（食品科学专业论文）食品中喹诺酮类抗菌药的分析方法比较研究.pdf

浙江工商大学硕士学位论文 食品中喹诺酮类抗菌药的分析方法比较研究 摘要 喹诺酮类( q u i n o l o n e s ，q n s ) 药物是类抗菌作用强，抗菌谱广的人工 合成抗菌药。随着q n s 在家禽类动物中的大量使用，很多地方出现滥用该 类药物的情况，使得o n s 在动物性食品中残留的现象普遍存在。q n s 在人体 内累积后能产生毒副作用，而低浓度的q n s 残留能导致病原微生物产生耐 药性，从而危害人类健康。本研究建立了三种食品中喹诺酮类药物的分析 方法，并对方法进行比较，旨在建立切实可行的分析食品中多种q n s 的方 法，从而更好的监控食品中q n s 的残留，确保食品的安全性。 本实验首先对样品的提取液、提取方式和净化方法进行研究。选择了 五种提取溶剂、三种提取方式和两种净化方法对喹诺酮的提取及净化效果 进行比较。结果表明柠檬酸磷酸盐缓冲液( m c l l v a i n e ) 的提取率高，超声 提取的方式效果好，固相萃取( s p e ) 的净化方法更有效。s p e 的方法优化 结果：选择v a r i a n b o u de l u tp l e x a 固相萃取柱为净化柱，采用3 m l 甲醇、 3 m l 纯水、3 m lm c l l v a i n e 缓冲液活化，l m l5 甲醇水溶液淋洗，6 m l 甲醇洗脱目标物质。 本文建立了气相色谱( g c f i d ) 矛h 气质联用( g c m s ) 分析方法的操作 条件。酸性喹诺酮经衍生化后用气相色谱检测，g c f i d 检测出萘啶酸 浙江工商人学硕士学位论文 ( n a l ) 和氟甲喹( f l u ) ，检出限是9 0 9 g m l 和1 1 5 4 g m l ，定量限是 3 0 3 0 t g m l $ 1 3 8 3 6 # g m l 。g c - m s 检测出奥索利酸( o x o ) 、n a l 矛i f l u ， 检出限是2 3 0 8 t g m l 、1 0 3 乒t g m l 和1 1 8 肛g m e ，定量限是7 9 9 2 g m l 、 3 4 2 t g m l 和3 9 5 比g m l 。g c - f i d 和g c m s 分析速度快、定性准确，但样 品分析前需经过衍生化，样品处理相对复杂。本研究分析了三种酸性q n s ， 但这两种方法适用范围窄，且灵敏度低。因此该方法不适于检测残留在食 品中微量的q n s 类药物。 高效液相色谱( h p l c f l d ) 方法l i , g c f i d 和g c m s 方法在分析q n s 类药物方面具有一定的优势。本文建立了同时检测食品中1 3 种喹诺酮类药 物的h p l c f l d 分析方法，并对色谱柱、流动相体系、检测波长和其他色 谱相关参数进行了选择优化。经方法学验证：q n s 的线性范围是2 0 0 2 0 0 0 0 n g m l ( 其中达氟沙星在1 0 0 - 1 0 0 0 0 n g m l ，恩诺沙星和莫西沙星 在4 0 0 6 - - 8 0 0 0 0 n g m l ，o x o 、n a l 和f l u 在2 0 0 - 4 0 0 0 0 n g m l ) ；o n s 在 各自的线性范围内具有良好的线性关系，相关系数r 2 范围在0 9 9 8 7 - 一 0 9 9 9 9 之间。最低检出限( l o d ) 在0 0 0 8 - 1 1 1 2 t g k g ，定量限( l o q ) 在 0 0 2 7 - 3 7 0 6 卢t g k g 。在空白样品中添加三个浓度水平的q n s 标准溶液，1 3 种q n s 的回收率在7 2 7 6 - - 1 0 2 7 9 之间，日内精密度在0 6 1 - - 9 9 9 之 间，日间精密度在3 4 0 6 0 9 。该方法操作简便，灵敏度高，可同时 分析多组分q n s 的残留。 超高效液相色谱质谱联用技术( u p l c m s m s ) l 匕液相色谱具有更快的 分析速度，能分析更多种q n s 。本文建立了同时检测食品中2 2 种喹诺酮类 药物的u p l c m s m s 分析方法。该方法对色谱柱、流动相体系、色谱和质 浙江工商大学硕上学位论文 谱相关参数进行了选择优化。通过空白样品基质溶液加标定量，有效地降 低了基质干扰的影响，回收率和重现性良好，q n s 在其线性范围内相关系 数为0 9 8 5 1 0 9 9 9 7 之间，具有良好的线性关系。l o q 在0 0 0 8 z g k g - 0 3 3 9 z g k g ，回收率在6 3 1 9 4 6 之间，相对标准偏差在0 8 6 1 3 1 2 之间。该方法灵敏度高，定性定量准确，分析速度快，可以对食品中多组 分q n s 的残留进行分析。 通过对g c f i d 、g c m s 、h p l c f l d 和u p l c m s m s 方法的比较得 出，g c f i d 和g c m s 方法分析q n s 的种类少，检出限高，灵敏度相 对较低，不适合分析残留在食品中微量的q n s 类药物。u p l c m s m s 的 分析速度快，分离效率高，即使在液相色谱不能同时分析多种q n s 的情 况下，质谱检测器的多离子反应监控技术( m r m ) 也能解决这一问题，而 且还能同时分析更多种q n s 。本研究分析了2 2 种q n s ，但仍可能开发出 更多种q n s 的同时检测方法。但h p l c f l d 分析q n s 的价格比 u p l c m s m s 便宜，而且液相色谱比质谱检测器的稳定性高。h p l c f l d 和u p l c m s m s 的灵敏度和准确性高，操作简便，定量限远低于我国农 业部和欧盟规定的动物性食品中q n s 的最低残留限量，因此两种方法都 适合分析食品中多组分q n s 的残留。 关键词：喹诺酮类药物；残留分析；前处理方法；气相色谱分析方法；气 质联用分析方法；高效液相色谱分析方法；液相色谱串联质谱分析方法 i i i 浙江t 商人学硕士学位论文 c o m p a r i s o no fa n a iy s i sm e t h o d s f o rq u i n o l o n e sa n t i b a c t e r i a i ，si nf 0 0 d q u i n o l o n e s ( q n s ) a r eas t r o n ga n dw i d eg r o u po fs y n t h e t i ca n t i b a c t e r i a l a g e n t q n sw e r ew i d e l yu s e di nt h et r e a t m e n to fb a c t e r i a li n f e c t i o n sf o rh u m a n a n da n i m a l s a sw e l la sb e i n gt h er e s u l to fm i s u s ef o rq n sa n t i b i o t i c s ，t h e o c c u r r e n c eo fq n sr e s i d u a li su b i q u i t yi na n i m a lf o o d q n sa c c u m u l a t e di n h u m a nb o d yh a v et o x i c i t ys i d ee f f e c t b a c t e r i a lr e s i s t a n c et oq n sa r i s e sf r o m t h el o wr e s i d u e so fq n s ，w h i c he n d a n g e rh u m a nh e a l t h i ti sv e r yn e c e s s a r yt o e s t a b l i s ht h ea c h i e v a b l ea n a l y t i c a lm e t h o d so fq n si nf o o d ，w h i c hw i l li m p r o v e m o n i t o r i n go fq n sr e s i d u e si na n i m a ld e r i v e df o o da n de n s u r ef o o d - s a f e t y t h r e ea n a l y t i c a lm e t h o d so fq n sw e r ee s t a b l i s h e da n dc o m p a r e di nt h i sp a p e r t h ee x t r a c t i o n s o l v e n t ，e x t r a c t i n gw a ya n dc l e a n u p m e t h o dw e r e r e s e a r c h e di nt h ee x p e r i m e n t f i v ee x t r a c t i o ns o l v e n t s ，t h r e ee x t r a c t i n gw a y s a n dt w oc l e a n u pm e t h o d sw e r ec o m p a r e df o rt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o n v 浙江工商大学硕士学位论文 e f f e c t so fq n si nf o o d t h ee x t r a c t i o nr a t eo fm c l l v a i n eb u f f e rs o l u t i o nw a s h i g h e s t ，t h ee x t r a c t i o ne f f e c to fu l t r a s o n i ce x t r a c t i o nw a sb e s ta n dt h ec l e a n u p m e t h o do fs p ew a sm o r ee f f e c t i v e v a r i a n m b o u de l u tp l e x aw a ss e l e c t e da s s p e c a r t r i d g e s p ec a r t r i d g ew a sc o n d i t i o n e dw i t h3 m l m e t h a n o l 、3 m l p u r i f i e d w a t e ra n d3 m lm c l l v a i n e t h ec a r t r i d g ew a sw a s h e dw i t hl m l5 m e t h a n o l a q u e o u ss o l u t i o na n de l u t e dw i t h6 m l m e t h a n 0 1 t h eg a sc h r o m a t o g r a p h y - f l a m ei o n i z a t i o nd e t e c t o r ( g c f i d ) a n d g a s c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r i c ( g c - m s ) a r ed e s c r i b e d f o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft h r e ea c i dq u i n o l o n e s ( a o s ) i nt h er e s e a r c h t h eo p e r a t i o n c o n d i t i o no fg c f i da n dg c m sw a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f q n s a q sw a sd e t e r m i n e db yg ca n dg c - m sa f t e rd e r i v a t i z a t i o n l i m i t so f d e t e c t i o n ( l o d ) o fn a l a n df l uf o rg cw e r e9 0 9 比g m la n d1 1 5 4 魄舀 札 r e s p e c t i v e l y , w h i l el i m i t so fq u a n t i f i c a t i o n ( l 0 0 ) w e r e3 0 3 0 p g m la n d 3 8 3 6 p g m lr e s p e c t i v e l y l o do fo x o 、n a la n df l uf o rg c m sw e r e 2 3 0 8 p g m l , 1 0 3 t g m la n d1 1 8 比g m lr e s p e c t i v e l y , w h i l el o qw e r e 7 9 9 2 觉g m l ，3 4 2 g m l 和3 9 5 p g m lr e s p e c t i v e l y t h e s et w om e t h o d s w o u l db er a p i da n da c c u r a t ef o rr o u t i n e a n a l y s i so ft h et h r e eq u i n o l o n e s r e s i d u e s ；h o w e v e r , t h em e t h o di sn o ti d e a lf o rt h ea n a l y s i so fq n sr e s i d u e s t h ep r e t r e a t m e n tm e t h o dw a sc o m p l e xf o rg ca n dg c m sa n a l y s i so ft h r e e a q s i tw a sb a df o rt h ea p p l i c a b i l i t yo fq n sa n a l y s i si nf o o d ，b e c a u s et h r e e a q sw e r ea n a l y s e db yt h et w om e t h o d si nt h er e s e a r c h i naw o r d ，i tw a sn o t s u i t a b l et od e t e r m i n et r a c eo fq n si nf o o df o ra b o v et w om e t h o d s v i 浙江工商大学硕上学位论文 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c - f e d ) h a ss o m e a d v a n t a g e sa sc o m p a r e dt og c f i da n dg c - m si nq n sa n a l y s i s i nm yp a p e r ， h p l c - f l dw a se s t a b l i s h e df o rd e t e r m i n a t i o no f 1 3q n si nf o o d s e v e r a l p a r a m e t e r so fh p l c w e r eo p t i m i z e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fq n s t h el i n e a r r a n g ew a s2 0 0 - - - ，2 0 0 n g m lf o rs e v e nq u i n o l o n e s ( 1 0 0 - - 1 0 0 o o n g m lf o r d a n ，4 0 0 - - - 8 0 0 o o n g m lf o re n o a n dm o x ，2 0 0 4 - , 4 0 0 o o n g m lf o ro x o ， n a la n df l u ) w i t ht h eg o o dl i n e a rr e l a t i o n ，a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s r 2w a s0 9 9 8 7 - - 0 9 9 9 9 l o da n dl o qw e r e0 0 0 8 - - 1 1 1 2 z g k ga n dw e r e 0 0 2 7 - 3 7 0 6 z g k gf o r1 3q n s ，r e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r i e so fb l a n km u s c l e s a m p l es p i k e da tt h r e el e v e l so f1 3q n sw e r e7 2 7 6 , - 一1 0 2 7 9 ，0 6 1 9 9 9 ，r e s p e c t i v e l y , w i t hi n t r ar s d i n t e rr s dw a s3 4 0 - 6 0 9 v a r i o u s q n sc o u l db ed e t e r m i n e db yh p l cb e c a u s eo fh i g hs e n s i t i v i t ya n ds i m p l e o p e r a t i o n u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r i c ( u p l c m s m s ) h a sr e d u c et h ea n a l y s i st i m ea n di m p r o v et h ea n a l y t i c a l c a t e g o r i e so fq n sa sc o m p a r e dt oh p l c u p l c m s m sw a se s t a b l i s h e df o r d e t e r m i n a t i o no f2 2q n si nf o o d s e v e r a lp a r a m e t e r so fu p l ca n dm s m s w e r eo p t i m i z e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fq n s t h ei n t e r f e r e n c eo fm a t r i xw a s r e d u c e db yt h em a t r i x m a t c h e dc a l i b r a t i o ns t a n d a r d sc u r v e t h ec a l i b r a t i o n c u r v eo fs i xc o n c e n t r a t i o n sf o r2 2q n ss h o w e dg o o dl i n e a r i t ya n dg o o d c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s r 2 ( o 9 8 51 0 9 9 9 7 ) l o q w a s 0 0 0 8 p g k g 0 3 3 9 z g k g t h er e c o v e r yr a n g eo fq n s w a s6 3 1 - 9 4 6 ，0 8 6 - 1 3 1 2 ， v h 浙江工商大学硕士学位论文 r e s p e c t i v e l y , w i t hr s d t h ea c c u r a c ya n ds e n s i t i v i t yo ft h em e t h o d w e r eg o o d f o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fq n sa n d2 2q n sw e r ea n a l y z e di ns h o r t e r t i m e ，w h i c hw o u l dm e e tt h ed e m a n do fq n sv e t e r i n a r yd r u g sm o n i t o r i n g t h e r e s i d u e so fm u l t i c o m p o n e n tq n sc o u l db ea n a l y z e db yu p l c - m s m si n f o o d s t u f f t h er e s u l t so fc o m p a r i s o na m o n gg c - f i d 、g c m s 、h p l c - f l da n d u p l c - m s m ss h o w e dt h a tt h ec a t e g o r i e so fq n sa n a l y s e dw e r ef e wf o r g c - f i da n dg c - m s ，h i g hl o da n dv e r yl o ws e n s i t i v i t yw e r ea c h i e v e d t h e s et w om e t h o d sw e r en o ts u i tt oa n a l y z er e s i d u e so ft r a c eq n si nf o o d u p l ch a st h eq u i c ka n a l y t i c a ls p e e da n dg o o d s e p a r a t i o ne f f i c i e n c y m u l t i p l e r e a c t i o nm o n i t o r i n g ( m r m ) o fm sd e t e c t o rc o u l da c h i e v em u l t i r e s i d u e a n a l y s i so fq n si no n et i m e ，e v e ni fm u l t i c o m p o n e n tq n sc o u l dn o tb e s e p a r a t e da b s o l u t e l yb yh p l c 2 2q n sw e r ea n a l y z e di nt h es t u d ya n d d e t e c t i o nm e t h o d sw i l lb ed e v e l o p e df o rm o r eq n si nf u t u r e h p l c f l di s c h e a p e rt h a nt h a to fu p l c m s m s ，a n dt h es t a b i l i t yi sb e t t e rt h a nt h a to f u p l c - m s m s h p l c f l da n du p l c - m s m sa r es i m p l e ，a c c u r a t ea n d s e n s i t i v e f o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fv a r i o u sq n s h p l c f l da n d u p l c m s m sw e r es u i tt oa n a l y z er e s i d u e so fq n si nf o o d k e y w o r d s ：q u i n o l o n e s ；r e s i d u ea n a l y s i s ；p r e t r e a t m e n tm e t h o d ；g c - f i d ； g c m s ：h p l c ；u p l c m s m s 浙江工商大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得浙江工商大学或其 它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：危盛函日期：泐7 年f 月，歹日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文的规定： 浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅或借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：缝j 氆函导师签名：。 日期：伽7 年 只1 5 = 日 浙江工商人学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 研究意义 随着我国国民经济的迅猛发展，人民生活水平的不断提高，人们对食品品 质的要求也随之重视起来，食品安全问题引起了全社会的广泛关注。动物性食品 中的兽药残留问题一直是食品安全关注的焦点问题之一。近几年来，我国食品安 全事件时有发生，市场上抽查的部分水产品中常常被检出含有恩诺沙星、环丙沙 星、氯霉素、孔雀石绿等禁用渔药，“苏丹红”，“瘦肉精 事件给我们敲响了警 钟。同时，因动物性食品中的兽药残留问题，影响了我国食品的出口创汇，对我 国的经济发展和在国际上的声誉产生不良的影响。因此，监控兽药残留已是当务 之急。 q n s 是近2 0 年来发展最迅速的一类重要的广谱抗菌素，是人类在合成抗菌素 方面一个重要突破，开创了合成抗菌素的新时代。q n s 由于具有抗菌谱广、抗菌 活性强、价格低廉等特点，而广泛用于人医和兽医临床的各种感染性疾病的治疗 和预防。随着q n s 在畜牧养殖业的不断应用，其残留问题已经引起社会及有关部 门的高度重视，q n s 在动物性食品中的残留不仅危害人体健康，影响新药开发和 临床用药，不仅使禽畜粪便易造成环境污染，而且不利于养殖业的健康发展及畜 禽产品的出口，更为严重的是动物性食品中残留较低浓度的q n s 药物容易诱导各 种致病菌产生耐药性，不利于该类药物对人类和畜禽类动物疾病的治疗。为此， 国家建立了兽药残留监控体系，制订相关的安全标准，法律规范以及检测方法。 一种简便快捷、可靠准确的检测方法能为标准的实施提供技术保障，能监控动物 源性食品中的兽药残留，确保食品的安全性。所以，研究动物性食品中q n s 类药 物残留检测方法具有十分重要的意义。 1 2 喹诺酮类概述 喹诺酮类( q u i n o l o n e s ，o n s ) 抗菌药物亦称为吡酮酸或吡啶酮酸类抗菌药，在 化学结构上，该类药物属吡酮酸( p y r i d o n e c a r b o x y l i ca c i d s ，p c a s ) 衍生物，俗 称“喹诺酮”。自美国s t e r l i n g w i n t h r o p 研究所的l e s h e r 等【1 j 科学家于1 9 6 2 年 发现了第一个q n s - 萘啶酸( n a l i d i x i ca c i d ，n a l ) 以来，该类药物便迅速发展起 浙江t 商大学硕t 学位论文 来。q n s 是细菌d n a 合成抑制剂，作用的靶酶是d n a 促旋酶d n a g r a s e l 2 , 3 】， 在临床上使用后发现细菌对该类药物能很快产生耐药性，故q n s 更新换代的速 度在加快。从第一代的o n s 发展到第五代，抗菌谱逐渐变广，药物的抗菌作用 逐渐增强，从而广泛应用于家禽类和鱼类等动物的细菌感染治疗，成为兽医和 水产养殖中重要的抗感染药物之一。 o n s 经历了几个发展阶段，按发明先后及抗菌活性不同分为五个阶段：第 一阶段是2 0 世纪6 0 年代，以萘啶酸，奥索利酸( o x o l i n i ca c i d ，o x o ) 为代表， 主要用于大肠杆菌和某些变形杆菌所致尿路感染，抗革兰氏阴性菌( g 。) ，但 对革兰氏阳性菌( g + ) 几乎无作用，易产生耐药性，现基本退出市场。第二阶 段是2 0 世纪7 0 年代初，以吡哌酸( p i p e m i d i ca c i d ，p i p ) 和氟甲喹( f l u m e q u i n e ， f l u ) 为代表，与第一阶段相比，增强了对革兰氏阴性菌的抗菌活性，对假单 胞菌属和部分革兰氏阳性菌也有抗菌活性，临床应用于尿路感染和细菌性痢疾 等。第三阶段从2 0 世纪7 0 年代末，因为在c 6 位置上引入了氟原子，在c 7 位置上连接了哌嗪环基或吡咯基而称为氟喹诺酮类( f l u o r o q u i n o l o n e s ，f q s ) 1 4 5 1 。 以诺氟沙星( 氟酸，n o r ) 为代表，包括恩诺沙星( e n r ) 、沙拉沙星( s a r ) 、 单诺沙星( d a n ) 、环丙沙星( c i p ) 等已有1 0 余种药物投放市场。f q s 增加 了脂溶性，增强了组织细胞穿透性，组织分布浓度高，其抗菌谱和抗菌活性明 显增强。第四阶段是2 0 世纪9 0 年代以来，随着司帕沙星( s p a r f l o x a c i n ，s p a ) 、 加替沙星( g a t i f l o x a c i n ，g a t ) 的问世，新一代的q n s 类药物的抗菌谱和抗菌药 效达到了新的高峰。现在q n s 类药物已经发展到第五代，由日本医药学家于 2 0 0 2 年研究合成的l m k ，其抗菌作用是同类抗菌药物的几十倍，尚处于人用 药试用时期，兽药上应用较少。 1 2 1 喹诺酮类的结构与性质 喹诺酮的基本结构为4 喹诺酮酸( 4 q u i n o l o n ea c i d ) ，母核包括喹啉类 ( q u i n o l i n e ) 、萘啶类( n a p h t h y r i d i n i e ) 、噌啉类( c i n o l i n e ) 以及吡啶并嘧啶 ( p y r i d o p y r i m i d i n e ) 类，其c 4 上的吡啶酮和c - 3 上的羧酸是药物共同的必需功 能基团( 如图1 1 ) ，主要与细菌d n a 促旋酶( d n ag r a s e ) 结合，对其具有选择 性地抑制作用【6 1 。n 1 取代基常见的为乙基或其电子等配体，主要影响抗菌谱， c 6 上的氟原子能增强q n s 与d n a 促旋酶的结合力和对细胞组织的渗透性， 2 浙江t 商大学硕上学位论文 这两者是决定药效的关键，而c 2 ，c 5 和c 7 位取代基主要影响q n s 在体内 的分布和药代动力学。图1 2 是各种q n s 类药物的化学结构式。 4 粤爨撇 4 , q l l d l o t o n ea c i d na i n 失矗9 图1 1 喹诺酮抗菌药的基本结构 f i g 1 一lt h eb a s i cs t r u c t u r eo fq n s 攀嚏 晰h y n d i | i i q n s 类化合物多数熔点在2 0 0 以上，若是盐类熔点可超过3 0 0 。大多数 q n s 难溶于水、乙醇，易溶于冰醋酸、稀酸和稀碱溶液，p h 为6 8 时，在水中 的溶解度最小；在甲醇、氯仿、乙醚等多数溶剂中难溶或不溶。q n s 根据在c 7 位上是否含有哌嗪环可将它们分为哌嗪喹诺酮( p i p e r a z i n y lq u i n o l o n e s ，p q ) 和 酸性喹诺酮( a c i d i c q u i n o l o n e s ，a q ) 。p q 同时含有酸性基团( 羧基) 和碱性基团 ( 哌嗪环) ，因此属于两性化合物，其p k r 有：酸解离常数p k l = 5 5 6 6 ，碱解 离常数p k 2 = 7 2 8 9 。而a q 的酸解离常数p k a 为6 0 6 9 ，它们的等电点p k i 约为7 0 左右。如环丙沙星p k l 为6 5 ，p k 2 为6 9 ，p k i 为7 5 ；洛美沙星p k l 为6 0 ，p k 2 为9 0 ，p k i 为7 1 。q n s 分子在水溶液中存在的形式如图3 。由于 q n s 结构中含有苯并杂环或并杂环骨架和羰基、羧基等生色或助色团组成的共 轭体系，在紫外光区具有特征性吸收，含两个吸收峰：2 4 0 3 0 0 n m ：3 3 0 3 5 0 n m 。 q n s 还具有荧光性质，激发波长在2 8 0 3 3 0 n m ，发射波长在4 1 0 4 3 0 n m 。大部 分q n s 对光照、温度和酸碱环境具有很好的稳定性，但个别q n s 在溶液中对 光不稳定【6 ，。刀。 3 渺 ) 晤一 瓦撼 浙江工商大学硕上学位论文 o c 0 0 h ， r ? ，- 脚锄幽c a d d 于劲 c x 马7 m 岛 m r = - 3 0 3 3 o 帕砖涉星 幽翻勋m 盥e a z c m h l j f m 0 | m r = 3 1 8 1 6 雩一 c 1 7 h l a f n 3q 玉出= 3 3 1 1 号 ：蜀令一“，”* 7 _ b ； = 氟沙星 d i f l o a o n ( d l f ) q l h 9 e m q h 丘= 3 9 9 1 姜西抄鬟 x 靠瞻 嘲m q 1 玛巩o i v 丘- - - - 4 0 1 4 o o o v n 、 筛操沙星攀 m ；r b 。纛o ，铽h 删i a 两 c 1 7 臣9 f mo h t r = 3 6 2 3 t ，狰嘉 玎h w c 1 7 珏8 f 3 1 如q m r = 3 6 9 1 o 氧氟沙星 培氟i 参显 o t l o x a e x n ( o f l )p l o x i ；i i 雠) c m 玛o f m o m r = - 3 6 1i c 1 7 曰函f l 毛q m r = 3 3 3 1 达氟沙鬟 洛荚移景 c 1 9 马o f 蚝q = 3 5 7 1 ：取了一 广* m _ ， ub 沙拉沙星 8 a r a f o x a c l n ( , , 蝴) c k 日7 f ，m q m f = 3 8 5 3 l o r e e f l o x a c m ( l o m ) c 1 7 h 1 9 f 2 m q i 血= - 3 5 i 1 加管陟墼 g 童g c i o i g t ) c 1 9 玛2 f m 0 4 五血= 3 7 5 1 o 钟o h 依诺沙象 e m 叠c - n 诬罚o ) c u 两，f m 0 3 m f 3 2 q 1 一：一 o o c k 两8 f n ；o 丘= 3 1 9 1 恩i 若沙基 暑n r o t 们3 c i n 晖h 嘞 c 1 9 丑玉f m 0 3 m i = 3 5 9 1 翅赣移辈 s 舯棚能k l s l 强i c 1 9 马2 b n ；0 3 玉缸= 3 9 2 1 婶。刚哆o 一矽o 嚣港沙塞 c l n 瞄姒嗄c n 0 c n h , o n 2 q m r = 2 6 2 2 i 臣胃畦 f u m e q u m e f l u ) c l h 1 2 f n q = 2 6 l2 啄喹酸 o 胸ca c ； d o 。) c 1 3 i - i , l n q m r = 2 6 1 2 牟氢掺譬 k i 柑k x m ， c 1 9 玛l f m 0 4 = 3 6 q 3 豢穰骏 n a l i d , x l ca cd d ( n a 码 c n 日2 m q m r = 2 3 2 2 托鬣栉缮 c 1 9 h l j f 3 n q 1 心- - 4 0 4 3 图1 - 22 3 种喹诺酮类约物的化学结构 f i g 1 - 2t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f2 3o n s 4 ，o， 渊d 砖叁 ，o ，9 一 砷 友。 #s、j o ， n ， 。o 一0 r一 ； 船 珏 浙江工商人学硕十学位论文 r 砷至r 觯翟r ，擗o - ：伽鉴：玲令一 1 2 2 喹诺酮的毒副作用和耐药性 随着q n s 在畜牧养殖业的不断应用，很多地方出现了滥用该类药物的情况， 不合理地加大用药剂量，或是不遵守动物休药期的规定，使得该类药物在动物性 食品中残留的现象普遍存在，其在动物性食品中的残留问题已经引起社会的广泛 关注。q n s 在人体内的低浓度残留，容易诱导致病菌产生耐药性，使得q n s 类新 药开发的周期缩短，不利于该类药物对人类疾病的治疗。有研究表明，q n s 在人 体内累积后能产生毒副作用，而低浓度的q n s 残留能导致病原微生物产生耐药 性，从而危害人类的健康。恩诺沙星在实验动物中显示一定的致突变和胚胎毒作 用【3 ，引。奥索利酸和萘啶酸对大鼠有潜在的致癌作用f 9 1 。近几十年来，q n s 类药物 在使用过程中，各种毒副作用也逐渐显现出来，美国自2 0 世纪8 0 年代中期至今已 经使用的一亿人次中，该类药物严重不良反应发生率约1 3 5 0 0 。日本对q n s 类药 物研究中，副作用发生率为1 6 4 8 【1 1 。q n s 可能带来的危害有：经直接毒性反 应引起人体消化系统、神经系统和心血管系统的不良反应；光敏反应导致皮肤损 伤，产生过敏症状；o n s 还可以跟其他药物相互作用，引起神经系统中毒等。 2 0 0 1 年，美困f d a 暂停了沙拉沙星和恩诺沙星在食品动物中的应用，q n s 的耐药性的关注度随之提高。经研究发现，q n s 的耐药性主要足由于细菌d n a 促旋酶( 拓朴异构酶i i ) 自j 靶基因突变而引起的，而拓朴异构酶i v 的次级突变将导 致更高水平的耐药【1 0 ，1 1 l 。已有不少资料报道致病菌对q n s 的耐药性的产生与动物 大量应用q n s 有关，从而导致人类医疗资源的丧失。 5 浙江t 商大学硕士学位论文 1 3 喹诺酮残留分析研究进展 1 3 1 喹诺酮残留的限量 为了对q n s 类兽药残留实施监控，许多国家纷纷制定出喹诺酮在动物性食品 中的限量。最大残留限量( m a x i m u mr e s i d u el i m i t s ，m r l s 或m r l ) 指允许在食品 中药物或其他化学物质残留的最高量，这是国际组织或国家某部门规定的强制性 标准，规定了为确保公众安全性的标准。美国f d a 规定了家禽肉中恩诺沙星限量 3 0 毗g k g ，牛肝中环丙沙星1 0 毗g 蚝。日本批准使用的q n s 仅有有恩诺沙星、二 氟沙星、奥比沙星、单氟沙星、马波沙星、氧氟沙星和恶喹酸。而澳大利亚和新 西兰食品标准法案中没有批准任何q n s 类药物用于家畜、家禽和鱼类。欧盟( e u ) 在1 9 9 9 年3 月公布的n o 5 0 8 1 9 9 9 号【1 2 】法规中分别对恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙 星、单氟沙星、沙拉沙星、马波沙星、氟甲喹和恶喹酸在家禽类和水产类动物的 肉、脂肪、肝脏、肾及奶中作了不同的限量规定( 见表一) 。我国农业部2 0 0 2 年发 布的2 3 5 号公告【1 3 】中也对部分o n s 的限量作了规定，除了没有规定马波沙星( m b f ) 的限量外，其余一些部分跟欧盟一致( 见表一) 。同时，我国农业部2 0 0 3 年发布 的2 3 6 号公告【1 4 1 6 1 公布了对e n r 和c i p 、o x o 和f l u 在动物性食品中的检测方法。 食品添加剂联合专家委员会j e c f a ( j o i n tf a o w h oe x p e r tc o m m i t t e eo nf o o d a d d i t i v e s ) ，也