曲混合色素中非红色调组分的研究也较多。宫慧梅等 ( 2 0 0 2 ) 及m a r t i n k o v ae ta l ( 1 9 9 5 ) 都报道了橙色素具有一定的抑菌性， 可抑制革兰氏阳性菌以及大肠杆菌，其原理可能在于红曲色素与蛋白质结 合，导致蛋白质变性而抑制微生物生长。还有报道( t r e i b e r ，1 9 8 9 ) 橙色 素有增强免疫力、抗疲劳、降血脂、降血压、降血糖、防癌、治疗胺血症 ( a m m o n i e m i a ) 的作用。郭芳等( 2 0 0 4 ) 认为红曲色素无论作为食品添加剂 或药用都是橙色素起主要生理活性作用，橙色素是红曲菌所产生的色素中 最重要而且用途较多的组分。 作为一种橙色调的红曲色素，目前在国内外仅限于理论研究及小样试 制，尚未实现大规模生产，在食品及其它领域的应用目前也未得到充分的 开发研究。红曲橙色素颜色较为独特、醒目，作为一种具有生理功效的天 然色素，在众多需要着色剂的产品中都可以使用，可以预见分离开发橙、 黄等不同色调的红曲色素将具有较好的开发前景。 1 1 3 红曲色素的应用 红曲色素对蛋白着色力强，在肉制品、水产品、配制酒、冰棍、饼干、 果冻、膨化食品、调味类罐头、奶制品、植物蛋白、果品等中都有应用。 我国王也等( 2 0 0 6 ) 初步研究了红曲红色素在腊肉中代替亚硝酸钠发色作 用的应用效果，结果显示红曲红色素可以以注射形式添加到腊肉中，添加 量为肉重的0 0 0 1 。从色泽、水分含量、质构角度分析，均能达到类似 亚硝酸钠的水平。 关于红曲色素应用方面的研究多见于亚洲。亚洲国家早就有生产及应 用红曲的传统，其中日本、韩国及东南亚国家对红曲色素应用比较多。日 本市场对红曲色素的消耗从1 9 8 1 年的1 0 0 t 上升到1 9 9 2 年的6 0 0t ，近 年来基本上稳定在此产量，产值1 5 0 0 万美元，应用领域有红色日本清酒， 红曲色素提取及其黄色组分制备与检测技术研究 红色糖浆，含蛋白质的红色酱菜等。泰国y o n g s m i t h 教授( 1 9 9 3 ) 在红 曲菌产黄色素方面的研究独树一帜，并在食品中加以应用取得了很好的成 果。韩国科学家近年来对红曲色素的生产及应用的兴趣越来越大，也发表 了一些研究论文( s h i nc h u ls o oe ta l ，1 9 9 8 ：j ue ta l 。1 9 9 9 ) ，韩国的企业 近年来大量地从中国进口红曲产品。 欧美等国家对红曲的研究较为深入，但应用方面并不太普遍。在部分 欧美国家虽然未被法定认可作为食品添加剂，但也引起科学家及企业的广 泛兴趣。在德国k u l m b a c h 联邦肉制品研究中心的实验室，从2 0 世纪9 0 年代初开始进行用红曲红加入到西式香肠( b o l o g n at y p es a u s a g e ，f e r m e n t e d s a u s a g e ) 的实验( j o h a n n ae ta l ，1 9 9 1 ) ，证明可改善香肠的呈色效果，色 度稳定性较好，并且发现红曲红有一定的防腐效果和功能性及营养价值， 该作者同时认为，用红曲米也应有相同的效果。虽然不能用红曲产品完全 取代亚硝酸盐，但实验证明，用红曲产品取代其7 0 的用量是完全可行 的。 在许多发展中国家，如东欧等国，独联体国家，南美，西亚等国，红 曲产品的应用则不受限制。但这些国家由于历史上不生产红曲产品，因而 红曲产业化并未形成气侯，我国红曲产品主要出口这些国家。 1 2 红曲色素提取分离研究进展 1 2 1 红曲色素提取方法 红曲色素的提取已有了相当数量的研究，目前研究应用较多的主要是 有机溶剂浸提法( 陈运中，2 0 0 1 ：谢林明等，2 0 0 4 ) ，该方法耗时、效率 较低，近年来研究者不断探索报道各种新方法，如大孔吸附树脂吸附提取 法、活性炭( 粉状) 吸附等电点共沉淀法、超临界c 0 2 萃取法等寸 童群义等( 1 9 9 9 ) 探讨了利用大孔吸附树脂吸附发酵液中红曲色素的 提取工艺，并研究了吸附过程随时间变化的动力学方程。陈运中( 2 0 0 1 ) 在优化了传统溶剂浸提法的基础上，建立了三级逆流提取工艺，循环使用 乙醇，色素得率高。石鹤等( 2 0 0 4 ) 研究了红曲霉发酵液及菌体中色素的 提取方法，结果显示用活性炭( 粉状) 吸附、等电点共沉淀法可较好地提取 发酵液中的色素，用6 0 乙醇在6 0 下浸提6 0 分钟能较好地抽提干燥菌 体中的色素。邵伟等( 2 0 0 5 ) 对超临界c 0 2 萃取红曲米中红曲色素进行了 1 2 山东农业大学硕