（分析化学专业论文）蛋白质（色氨酸）荧光探针及其分析应用的研究.pdf

山东人学硕卜学位论史 摘要 蛋白质和核酸是生命现象的物质基础。蛋自质担负着各种生理功能，从整体 上维持生物体新陈代谢活动的进行，是生物性状的直接表达者。蛋白质的定量测 定是生物化学和其它生物学科中经常涉及的分析任务，是临床检验中诊断疾病及 检查治疗效果的重要指标，也是许多生化药物分离提纯中质量检验及食品检验中 常见的分析项目。定量测定蛋白质的方法很多，其中探针技术是研究蛋白质结构、 功能、定性、定量的重要手段，对核酸和蛋白质探针的研究己成为生命科学领域 的前沿课题。 本论文从探索新蛋白质( 氨基酸) 荧光探针、研究其相互作用机理和发光机理 出发，以荧光为主要研究手段进行了研究。论文共分四个部分。 论文的第一部分综述了蛋白质( 氨基酸) 荧光探针的研究进展及其分析应用， 共引用了1 2 6 篇文献。 在论文的第二部分中，首次研究了色氨酸( t r p ) 体系中稀土共发光效应。研究 发现，l a 3 + 、l u 3 + 、g d 3 + 、s c 3 + 和y 3 + 都能够增强t b t r p s d b s 体系的荧光强度， 其中g d 3 + 的增强效应最大。同时，实验了t b g d - t r p s d b s 体系荧光产生的最佳 条件，并在此条件下，建立了t r p 的浓度与体系的荧光强度之间的线性方程，并 将该效应应用于t r p 的检测中，线性范围为4 o 1 0 罐- 4 o 1 0 一m o l l ，检出限为 1 0 x 1 0 - g m o l 1 ，并对复合氨基酸注射液样品进行了检测，得到满意的结果。同时， 本文对络合物的形成及其发光机理进行了研究。研究认为，在t b g d t r p s d b s 体系中，存在两种络合物t b - t r p s d b s 和g d t r p s d b s ，两种络合物聚集形成更 大的络合物，体系的荧光增强是由于分子内和分子间的能量转移以及共发光缔合 物的“能量绝缘壳”作用引起的。 在论文的第三部分中，e u ”能够和金霉素( c t c ) 反应并发射e u ”离子的特征荧 光，蛋白质的加入可以使荧光强度大大增强。本文实验了体系荧光增强的最佳条 件，并且将其应用于蛋白质( 人血清蛋白和牛血清蛋白) 的测定中。体系的最佳条 件如下：e u 3 + 浓度为1 o x l 0 一m o l l ，c t c 浓度为1 0 x 1 0 m o l l ，p h 为8 5 的t r i s h c i 缓冲溶液。在最佳条件下，体系的荧光强度与b s a 的浓度在2 o 1 0 - 71 o 1 0 4 9 m l 范围内成线性关系，与h s a 的浓度在8 0 x 1 0 l 1 0 1 0 。5g m l 范围内成线性关系 山东大学碗i ：学位论艾 体系的检出限分别达到8 9 1 0 母# m l ，3 3 x 1 0 。8g ，i n l 。该法已用于牛血清中牛血 清总蛋白含量的测定，取得了满意的结果。与别的蛋白质测量的发光方法相比， 该方法具有较宽的线性范围和较好的灵敏度。 在论文的第四部分中，在十二烷基硫酸钠的存在下，y 3 + 可以与芦丁发生反应 并使芦丁自身的荧光增强，蛋白质的加入可以使这一荧光强度大大加强。实验研 究了体系的最佳条件。在最佳条件下，该体系的荧光强度与蛋白质的浓度在一定 范围内成线性关系，线性范围分别为5 0 x 1 0 - 91 0 x 1 0 g m l ( b s a ) 和 3 0 x t 0 - s _ o x l f f 5 9 m l ( h s a ) 弄, t 1 1 0 x 1 0 2 0 x 1 0 4 9 m l ( e a ) ，它们的检出限分别为 1 6 1 0 一g m l ，9 8 1 0 - 9 9 m l , 1 3 2 1 1 0 墙加n l 。我们对该体系的作用机理进行了研 究，认为由于静电引力和疏水作用力的存在，在体系中形成了r u t i n y - s l s - b s a 的 络合物，其中b s a s l s 体系可以为r u f i n y 3 + 络合物提供一个比较好的疏水环境， 这一环境具有较低的极性和较大的微粘度，这样可使r u t i n y ”体系的荧光强度大 大增加。另外，b s a s l s 体系所提供的疏水环境能够减少配合物和水分子之间的 碰撞，从而减少因碰撞而导致的r u t i n s l s b s a y ”体系的能量损失。因此，体系 的荧光量子产率提高了，r u t i n y 3 + 体系的荧光强度大大增强。 本论文的主要特点： 1 ，首次发现并研究了色氨酸体系中的稀土共发光效应并将其应用于色氨酸的 测定中。这对于氨基酸的研究是一个重要进展。本方法不仅拓宽了稀土共发光效 应的应用范围，雨且也为色氨酸的检测提供了一个新的荧光探针。与色氨酸的其 它荧光光度法相比，本方法具有操作简便、快速、线性范围宽、灵敏度高等优点。 2 研究了蛋白质对稀金属离子配合物e u 一金霉素的荧光增强效应。该体系可 用于实际样品中牛血清蛋白和人血清蛋白的测定。实验结果表明，余霉素和蛋白 质通过静电引力和e u 3 + 结合形成配合物，蛋白质为e u - 金霉素提供了一个比较好的 疏水环境，并且减少了与水分子碰撞而造成的能量损失，从而使体系的荧光大大 增强。 3 ，研究了m t i n ，s l s b s a y 3 + 体系的荧光特性，并将之运用到实际样品中蛋白 质的测定。与其他测定蛋白质的荧光方法相比，该方法简便、快速，灵敏度高。 机理研究表明，b s a s l s 体系为r u t i n y ”络合物提供了一疏水的微环境。从而使 络合物的荧光得到增强。 l l 山东人学硕i ：学位论史 上述研究为蛋白质和氨基酸的检测提供了新的灵敏的荧光探针，丰富了稀土 共发光效应的内容，扩大了荧光分析方法的应用范围。 关键词：稀土共发光效应，蛋白，色氨酸，稀土离子，荧光，金霉素，芦丁 山东人学颂i ：学位论文 a b s t r a c t p r o t e i n sa n dn u c l e i ca c i d sa r et h em a t e r i a lb a s eo fl i f e p r o t e i n sa r et h ec ；u t i c ro f m a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，a n da r e a l s ot h ed i r e c te x p r e s s e ro fp h y s i o l o g i c a l c h a n 脚r s t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fp r o t e i n si so f t e ni n v o l v e di nt h ea n a l y s i so f b i o c h e m i s t r ya n do t h e rb i o l o g i c a ls u b j e c t s ，t h ei m p o r t a n tf a c m ro ft h ed i s e a s e d i a g n o s e sa n dt h et e s to ft h e r a p ye f f e c t s ，a n di st h ec o m m o na n a l y t i c a li t e mi nt h ef o o d e x a m i n a t i o na n di nt h eq u a l i t yt e s to fm a n yb i o c h e m i c a lm e d i c i n e s s e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n m a n ym e t h o d sh a v eb e e nu s e dt od e t e r m i n et h ep r o t e i n s ，a n do n eo f t h e m i st h ep r o b et e c h n i q u e i ti st h ei m p o r t a n tt e c h n i q u et os t u d yt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o n s o f p r o t e i n s ，a n dt od e t e r m i n et h en a t u r ea n dq u a n t i t a t eo f p r o t e i n s ，s oi th a sb e c o m et h e f o r e h e a di nt h ea r e ao f l i f es c i e n c e s b a s e do nt h er e s e a r c ho fn e wf l u o r e s c e n c ep r o b e so fp r o t e i n s ( a m i n oa c i d s ) a n d t h es t u d i e so nt h em e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o na n dl u m i n e s c e n c e ，t h i st h e s i su s e dt h e f l u o r e s c e n c ea st h ep r i m a r yt e c h n i q u et os t u d yt h ep r o t e i n s t h em a i nc o n c l u s i o n sa r e l i s t e da sb e l o w ： i nt h ef i r s ts e c t i o n ，w es u m m a r i z e dt h er e c e n td e v e l o p m e n t so ft h ef l u o r e s c e n c e p r o b e so fp r o t e i n s ( a m i n oa c i d s ) a n dt h ea n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s i nt h i ss e c t i o n , 1 1 3 r e f e r e n c e sa r ec i t e di na 1 1 i nt h es e c o n ds e c t i o n , w ef i r s t l ys t u d i e dt h er a r ee a r t hc o - l u m i n e s c e n c ee f f e c ti n t h et r y p t o p h a n ( t r p ) s y s t e m f r o mt h er e s e a r c l 1 ，w ef o u n dt h a tl a 3 + ，g d ”，l u ，s c 3 + a n dy ”c a ne n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft b - t r p - s d b ss y s t e m s ，a n da m o n g t h e mg d ”h a st h e g r e a t e s te n h a n c e m e n t d i f f e r e n te f f e c t s w e r et e s t e do nt h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo ft h et b - g d t r p - s d b ss y s t e m ，a n du n d e rt h eo p t i m n m c o n d i t i o n s ，t h ec a l i b r a t i o ng r a p hf o rt r pa r eo b t a i n e d t h e r ei sal i n e a rr e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h es y s t e ma n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft r yi nt h e r a n g eo f4 0 10 一t o o l l - 4 0 xl0 m o l l a n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s 1 0 10 一m o l l t h i s c a nb eu s e dt od e t e r m i n et h et r pi nc o m p o u n da m i n oa c i di n j e c t i o n ，a n dt h er e s u l ti s s a t i s f a c t o r y t h i st h e s i sa l s os t u d i e dt h ef o r m a t i o no fc o m p l e x e si nt h es y s t e ma n dt h e 1 v 坐墨叁兰墼! ：兰竺堡兰 l u m i n e s c e n c em e c h a n i s m h e r ew ec o n c l u d e dt h a ti nt h es y s t e mo ft b g d , - t r p - s d b s ， t h e r ee x i s tt w oc o m p l e x e s ：t b - t r p - s d b sa n dg d t r p - s d b s t h et w oc o m p l e x e sa r e i nc l o s ep r o x i m i t yi nt h es y s t e m ，a n dt h ee n h a n c e m e n to ft h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y c o m e sf r o mt h ei n t r a m o l e c u l a ra n di n t e r m o l e e u l a re n e r g yt r a n s f e r , a n d t h e e n e r g y i n s u l a t i n gs h e a t he f f e c to f g d t r p - s d b sc o m p l e x i nt h et h i r ds e c t i o n w ef o u n dt h a te u 3 + c a nr e a c tw i t hc h l o r o t e t r a c y c l i n e ( c t c ) ， a n de m i t st h ei n t r i n s i cf l u o r e s c e n c eo fe u 3 + t h ei n t e n s i t yi sg r e a t l ye n h a n c e db y p r o t e i n w et e s t e dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n da p p l yt h e s y s t e mt ot h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n s ( b s aa n dh s a ) t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa r e a sf o l l o w s ：e u ：1 2 1 0 m o l l ；c t c ：1 o x l 0 m o l l ；t r i s h c i ：p h = 8 5 0 u n d e r o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e di n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c ei s i n p r o p o r t i o nt ot h e c o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n si nt h er a n g eo f2 0 x10 7t o1 , 0 10 5g m lf o rb o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) a n d8 0 x 1 0 7 1 0 1 0 g m lf o rh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) t h e d e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) a r e8 9 10 9e c m lf o rb s aa n d3 3 10 一n g m lf o rh s a t h i s m e t h o dh a sb e e nu s e dt od e t e r m i n et h et o t a lp r o t e i ni nt h ec a l fs e r u m ，a n dt h er e s u l ti s s a t i s f a c t o r y c o m p a r e dw i t hm o s to t h e rl u m i n e s c e n c em e t h o d st od e t e r m i n a t i o np r o t e i n ， t h i sm e t h o dh a sl a r g e rl i n e a rr a n g ea n db e t t e rs e n s i t i v i t y i nt h ef o u r t hs e c t i o n ，w ef o u n dt h a ti nt h ep r e s e n c eo fs l s ，t h er u f i nc a nr e a c t w i t hy 3 + ，a n de m i t sf l u o r e s c e n c eo f r u t i n ，a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yc a r lb eg r e a t l y e n h a n c e d b yp r o t e i n s u n d e ro p t i m u m c o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e di n t e n s i t yo f f l u o r e s c e n c ei si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n si nt h er a n g eo f5 0 1 0 9t o 1 0 10 g m lf o rb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，3 0 10 - 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c t c p r o t e i ns y s t e m t h i s s y s t e mc a nb eu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fb s a a n dh s ai nt h ea c t u a ls a m p l e s ，s oi t i san e wf l u o r e s c e n c ep r o b et od e t e r m i n ep r o t e i n s t h ee x p e r i m e n t ss h o wt h a tc t c a n dp r o t e i n sc a nb i n dw i t he u 3 + t h r o u g he l e c t r o s t a t i cf o m e ，a n dp r o t e i n sc a np r o v i d ea g o o dh y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n t ，a n dt h i sc a nd e c r e a s et h ee n e r g yl o s sc a u s e db yt h e c o l l i s i o nb e t w e e ne u c t ca n dw a t e rm o l e c u l e s ，h e n c et h ef l u o r e s c e n c ec a r lb eg r e a t l y e n h a n c e d 。 3 s t u d i e dt h ef l u o r e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i co fr u t i n s l s b s a y 3 + s y s t e ma n du s et h e s y s t e m t ot h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n si nt h ea c t u a ls a m p l e s t h ei n t e r a c t i o n m e c h a n i s mi sa l s os t u d i e d ，c o m p a r e dw i t hm o s to t h e rf l u o r o m e t i cm e t h o d s ，t h i s m e t h o di ss i m p l ea n dq u i c k ，a n di th a sal a r g e rl i n e a rr a n g ea n db e t t e rs e n s i t i v i t y t h ea b o v er e s e a r c h e sp r o v i d es o m en e ws e n s i t i v ef l u o r e s c e n c ep r o b e sf o r t h e d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n s ( a m i n oa c i d s ) ，a n de n r i c ht h es t u d yo ne n e r g yt r a n s f e ro f t h e r a r ee a r t hc o - l u m i n e s c e n c ea n de n l a r g ei t sa n a l y t i c a la p p l i c a t i o n k e y w o r d s ：c o - l u m i n e s c e n c e ，p r o t e i n ，t r y p t o p h a n ，r a r ee a r t hi o n s ，f l u o r e s c e n c e ， r u t i n ，c h l o r o t e t r a c y c l i n e 符号说明 r l s ：共振光散射 c p b ：十六烷基澳化吡啶 h m l a ：六次甲基四胺 t r i s ：三羟甲基氨基甲烷 t o p o ：- - 辛基氧膦 p h e n ：邻菲哕啉 i r l s ：样品体系共振光散射的强度 i f 体系的荧光强度 t x 1 0 0 ：曲拉通x 1 0 0 t r p ：色氨酸 b s a ：牛血清蛋白 h s a ：人血清蛋白 s d s ：十二烷基磺酸钠 c t m a b ：十六烷基三甲基溴化铵 c t d n a ：小牛胸腺脱氧核糖核酸 f s d n a ：鱼精子脱氧核糖核酸 y r n a ：酵母核糖核酸 g m p ：鸟昔酸 a t p ：三磷酸腺苷 a i r ：荧光强度的增强值 1 h n m r ：核磁共振氢谱 r u t i n ：芦丁 u t p ：尿嘧啶 e a ：鸡蛋清白蛋白 s d b s ：十二烷基苯磺酸钠 s l s ：十二烷基硫酸钠 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全都 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：导师签名：日期： 山东人学硕i ：学位论史 第一章绪论 蛋白质和核酸是生命现象的物质基础。蛋白质担负着各种生理功能，从整体 上维持生物体新陈代谢活动的进行，是生物性状的直接表达者。蛋白质的定量测 定是生物化学和其它生物学科中经常涉及的分析任务，是临床检验中诊断疾病及 检查治疗效果的重要指标，也是许多生化药物分离提纯中质量检验及食品检验中 常见的分析项目。定量测定蛋白质的方法很多，其中探针技术是研究蛋白质结构、 助能、定性、定量的重要手段，对核酸和蛋白质探针的研究己成为生命科学领域 的前沿课题。 电化学探针、发光探针，特别是荧光探针技术、共振光散射技术由于其方法 简便，灵敏度高等优点，己成为研究生物大分子的重要技术之。将荧光探针技 术、光散射技术等光谱技术应用于核( 苷) 酸的定量、结构及作用机理等方面的研 究，是目前研究的前沿和热点之- - i 一7 1 。 由于蛋白质中存在着色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的残基，因此它能够吸收 2 7 0 3 0 0 n t o 的紫外光并发射紫外荧光。当测定体系中加入小分子配体时，小分子 配体与蛋白质发生相互作用，会导致蛋白质荧光的猝灭，利用小分子配体对蛋白 质内源荧光的猝灭这一现象可以确定蛋白质与小分子配体的作用类型及其结合部 位等。 但是对于蛋白质的研究仅仅利用其内源荧光是远远不够的。需要通过外源荧 光性质的研究才能获得更多关于蛋白质分子的各种信息。 由于发光探针的高灵敏度和高选择性，被广泛应用于蛋白质的测定中。常用 的蛋白质发光探针有：有机染料，荧光衍生化试剂，稀土离子及其螫合物荧光探 针近红外荧光探针，化学发光探针，共振光散射探针及纳米颗粒探针等。 本部分主要介绍蛋白质的荧光探针的研究现状及发展趋势。 第一节荧光染料探针 2 0 世纪6 0 年代兴起的染料结合定量分析蛋白质是一种较灵敏和特效的分光 光度法。最早报道的染料有溴酚蓝、溴甲酚绿、问溴酚蓝、亮绿等。近几年出现 了丽喜红和考马斯亮蓝g 2 5 0 ( c b b ) 的染料结合法。但是这些方法应用于碱性范围 山东大学硕i 。学位论立： 时，体系不稳定，并且与蛋白质结合的染料和未结合的染料光谱有部分重叠，造 成了测定误差。 2 0 世纪8 0 年代以后，开始将荧光染料应用于蛋白质的定量测定【8 】包括染料 的荧光增强法和染料的荧光猝灭法以及染料二聚体荧光法等。 1 染料的荧光增强法：几乎所有的蛋白质的染料探针为阴离子染料。这些染 料可以与带有正电荷的蛋白质通过静电作用结合。因此，体系p h 的选择就尤为重 要。染料的荧光强度的增强是源于染料所处微环境的改变。一般染料探针在水中 是没有荧光的或者荧光很弱，但在非极性环境中却会发光。当染料通过非共价结 合到蛋白质分子的非极性区域中时，它们的荧光得到急剧的增强。 人们在研究噻哗橙染料标记核酸方面已经作了不少的工作，但对于其与蛋白 质结合的光谱特性的研究还少有报道。g a oz h i y u 等将t o 1 、t o 2 两个染料分别 与蛋白质相结合，对它们的一些光谱特性进行了研究。研究发现。t o 2 与蛋白质 结合时，则表现出荧光的增强特性。研究表明，在喹啉环氮上引入适当的亲水性 取代基，可使噻唑橙类型染料的应用范围拓展到蛋白质标记领域【9 】。 8 羟基1 萘磺酸【l o 】溶液在紫外光照射下能发出微弱的绿色荧光，激发峰位 于3 7 0 3 8 0 n m ，荧光峰位于5 1 0 n m ，在酸性条件下与组蛋白结合时能产生很强的荧 光，激发峰位于3 7 5 n m ，荧光峰位于5 0 0 h m ，可用于组蛋白含量的测定。 藻红【1 1 】与蛋白质的复合物在l e x 舭m = 3 7 0 4 4 0 n m 处的荧光强度与蛋白质的 浓度成j 下比。该反应在室温下$ 1 】p h = 4 5 的缓冲溶液中可在1 分钟内反应完全。在 p v a 存在下埃铬青s 具有微弱的荧光，激发峰位于3 0 8 n m ，荧光峰位于4 2 3 n m 。慈 云祥等人用埃铬青s 作探针，与牛血清白蛋白结合后荧光峰的位置没有改变，但 荧光强度大大增强，据此建立了蛋白质的测定方法【1 2 】。 k i n o s h i t a 等利用次氯酸盐1 1 3 1 4 与蛋白质的氨基酸进行酰基化反应，然后 用亚硝酸盐除去活性氯，再与维生素b 1 作用生成硫代铬黄，在l e x f l e m = 3 7 0 4 4 0 n m 处测量荧光强度，据此建立了蛋白质的测定方法。t o s h i o 在此基础上实现了流动 注射法荧光测定蛋白质的灵敏方法【1 5 】，检测限为1 0 i j t g m l 。 在酸性条件下，水溶性卟啉a ，p ，t ，5 - 4 一( 对羧苯基) 卟啉( t c p p ) 【1 6 1 本身荧 光很弱，一定量的白蛋白可使t c p p 荧光增强，但球蛋白的增强作用不明显，当 有s d s 存在时，白蛋白和球蛋白对t c p p 的荧光增强作用均增加，基于这一现象， 山东人学颂j 学位论立 可以利用一个测定体系分别测定白蛋白和球蛋白。 一些染料小分子可与蛋白质结合，且其光谱呈现出能量转移特征，即发生荧 光的增强或猝灭。从这种现象可以得到许多信息，特别是可用来测定生物大分子 与某些基团之间的距离，因此常被称为“光谱尺【1 7 】 ，。文献【1 8 n 用荧光增强效应 推导出了给体受体能量转移的理论公式。杨曼曼等应用此公式研究了染料曙红、 亮绿、罗丹明与人血清、牛血清白蛋白和y 球蛋白的作用，获得了它们在不同结 合数下的生成常数，进而又研究了它们的能量转移效应、给体受体之间的距离 【1 9 】。 2 染料二聚体荧光法：进入2 0 世纪9 0 年代，人们发现了有些荧光染料在表面 活性剂的存在下自聚为二聚体，这种二聚体结构随蛋白质的加入而逐渐解聚。这 种能自聚反应的染料可以作为蛋白质测定的荧光探针。陈鸿琪等利用吖啶红染料 自聚体系 2 5 】在表面活性剂十二烷基磺酸钠的存在下，蛋白质的定量加入可调节 这一平衡，从而引起体系荧光有规律的变化，该方法线性范围宽、灵敏度高、反 应速度快、准确度高、抗干扰能力强，是染料分析法定量测定蛋白质的最新方法 之一。 耐尔蓝( n i l eb l u e ，n b ) 2 6 在适宜浓度的表面活性剂作用下形成的现场二聚 体具有弱荧光，在此体系中加入蛋白质，荧光强度显著回升并有良好的线性关系， 据此建立了测定蛋白质的新方法。 荧光素【2 7 】在阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 作用下形成二 聚体，利用体系荧光的变化可以定量测定蛋白质。该方法有灵敏度高，线性范围 宽，反应速度快。体系稳定时间长，抗干扰能力强，准确性好等优点，可作为蛋 白质常规分析的新体系用于临床检验。 罗丹a 强6 g 2 8 在十二烷基磺酸钠存在下能形成二聚体，而蛋白质的定量加入 可以调节单体和二聚体的平衡转化。利用这一特点，采用流动注射法测定蛋白质， 线性范围宽，灵敏度高，反应速度快，准确度高，抗干扰能力强，对实际样品的 测定结果令人满意。 阳离子染料灿烂甲酚蓝 2 9 1 具有在阴离子表面活性剂作用下形成现场二聚体 的荧光性能，可用其现场二聚体作为荧光探针，用于蛋白质的测定，测定牛血清 白蛋白的线性范围为0 7m g l ，检测限为3 7 9 9 l 。 山东人学硕：l ：学位论史 3 染料的荧光猝灭法：染料的荧光猝灭也可以被用于蛋白质的检测中。但与 荧光增强染料相比，灵敏度不高，因而限制了它的发展。 染料麦培喇红【2 0 】【m r 】是一种发荧光的碱性染料，蛋白质能与其发生作用， 使其荧光发生猝灭，其荧光猝灭程度在一定的范围内呈现良好的线性关系，利用 固定波长同步荧光分析法减小散射光的影响来测定蛋白质，方法简便，反应速度 快，灵敏度高。 冯喜增等人用光谱法研究了吖啶橙 2 h 与牛血清白蛋白的结合反应及能量转 移效率，证实了吖啶橙与牛血清白蛋白之间的作用为单一的静态猝灭过程。并证 明了能量转移引起的荧光猝灭机制。 宋功武等人 2 2 在p h = 2 5 3 的酸性介质中研究了曙红y 与牛血清白蛋白作用后 荧光强度的变化，在l e x l e m = 3 0 8 5 4 0 n m 处的荧光猝灭程度与牛血清白蛋白的浓 度成正比，检测限为2 0 p , g m l ，该法简便，快速，灵敏度较高。 四磺基铝钛箐 2 3 ，2 4 用于荧光猝灭测定人血清白蛋白，由于激发光与发射 光之间波长间隔很大，而且发射光位于近红外波段，有利于避开试样背景及散射 光的干扰，使方法具有较高的灵敏度和准确度，检测限为0 0 4 r a g l 。 n ，1 3 ，7 ，8 - 4 - ( 对磺苯基) 卟啉( t p p s 4 ) 是性能优良的蛋白质荧光探针。利用微 量蛋白质对t p p s 4 的荧光猝灭作用，可以测定纳克级的蛋白质。 另外已发现可用于荧光法测定蛋白质的还有：铬青r 3 0 1 、四碘荧光素 b 3 1 1 、茜素g i s 3 2 1 等。 第二节稀土离子及其螯合物荧光探针 1 藕土离子探针 稀土离子本身有发光的特性，如荧光强度高，线宽窄，寿命长，特征性强等。 稀土离子与生命体中几种重要的无机离子如c a 2 + ，m 9 2 + 的半径接近，因而可以作 为荧光探针研究生物大分子的性质。 e u 3 + 、t b 3 + 是最为常用的稀土离子。t b 3 十和e u 3 + 荧光光谱的高灵敏性和不同 环境对荧光的影响等，使得e u ”和t b 3 + 成为研究蛋白质的有效探针。 按照f f 6 r s l e r 偶极偶极无辐射能量转移机理，结合在不同蛋白质上的下b 3 + 与结 合在同一蛋白质不同结合部位t b ”会使t b 3 + 荧光有不同程度的敏化现象。正是这 4 山东人学钡1 学位论文 一特点可使我们利用稀土荧光探针研究蛋白质分子中金属离子结合部位，如含t 如 残基的蛋白质内的钙( i i ) 结合的分类研究【3 3 、3 4 】。e u ”的7 f o - 5 d o 跃迁为单线态到 单线念的跃迁，若体系- 中所有的e u 3 + 处于相同的环境，则对应于7 f o - 5 d o 跃迁激发 峰为单峰，故通过监测激光诱导的7 f o - s d o 诱导激发峰形，可确定金属离子结合部 位微环境是否相同。m u l q u e e n 等利用e u ”的7 f o - d o 激发峰研究了钙调蛋白【3 3 】，结 果表明，e u ”和钙调蛋白有两个强结合部位和两个弱结合部位。 利用s c a t c h a r d 作图法处理荧光滴定数据，可解出蛋白质分子的会属离子结合 部位数和结合常数。e p s t e i n 等对猪胰蛋白酶进行了研究 3 s ，研究表明，稀土离 子和猪胰蛋白酶有两个结合部位。从化学平衡过程来看，若蛋白质分子具有一个 或一个以上相同的相互独立的稀土离子结