（农产品加工及贮藏工程专业论文）超高压射流破碎对多酚氧化酶结构和活性的影响.pdf

摘要 选取源自马铃薯、蘑菇中的多酚氧化酶( p o l y p h e n o lo x i d a s e p p o ) ，采用超高压射流破碎 方法对其进行高强度动力处理，以期改变与其生物活性相关的功能结构，进而导致其活力的变化。 试验中对超高压射流破碎后蘑菇多酚氧化酶的构象采用透射电子显微镜进行了观测，采用圆二色 谱法及荧光光谱法检测了处理后蘑菇多酚氧化酶二三级结构的变化，分析比较了二三级结构与活 力变化的联系。 结果显示，采用孔径1 0 0 岬和7 0 岬l 金刚石微孔阀在1 0 1 5 0 m p a 下处理分散溶解丁磷酸钠缓 冲液中的蘑菇多酚氧化酶溶胶，最高可使蘑菇多酚氧化酶胶团由原始的5 0 0 x 5 0 0 x 6 0 0 n m 破碎至 m e l a n i n s 酶促褐变的发生，需要三个条件：适当酚类底物、多酚氧化酶和氧气。目前，控制酶促褐变 的方法主要从酶和氧两方面入手，常用的控制酶促褐变的方法有： ( 1 ) 热处理法 在适当的温度和时间下处理新鲜果蔬，能使酚酶及其它所有的酶失活。据报道，热烫是控制 酶促褐变最有效的方法1 6 ，- i 。 ( 2 ) 酸处理法 利用酸的作用控制酶促褐变也是广泛使用的方法。常用的酸有柠檬酸、苹果酸及抗坏血酸等。 ( 3 ) 二氧化硫及亚硫酸处理 二氧化硫及常用的亚硫酸盐，如弧硫酸钠、哑硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、联二亚硫酸钠( 即低 弧硫酸钠) 等都是广泛应用于食品工业中的p p o 的抑制剂。 ( 4 ) 驱除或隔绝氧气 通过将去皮水果浸没于清水、糖水或盐水中；或浸涂抗坏血酸液于去皮水果的表面，使果肉 表面生成一层氧化态抗坏血酸隔离层，或用真空渗入法把盐水或糖水渗入组织内部驱除空气，减 少或阻断氧气与原料的接触，可有效控制酶促褐变。 ( 5 ) 加入酚酶底物类似物 加入酚酶底物类似物，如肉桂酸、对傅香豆酸及阿魏酸等酚酸可以有效的控制果蔬汁中的酶 促褐变。 以上方法稃有所长，但仍存在一些不足之处。如果加热过度会影响成品的质地和风味【3 ”；相 1 反，如果热处理不足，破坏细胞结构的同时并未使酶完全钝化，反而会强化酶和底物的接触而促 进褐变。此外，加热钝化酶不能应用于含花青素的果汁中，因为热处理会使花青素退色。”。用二 氧化硫及亚硫酸处理会使食品失去原色而被漂白，产生不愉快的嗅感。驱除或隔绝氧气的方法只 适用丁果肉组织阀隙中气体较多的水果。 1 3 控制酶促褐变的新措施及其特点 由于采用常规方法控制酶促褐变时，常使得食品的营养价值及特殊风味难以保存，许多研究 人员开始致力于食品非热加工方法的研究。国外于八十年代山现了食品超高压技术，采用超高压 处理改变酶活性的研究受到广泛关注。日本、美国和欧洲一些国家在高压食品的砑究和开发方面 处在世界前列。 其中，对酶的超高压处理常见有两种形式一超高 1 0 0 0 m s 的剧烈变化过程。其中由气液相转换产生的空穴震荡接近微型炸弹的爆 炸强度，使处于阀孔区域液流的局部压力高达1 0 3m p a ，这些瞬间高压产生的震荡冲击可使天然 金刚石阀片造成点蚀剥落，因此推断，这些震荡冲击同样有可能具有改变胶体形态p p o 深层次结 构的能力。 在以前的相关实验研究中发现，在操作压力2 0 0 m p a 下，采用u h p s c 一次处理可使分散于 不溶性介质中的脂球破碎至5 0 9 0 n m ，使分散于水中的果胶胶团破碎至1 5 0 1 9 0 n m 。 6 来处理4 8 0 0 0 3 0 i p a x4 8 0 0 08 0 m p a 4 8 0 0 0 图11 蘑菇p p o 胶团s e m 图像 f i g1 1s e mo f m u s h r o o mp p oc o l l o i d 而在前期对蘑菇p p o 进行的溶胀性试验及破碎效果的检测中发现，p p o 在分散液中可大量 吸水膨胀成胶团，吸水后体积可膨胀至6 0 0 x 5 0 0 x 5 0 0 n m ( 见图1 1 ) 。参考分子量较小的( 3 9k d ) 从白薯中提取出的儿茶酚氧化酶结晶态单体的三维尺寸( 5 5 4 5 x 4 5 a ) ，可以估计，蘑菇p p o 结 晶态单体吸水后线性膨胀率为6 0 0 1 2 0 0 ，膨胀后胶团的体积为结晶态单体体积的千倍左右。 由此可以看出，蘑菇p p o 结晶态单体吸水后已经膨胀为结构疏松的胶团状颗粒。这种质地松软的 胶团由于亲水基团大量结合水分子，原有结晶结构已经改变，造成晶体强度的镶嵌、缠绕结构脱 离或是松动，结构集团间原有的吸引结合力由于大量水分子充斥其间而大幅度降低。这种变化将 有可能成就u h p s c 产生的拉伸及剪切作用对p p o 胶团结构深层次的改变，进而影响到p p o 活 性的变化。 并且，在对由马铃薯中提取的粗酶进行的u h p s c 尝试试验中发现，在不高于1 5 0 m p a 的压力 下，u h p s c 可使马铃薯粗酶的酶活变化率撮高达到3 0 + 4 0 ，由此可见，u h p s c 所能产生的 超强动力作用完全有能力明显改变p p o 的活力。 从力的作用量级分析： 蘑菇p p o 结晶态单体吸水后体积膨胀达上千百倍而形成结构疏松的胶团状颗粒。类似结构的 松散胶团所需的破坏强度很低，但由于p p o 胶团的结构尺寸仅为纳米级，宏观上很强的作用力分 解到微粒子时应力量级会变得微乎其微。因此，u h p s c 能否改变p p o 胶团的结构取决于分解到 胶团上的作用力强度能否超过胶团的强度极限。 在以前进行的相关实验中发现，在操作压力2 0 0 m p af ，通过孔径5 0 p m 的单孔阀的液流流 每为4 l h ，平均液流速度 1 0 0 0m s 。根据流体力学中雷诺准数的计算公式： r e ：d u o 式中：r e 一雷诺准数； d 孔径： u 一一流速； d 液体密度； l i 液体黏度。 可以算得：r e 5 0 0 0 ，表明阀片微孔中流型为湍流，微孔中的液流速度类似平顶圆台状分布( 见 中国农业大学研究生学位论文第一章绪论 图1 2 ) 。 泛。掣j 氏哆i li d别均o 。一科一- l 图1 2 微 l 中液流速度分布 f i g 12t h er a t e d i s t r i b u t i o n o f l i q u l d i n m i c r o v o i d 而一般认为，在湍流态中的u = o 8 u 。，进步计算得：岬l 。 1 2 0 0 m s 。根据流量公式 q 2 署d 2 i = 卺u 。( d 2 + d i + d d ，) 求得液流速度的平顶圆台直径为d 1 - o 8 d = 4 0 l x m ，由此可知微孔中心部位流速梯度较小，( 此区域 内物料受剪很弱，因此，强化剪切作用应使阀片孔径与料径为同一尺寸量级) 。而贴近孔壁处u = o ， 即在贴近孔壁的环形区域内，在微孔半径方向上的5 岬的距离内，速度梯度高达2 4 0 m s 岬，位 于此间的胶团将承受很强的剪切应力，并与微孔壁产生剧烈的摩擦。 t f 一p 0 珍彩绷勿 l 旦 1 k _ m 一 e ! 量i ! ! ! = 葺 p 1 毛i 爿 e 三i 三三兰兰兰兰爿高 珍钐绷 j l i 图13 微孔中液流速度分布及压力 f i g 1 3 t h er a t ed i s t r i b u t i o n o f l i q u i da n d p r c s s u r c i n m i c r o v o i d 在上述环形区域内的流型一般认为属层流，故可将环形区域内的剪应力t 应用以f 公式进行 估算： 由：i 7 fu 1 2 ( p 0 一p 1 ) = r e d 。l f 得：f ：坐 4 l 其中，按处理压力p 0 = 1 5 0 m p a 、p l = 0 i m p a 、微孔深l = i 5 r a m 时，算得环形层流区域剪应力 ，8 ， 妻 中国农业大学研究生学位论文 第一章绪论 t = t 2 5 m p a 。在此剪切应力下，p p o 胶团结构有可能发生蠕变和破坏。 另外，由于液流流经阀片微孔时呈剧烈湍流状态，剧烈湍流以及p p o 胶团高速旋转产生的 附加剪切作用还会进一步强化作用效果。 而真正能够使p p o 胶团产生破坏的作用方式当属空穴震荡。u h p s c 处理时，由于液料会以 近1 0 0 0 m s 的高速流经长度仅i m m 、直径5 0 p m 左右的阀孔，并在1 0 。内经历由1 5 0 m p a 到真 空，再由真空到常压的剧烈变化。其间，由气液相转化形成的微气泡的瞬间产生及消失所产生的 空穴效应犹如无数颗微型炸弹爆炸，其作用强度量级可达1 0 3 v i v a ，完全有能力改变p p o 胶团的 整体结构和局部构象。试验中发现的，在天然金刚石阀片射流孔周围的点蚀破坏为上述分析提供 了可信的佐证。 1 5 超高压射流破碎处理流程 u i a w s c 处理所用的设备是高压均质机，它由高压泵和均质阎组成。英国a p v 公司和美国 m i c r o f l u i d i c s 公司均有产品出售。高压均质机的原理是利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于 突然减压和高速冲击碰撞环使细胞破裂。在高压匀浆器中，高压室的压力高达1 0 0 m p a ，细胞悬 浮液自高压室针形阀喷出时，射流速度可达1 0 2 1 0 3 m s 。这种高速喷出的射流喷射到固定的撞 击环上，被迫改变方向，从出口管流出。细胞在这一系列的运动中经历了剪切、碰撞及由高压到 常压的变化，从而造成细胞的破碎。在：i 业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的 细胞，常采用多次循环的操作方法。 超高压动态连续生产的处理工艺如下： 为了考察u h p s c 对p p o 构象的破坏，在本次研究中选用了n c j j 型超高压射流破碎机用丁 酶分子的破碎。该机的破碎元件为一单孔式释放器，可对流体产生多重动力作用。将液态混合物 料超微细化，并能达到纳米级或亚纳米级的破碎效果。 n c j j 超高压射流破碎机是一种超微粒加工设备，主要适用于液态混合物料( 液相一液相或 液相【司相) 的破碎、均质。它采用可编程序控制器实现自动控制。工作时，通过高压柱塞泵产 生高压流体，在特制的均质阀( 释放器) 的作用下将物料超微细化，达到纳米级或亚纳米级的破 碎效果。该机器工作时的最大压力可达1 5 0 m p a ，最大流量是5 l h ，均质阀工作通径为3 0 6 0 # m ， 配套功率为7 5 0 w 。n c j j 超高压射流破碎机结构如图1 4 示。 均质阀是射流破碎机的核心部件，n c j j 超高压射流破碎机的均质阀是单微孔结构，孔由高 能激光束熔钻。液流在高压的作用下，以极高的流速进入均质阀的微孔，流体中的颗粒( 如细菌) 受到剪切力等的作用及随后的压力瞬间释放而破碎( 均质阎及阀片结构见图1 5 - 1 6 ) 。 9 中国农业大学研究生学位论文 第一章绪论 圈14n c j j 超高压射流破碎机 f i g14n c j ju l t r ah i g h p r e s s u r es h o o th o m o g e n i z e r 图1 5 均质阀结构 f i g15 t h es t r u c t u r eo f h o m o g e n i z i n gv a l v e 囤16 均质两片结构 f i g16t h es t r u c t u r eo f d i s cv a l v e u h p s c 作为一种冷处理技术，避免了常规热处理造成的对食品品质的恶化，从营养、风味、 色泽等方面虽大限度的保全了食品的自然特性，能够更有效的利用食品原料中的有效成分，尤其 是在崇尚天然低加工食品、食品营养性的今天，这种技术的研究和发展具有更加现实的意义。 - 1 0 中国农业大学研究生学位论文 第一章绪论 1 6 超高压射流破碎技术相关研究进展 1 6 1 超高压射流破碎技术的初期研究 从2 0 世纪7 0 年代初开始，部分学者即尝试将高压均质机用于微生物细胞的破碎。试验发现， 酵母菌可以比较容易地被均质作用破碎。因此，常用u h p s c 处理细菌以同收细胞内的蛋白质、 酶类等物质。早在1 9 7 4 年b r o o k m a n 就做了有关酵母破碎的试验，试验使用均质机在1 7 0 m p a 下 处理酵母，酵母细胞的破碎率可达1 0 0 ；实验还发现，即使采用较高的破碎压力，由于失速现 象( s t a l lc o n d i t i o n s ) 的影响，流体流经均质阀的流速下降，破碎作用也随之削弱；b r o o k m a n 认 为使用均质机破碎酵母时，破碎能力的强弱与压力降正相关“。并且发现，由于机械作用破坏了 微生物细胞的生命结构，使细胞内物质释放、散失，可降低食品中的细菌数量。这种利用u h p s c 对微生物菌体的破碎，即为超高( 动) 压处理技术的雏形。 1 6 2 超高( 静) 压处理技术的发展 首先，将酶等大分子蛋白质引入相关研究得益于u h h p 技术的发展，许多学者都进行了u h h p 技术方面的研究丁作。比如y o n s e i 大学的j i l e e i “1 研究了经u h h p 处理的胡萝h 汁中酶的物 理稳定性的问题。中东技术大学的a b a y i n d i r l i 4 u 研究了用u h h p 和热烫相结合的方法使绿豆， 豌豆和胡萝i - 中的过氧化物酶失活的问题。他提出u h h p 可以使酶钝化，并按照耐压性的高低顺 序排列出了几种食品中常见酶的顺序：脂肪氧台酶 果胶甲基酯酶 脂肪酶 过氧化氢酶 p p o 和过氧化物酶。华盛顿大学的j a g u e r r e r o b e l t r a n i “1 研究了经u h h p 处理的添加褐变抑制剂 的桃酱的保质期问题。他提出u h h p 处理可以减少微生物的数量，并可使诸如p p o 等的酶火活。 俄亥俄州立大学的a c h o p p e r l 4 4 1 在隔离乳清蛋白的情况下，研究了u h h p 处理对蛋向吸附染 料的特性。u h h p 处理所引起的蛋白构象的改变，直接影响到食品体系中蛋白的结构和功能。以 上关于u h h p 应用于食品领域的研究表明：压力对于食品中的酶有一定的影响，这也启发了研究 人员投入到应用u h p s c 对酶的研究中。 1 6 3 超高压射流破碎技术的出现 目前已有通过u h p s c 处理酶的相关报道。比如：l v a n n i n i 等人对溶菌酶和过氧化物酶 进行u h p s c 处理后，通过检测其对一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制效果来评估其活性 的变化。其理论假设是，u h p s c 通过对两种蛋白质构象的改变来提高溶菌酶和过氧化物酶的活 力。科克大学的l s j o v a 4 2 关于用u h p s c 处理含桔皮油的乳浊液的研究表明，u h p s c 会对 胶体、酶和微生物及乳浊液的许多功能特性都产生了影响。 c a m p i n a s 州立大学的f p c a m p o s 用u h p s c 处理橙汁后观察处理压力和p h 对果汁品质 的影响。结果表明压力比p h 对果胶甲基酯酶及果汁颜色的影响要大，灭活效果随着压力的增加 和p h 的降低而增加；果汁色泽随压力和p h 的降低而不同。在p h = 4 1 ，处理压力为1 0 0 m p a 、 1 5 0 m p a 、2 0 0 m p a 、2 5 0 m p a 和3 0 0 m p a 时，果胶甲基酯酶的灭活效果分别为1 2 6 、1 5 7 、2 0 7 、 中国农业大学研究生学位论文第一章绪论 3 5 9 和6 6 7 ：当p h = 3 6 ，处理压力为i o o m p a 、2 0 0 m p a 、2 5 0 m p a 和3 0 0 m p a 时，酶的灭活 效果分别为7 4 、4 4 6 、6 2 9 和6 7 6 。由此可见，果胶甲基酯酶的活性丁p h 和压力有关， 3 0 0 m p a 的压力可使原来6 76 的酶失活。 c a m p i n a s 大学的g l d o s u a l d o 研究了经u h p s c 处理后的椰汁中p p o 和过氧化物酶的酶 活变化率。新鲜的椰汁经过滤后，用两台同步交迭增压器分别在o m p a 、5 0 m p a 、1 0 0 m p a 、1 5 0 m p a 、 2 0 0 m p a 、2 5 0 m p a 和3 0 0 m p a 下抽入均质阀进行处理，并对处理效果进行了研究。然后又在 1 0 0 m p a 、2 0 0 m p a 和3 0 0 m p a 分别处理和结合两种、三种压力连续处理后，观察其处理的效果。 进口温度为1 0 c ，p h 为5 3 ，可溶性同形物含量为5 0 0 b r i x 。处理后样品的酶活用分光光度计检 测。1 0 0 m p a 以上的处理压力使锝p p o 的活力提高1 5 5 ，随着压力的提高，p p o 活力的增加减 少，直到压力为3 0 0 m p a ，此时酶活为未处理样品的9 4 。连续的多次处理使酶活降低，最好的 处理效果是使样品在3 0 0 m p a 下连续处理三次，它可使p p o 的活力降低到原来的4 8 。实验结 果表明用u h p s c 多次处理可使酶显著失活。 近年米，随着u h p s c 的发展，已有将u h p s c 技术应用与实际生产的报道。美国a t h e n s 大 学的t o l e d o 教授使用4 5 0 0 0 p s i ( 3 1 0 2 7 m p a ) 的压力处理橙汁，发现高压均质处理过的鲜橙汁， 货架寿命可以达到6 个月。1 9 9 3 年，美国c o c a c o l a 公司申请了高压均质、压力释放对橙汁进行 杀菌的专利。实验是利用均质处理鲜果汁来有效地降低细菌活力，达到和巴氏杀菌同样的延长果 汁货架寿命的效果。如果提高均质压力，会带来更显著的保藏效果瞄l 。 1 6 4 多种非热加工综合处理效果研究 人们将多种非热加工方法结合，进行了综合处理效果的研究。a l e x a n d e ri v r o s s f l 等人h 6 】 结合多种非热处理的方法，如高静压( u h h p ) 、脉冲电场( p e f s ) 、电离辐射和超声波降解等， 进行处理可使微生物失活。研究指出，结合两种以上的非热处理方法可以在降低处理强度的同时 提高微生物的钝化效果，但其作用机理并不十分明了。俄亥俄州立大学的h c o t w i n l 4 4 1 崩超i 临界 二氧化碳萃取和高压处理相结台，对橙汁中果胶甲基酯酶和苹果汁中的p p o 失活现象迸行了研究。 研究表明，u h h p 可以破坏微生物细胞并使酶钝化，超临界二氧化碳萃取技术也可使食品中酶部 分钝化。两类技术的综合使用可以改善果汁加工的工艺效果。 以上的研究为本课题的开展提供了一定的理论和实验依据。无论是单纯的u - 1 h p 或u h p s c ， 以及多种非热处理方法的综合使用都表明；高压确实对多种酶有激活或灭活效果，但是对于不同 的处理手段、处理压力、处理温度及p h ，不同物料中的不同种类的酶，义呈现出纷繁复杂的作用 结果。虽然已有人对于u h p s c 改变酶活的机理进行了假设和推测，但这些理论均不够成熟，其真 实性和权威性还有待考证。u h p s c 对蘑菇p p o 的处理效果有待研究。 1 7 研究思路与试验方法的选择 1 7 1 课题研究思路 课题的关键是研究u h p s c 处理后酶活的变化及其和结构变化的相关性，敌首先要确认这种 中国农业大学研究生学位论文 第一章绪论 处理方法改变酶活的可自性，在此基础l 可进一步来探究酶的结构变化，以及结构变化所导致的 酶活变化的相关性研究。 众所周知，蛋白质一般具有四级结构，不同层次的结构对酶分子来说具有不同的意义。一级 结构是由多肽链中的氨基酸顺序决定的，迄今为止还没有关于高压对蛋白质一级结构影响的报 道。二级结构是由肽链内j f u 肽链间的氢键维持。二级结构包括m 螺旋和p 一折叠等。三级结构是由 二级结构间相互作用而包接在一起而形成的球形结构，它姓形成酶活性中心的基础。一些三级结 构的球状蛋白体结合在一起形成四级结构，这一结构靠非共价键间的相互作用来维持，对压力非 常敏感。 酶的一级结构与催化功能的关系一般解释为：酶一级结构的改变主要是指酶分子主链的断裂 1 4 3 1 。如果酶分子主链的断裂部位远离酶的活性中心，切去的部分为非贡献残基时，一级结构的改 变对酶活性没有影响。如果酶分子主链的断裂部位离酶活性中心较近，切去的各部分含有接触性 残基、辅助残基或贡献残基时，将引起酶活力的丧失。 对t j 酶虽自而言，二硫键韵断裂，特鄹是熊链之间的二硫键韵断裂一般会引起酶活性的丧失。 但是在某些情况下，二硫键的断开不影响酶的空间构象时，酶活性仍可保存。 酶的二、三级结构与催化功能的荧系一般解释为：酶的二、三级结构的破坏将使酶的催化活 性丧失。 酶的回级结构与催亿功能的关系一般解释为：多催化部位寡聚酶由若干个相同的亚基( 亚基 是指寡聚蛋白中各个具有三级结构的单位，是蛋白质分子中最小的共价单) 组成，每个亚基上都 有一个催化中心。四级结构完整时，酶的催化功能充分发挥出来。当四级结构受到破坏时，亚基 便分离。当亚基分离时，一般情况下酶就失去活性。但是有些多催化部位寡聚酶的亚基分离时， 若采用适当的分离方法，被分离的亚基仍具有催化活性。而采t j 酸、碱、表面活性剂等破坏四级 结构时，所得到的亚基没有催化活性。别构酶的四级结构受到破坏时，有些催化亚基仍可保持酶 的催化活性，但失去其调节功能。 要考察酶的结构的变化就需要选择与催化功能有对应关系的指标，综合上述因素考虑并比较 酶的一、二、三、四级结构可以发现：酶的一级结构很稳定，迄今为止还没有关于高压对蛋白质 一级结构影响的报道，而且酶的一级结构对酶本身催化功能的影响也较为复杂，所以不选择一级 结构作为考察指标。而酶的二三级结构不但对压力敏感，而且与酶催化功能的关系最为简单、直 接( 酶的二、三级结构的破坏将使酶的催化活性丧失) 。所以本次研究的着眼点主要集中在酶的 二、三级结构上。而酶的四级结构虽然对压力十分敏感，但其本身和对催化功能的影响十分复杂， 不方便研究的开展。故而，最后选定酶的二三级结构作为考察指标。 为了综合考察酶结构变化对酶活的影响，本次研究中还将关注酶分子宏观结构的变化即 分子尺寸及形态的变化。 1 7 2 试验方法的确定 p p o 的活性检测、二三级结构的检测及其宏观结构的检测是本研究的核心检测指标，为使试 验的结论更科学、更具说服力，选用合适试验、检测方法显得尤为重要，下面将具体论述这三种 检测方法的确定依据及其检测理论。 1 - 7 2 1 多酚氧化酶活力的检测方法选定 u h p s c 处理对酶的作用效果试验均考察酶的活性变化，并且发现这种技术对包括p p o 在内 的各种酶可产生激活或者钝化效果。多酚氧化酶( p p o ) 的活性可用多巴胺、没食子酸、儿茶酚 等作反应基质，利用氧电极法和分光光度法来测定1 4 7 - 5 0 】。另外，为了考核u h p s c 处理后p p o 酶 活的变化效果，还需考察破碎前后酶活变化率，酶活变化率是最直接、最有效表征酶特性的一项 指标，并与后期的应用密不可分。 多酚氧化酶活性的测定方法一般是p i j ： ( d 检压法 在一定的温度、p h 值和基质浓度下，多酚氧化酶氧化基质的速率与单位酶浓度和单位时间 内的耗氧量成正比。因此，用瓦氏呼吸计测定耗氧率可测得p p o 活力的高低。 氧电极法 由于p p o 催化耗氧，溶液中氧浓度的减少速率与酶活力大小成正比p “。 氧电极法是根据基质浓度一定，反应体系中溶解氧浓度的变化与酶活力大小呈线性相关的原 理来检测p p 0 活性，此方法测定精度极高，但测定时要严格控制反应温度。 分光光度法 在反虑体系中，p p o 使酚类氧化生成相应的醌类，不同的醌类物质在一定的波长处有吸收峰， 峰值高度与酶活力呈显著正相关。 分光光度法是通过检测反应过程中生成物色值的变化来检测p p o 活性。 但该方法实际上是测定酶反应的次级反应速率，有许多因素影响次级反应，而这些因素又难 以控制。此外，植物p p o 多以结合态存在于细胞膜上，有相当一部分p p o 不能被提取出来，而且一 些醌类物质的摩尔消光系数很低。因此该方法的测定精确性较低。 氧电极法是测定p p o 活性的标准方法，其精确度较高，但分光光度法由于操作简便、测定快速 而被广泛应用。因此，本次研究中采用分光光度法检测p p o 的活力。 1 7 2 2 二三级结构检测方法的选定 酶二级结构中，螺旋的稳定性主要靠氢键维持1 4 ”。氢键一旦破坏，螺旋结构也将受到破坏。 1 3 片状结构的稳定性也靠氢键维持。y 转角结构是由4 个连续的氨基酸残基组成，第一个氨基酸 残基的羰基与第四个氨基酸残基的亚氨基形成氢键连接。综合以上三点考虑，说明蛋白质的二级 结构中的* 螺旋、口片状结构及t 转角这三种二级结构的稳定性在很大程度上依赖氢键。本次研 究中拟选择常用的圆二色谱法( c i r c u l a r d i c h r o i s m ，c d ) 测定液体中的蛋白质的二级结构含量。 通过圆二色谱检测，可以考察二级结构中螺旋和b 折叠等结构的变化情况，另还可详细计算出 各结构的具体含量。 酶的三级结构，具有以下特征j ： 三级结构是具有二级结构的肽链盘绕折叠形成的三维球状结构。 ( d 分子中的非极性集团集中在分子内部，形成酶分子的骨架，称为疏水核；而极性集团相 对集中于酶分子表面，形成亲水区。 1 4 中国农业大学研究生学位论文 第一章绪论 酶分子表面往往有一个内陷的凹槽，义称为裂隙，酶分子的活性中心就在其中。 在酶分子中，显示酶的催化活性的特殊部位称为酶的活性部位( a c t i v es i t e ) ，亦称为酶的活 性中心( a c t i v ec e n t e r ) 。酶的活性中心一旦破坏，酶将失去其催化活性。故而，酶的三级结构是 本次研究不可缺少的考察目标之一。针对它的研究可以帮助分析酶活变化的现象，并给出相应的 理论解释。 按柯施兰德的分法，酶分子中的氨基酸残基按其作用的不同可分为以下四类： f与底物结合、催化作用接触残基 活性中心 fl 协助催化作用辅助残基 r 催化活性显示作用 jl 活性中心外 ( 维持空间构想作用) 结构残基 酶分子 4 0 。c 或 15 。c ，p p o 的活性显著降低。这是冈为不适宜的温 度破坏了p p o 活性部分三维结构的完整性，从而影响其活性。 p p o 的耐热性都较差，一般在7 0 以上的高温处理后，酶活性显著降低。 2 , 8 2 光照对多酚氧化酶活性的影响 多酚氧化酶属于植物体内的末端氧化酶系统 光照条件f 海带体内酚类化合物含量的结果表明 光照明显促进了此酶的活性。黄健1 6 7 】研究不同 在o 1 2 0 0l x 光照强度间，p p o 随光照强度 增加而呈上升趋势。杨博等6 8 】在对玫瑰组织培养的研究中，采用不同的遮光处理( 对照、单层膜、 双层膜) ，其结果也同样证明在一定的光照强度变化幅度内，p p o 活性和接种后的褐变率均随光 强增加而上升。在茶叶研究中也有与此相一致的报道”。 2 8 3 p h 对多酚氧化酶活性的影响 p p o 对p h 的变化十分敏感，强酸强碱条件均不利于酶进行催化反应。因为p p o 是一种含 铜的蛋白质，其作用机制在于铜的氧化还原作用，在酸性环境中，酶中c u ”被解离出来，使酶 失活，而在碱性环境中酶蛋白与c u ”脱离成为不溶性氢氧化铜，也能使酶失活9 。 一般认为p h 值对p p o 的活化也是通过改变酶的构象实现的p 。 当p h 改变时，p p o 蛋白的电泳迁移率和蛋向质的s t o c k s 半径发生了变化，从而暗示了p h 可能通过改变p p o 的构象活化p p o 。最近有人用色谱技术成功分离出了p p oi 和p p oi i ，观察 了不同口hf 的f t - i r 光谱，f s d ( f o u r i e rs e l f - d e c o n v o l m i o n ) 和二阶导数光谱( s e c o n d - d e r i v a t i v e s p e c t r u m s ) 这三种光谱学的特征变化，发现在p h = 1 0 时比p h = 3 时b 一转角和无归卷曲( r a n d o mc o i l ) 的比例有所增加，而- 螺旋和反平行b 折叠( a n t i - p a r e l l e l1 3 - s h e e t ) 的比例却有所减少。这为p h 可 以影响p p o 的二级结构，从而在活化中起作用提供了直接证据。 2 8 4 激活剂、抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 p p o 的天然激活剂有亚油酸和砸麻酸，天然抑制剂有草酸盐等。天然抑制剂能非竞争性的抑 制p p o 的活性。推测有抑制剂可能与p p o 多肽链上的苯丙氨酸( p h e ) 、甘氨酸( g l y ) 和苏氨酸( t h r ) 等形成的别构中心结合，使酶不能发生构象变化，从而抑制了酶的活性7 “。 2 9 研究对象选择 为了使研究对象的选取具有广泛的代表性，使研究结果具有普遍的指导意义，试验中采用源 自蘑菇中的p p o 为研究对象。主要考虑以下原因： ( d 考虑酶制剂厂商只提供蘑菇p p o ，且从发表的几种植物p p o 基因的氨基酸序列可以看 山p ，虽然它们在n 端和c 端明显缺少同源性，却存在2 个含铜的高度保守区c u a 和c u b ， 而且具有很高的同源性。这主要是由于p p o 是一类铜结合酶，铜是维持其活性的保证，并且无论 是同种或不同种植物的p p o ，c 0 1 与酶的结合位点都是在组氨酸( h i s ) 残基附近( 见图2 3 ) ，这使 蘑菇p p o 的研究结论对其它植物来源的p p o 具有同样的指导意义。 僵化单元 糟墨雎l c “c u b l c 麓疆伸 n z 荟= = = = e = = = = = 匕= = = j s 曼5 跚c 螬 1 0 6 姬 柏jk d 1 6 2k i d 箭知虹为断鬟位点 囤2 3 植物中p p o 的生物发生模型 f i g 2 3b i o l o g i cr e a c t i v em o d e lo f p p oi np l a n t - 2 3 中国农业大学研究生学位论文第二章多酚氧化酶的生物物理特性 对于源自蘑菇中p p o 的相关研究具有一定基础，尤其是一些学者前期研究了超高( 静) 压处理( u l t r ah i g hh y d r o s t a t i cp r e s s u r e ，u h h p ) 对源白蘑菇中p p o 的结构及活性的影响，上述研 究结论可以为此次研究提供比较基础。 ( d 市售p p o 纯酶制剂中目前只提供源自蘑菇中的p p o 。 蘑菇中p p o 的酶学特性j ： ( d 严格控制低温等条件，采用二次丙酮法能有效地提取蘑菇中的p p o 。 蘑菇p p o 反应速率在3r a i n 内呈直线上升，其后反应速度变慢，研究酶话性时，控制反 应时间宜在3 r a i n 内。 蘑菇p p o 的最适p h 为7 0 ，在p h6 7 之间酶的活力较高，在加t 中应尽量避开此p h 范用，应在小于3 0 或大于8 0 范嗣内进行。 蘑菇中p p o 的最适温度为3 0 。c 。9 0 。c 处理5m i n ，p p o 活性基本丧失。 l o o m g k g 亚硫酸钠、1 2 5 m g k g 半胱氨酸、1 5 0 m g k g 抗坏血酸能有效抑制p p o 的活性， 而e d t a 对该酶无抑制作用。 蘑菇和马铃薯p p o 非常耐压，用u h h p 处理使其失活压力需达到8 0 0 9 0 0 m p a f 7 2 - 7 4 1 。 另外，为了考察超高压射流破碎对产白天然原料的产品中p p o 的活性改变，拟从香菇、马铃 薯中提取p p o 并进行处理，以考察破碎效果。 一2 4 中国农业大学硕士学位论文 第三章超高压射流破碎对多酚氧化酶活性影响初探 第三章超高压射流破碎对多酚氧化酶活性影响初探 3 1 引言 基于第一章中u h p s c 用于酶处理的可能性分析，本章试验提取马铃薯中的多酚氧化酶， 试在不同压力和处理次数下，考察u h p s c 对马铃薯中的多酚氧化酶的实际处理效果，为进 展开的系统性试验提供参考。 通过调整粗酶的提取参数，经尝试性试验后选择、确定了如表3 1 所示的试验条件。 表3 1 实验参数的选择 t a b l e31t h ec h o i c eo f e x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r 3 2 试验材料与方法 3 2 1 试验材料与设备 1 试验原料：市售新鲜马铃薯 2 主要试剂：邻苯二酚、k h 2 p 0 4 、k 2 h p 0 4 、n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 、n a h 2 p 0 4 - 2 h 2 0 、n a f 、n a o h ( 以上试剂均为分析纯) 3 试验设备： ( d 电热恒温水浴锅 纳米超高压均质机 分光光度计 高速离心机 3 2 2 试验方法 h h s n c j j 一0 0 0 5 1 5 0 7 2 l t g l 1 6 c 江苏省东台市电器厂 廊坊通用机械有限公司 上海第三分析仪器厂 上海安亭科学仪器厂 i 马铃薯粗酶的制备方法： 马铃薯p p o 的提取参照g o m e s 等人7 4 j 的方法并加以改进。具体提取方法为：将冷藏去皮的 马铃薯搓丝( 0 t a r a ) 榷汁后，加入三倍于其体积的o ，i m o ! 的n 8 p 0 3 缓；串滚( p h 6 s ，其中食 有o 1 m o l 的n a f ) 。在5 c ，以2 2 2 4 9 离心2 0 r a i n ，将上清液进行u h p s c 处理。以上操作均在 2 5 。c 环境下进行。 s 中国农业人学硕士学位论文第三南超高压射流破碎对多酚氧化酶活性影响初探 2 超高压射流破碎处理方法： 将酶液在选定压力下通过均质机处理，在处理过程中辅以冰板和冰块，保证均质机的进出口 温度不超过3 5 。 3 酶活性的定义： 一个酶活力单位定义为：在2 5 。cf4 2 0 r i m 处，每秒钟引起吸光度改变( 60 d ) 0 0 1 所需要的 酶量。 4 酶活性检测方法： 马铃薯p p o 活性的测定以g o m e s 等人i 7 4 】提供的方法为基础并加以改进：反应的混台物包括 去离子水( 9 m 1 ) ，p h 6 5 、5 0 m m o l l 的k p 0 3 缓冲液( 1 0 m 1 ) ，5 0 m m o l l 的临苯二酚( 1 0 m 1 ) 。在 2 5 。cf 用1 m o l l 的h c i 或l m o l l 的n a o h 将其p h 调到6 ，5 。空气在反应的3 0 分钟内充足供应。 2 5 。c 下，在可以测量4 2 0 n mr 分光光度计吸光度值时，用移液管将2 9 m l 反应液移入玻璃皿中测 其变化。，j 外加入0 1 m l k p 0 3 缓冲液作为空白样。加入0 1 m l 酶液作为样品。立刻将玻璃皿倒置 混合反应液。在2 5 。c 下每隔1 0s 测4 2 0 n m 下吸光度的变化。时间间隔可根据具体情况作相应调 整。将二个单独的试验数据取平均作为引用的结果数据。每个样品值不得高于均值的1 0 。用酶 活变化率来表示试验数据。 酶活变化率的定义如下： 变化率= 坚罨蒜警川。 4 试验数据的统计、分析方法： 采用e x c e l2 0 0 3 统计分析所有数据，计算标准误差并制图。应用s p s s11 5 软件对数据进行 方差分析( a n o v a ) ，利用邓岢式多重比较对差异显著性进行分析。p 0 0 5 表示差异显著 3 3 结果与分析 3 3 1 试验结果 在选定的粗酶初始酶活、阀片孔径、处理压力及处理次数等处理条件下，对提自马铃薯的p p o 粗酶液进行了u h p s c 处理，不同处理条件对马铃薯的p p o 的影响效果详见图3 1 。 m 1 。o 、47 3 u m ；、1 5 0 m p a 、1 次 啦i 、8 6 1 u m l 、1 5 0 m p a 、2 次 中7 0 、88 3 u m l 、i d 0 m p a 及9 0 m p a 并1 次 图31 马铃薯p p o 经u h p s c 处理后活性变化圈 f i g3 1t h e a c t i v i t yc h a n g eo f p o t a t op p oa f t e ru h p s cp r o c e s s i n g 囤中竖线代表标准误；相同字母表示差异不显著( p ( o0 5 ) ，b a ri n d i c a t e ds t m a d a r dc i t o r a n dv a l u e s f o l l o w e db y t h es a m c l e t t e r m r en o t s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t b v d u n c a n s t e s ta tp 00 5 - 2 6 中国农业大学硕士学位论文 第三章超高压射流破碎对多酚氧化酶活性影响初探 3 3 2 试验结果分析 由图3 1 所列不同处理条件对马铃薯的p p o 的影响效果可见： 1 马铃薯的p p o 粗酶液初始酶活为4 7 3 u m l 时，经】5 0 m p a 处理后次后p p o 被激活， 酶活变化率为1 0 3 。 2 马铃薯的p p o 粗酶液初始酶活为8 6 1 u m l 时，经1 5 0 m p a 处理二次后p p o 仍出现激活， 变化率达1 0 。 3 马铃薯的p p o 粗酶液初始酶活为8 8 3 u m l 时，在9 0 m p a 和1 4 0 m p a 下分别处理一次后， p p o 均出现失活，活性变化率为1 2 7