量子点在生物分析中的应用.ppt

量子点在生物分析中的应用,2,量子点概述,当半导体材料降至一定临界尺寸后，电子在三维上的运动受到了限制，表现出量子局限效应。这类材料都称为量子点（quantumdots，QDs）,量子局限效应导致费米能级附近的电子能级由连续变为离散能级或能隙变宽，具有类似分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。,3,量子点又称为半导体纳米晶（nanocrystals，NCs）、半导体纳米粒子（nanoparticles，NPs）,-族：SiC，SiGe；,量子点种类,-族：CdSe，CdTe，ZnS，MgSe等；,-族：GaAs，InAs，GaSb等；,族：Si，Ge；,-族：PbSe；,单量子点：Au，Pd，Co等；,4,量子点的光学特性,宽吸收峰：能吸收所有比它第一发射波长更短的“较蓝”的光。,窄发射峰：具有非常窄且十分对称的荧光发射光谱。,大斯托克斯位移：消除激发光和散射光等背景干扰。,5,光稳定性：抵抗紫外、化学物质、生理代谢对其的降解。,安全：细胞毒性低，可用于活细胞及体内研究。,高量子效率：荧光强度大，发光时间长，便于长期跟踪和保存结果。,6,发射波长尺寸可调：通过控制量子点大小或组成合成任意所需发射波长的量子点，达到同时检测多种指标的要求。,独特优越的光学、电子和表面可修饰性！,7,量子点的应用,光电子学方面的应用：电致发光的光电子器件,80s后期，生物学家开始关注量子点在生物学方面的应用；,1998年，Alivisatos和Nie研究小组的工作：半导体量子点在生物学研究的应用取得重大突破。,8,M.Bruchez,M.Moronne,P.Gin,Weiss,A.Alivisatos.Science.1998,281:2013-2016.,采用两种QDs标记3T3小鼠纤维原细胞。一种发绿色荧光（2nm）：经TEOS、尿素及乙酸作用后，对细胞核具有很强亲和力；一种发红色荧光（4nm）：表面经生物素修饰后，与亲和素修饰的肌动蛋白丝发生特异性吸附。,QDs用于荧光生物标记,9,QDs用于非同位素标记生物分子的超灵敏检测,WarrenC,NieSM.Science,1998,281(5385):2016-2018.,QDs表面连接上巯基乙酸（HS-CH2COOH),从而使量子点既具有水溶性，还能与生物分子（如蛋白质、多肽、核酸等）结合，然后通过光致发光检测出QDs，从而使生物分子识别一些特定的物质。,10,A,B,C,originalQDs,mercapto-solubilizedQDs,QD-IgGconjugates,转铁蛋白与量子点共价交联，在受体的介导下发生内吞作用，转移至HeLa细胞中，证明连接的量子点仍具有生物活性。,11,两个创新点：发挥QDs的水溶性将QDs与生物分子的偶联,12,基于QDs与生物分子间的特异性相互作用,构建量子点-生物复合探针,特异性靶向作用,保持荧光强度及稳定性,减少其他分子非特异性吸附,13,量子点的制备,Top-down,Bottom-up,晶体表面刻蚀,组成器件,化学制备,生物标记,有机相制备水相制备,14,前驱体,稳定剂：巯基乙酸、巯基乙醇、2-硫代二乙醇、左旋半胱氨酸等,形成的量子点类型：CdSe传统核型，CdSe-CdS核-壳型，CdTe-CdS-ZnS核-壳-壳型，Eu掺杂CdSe,ie：在绝氧的条件下，向以巯基乙酸为稳定剂的CdCl2溶液中引入H2Te气体，通过高温或微波，使量子点快速成核及生长。,阳离子：Zn2+、Cd2+等；阴离子：Te2-、Se2-等。,15,量子点的表面修饰与生物功能化,1、使用双功能试剂，与量子点表面金属离子配合,16,3、对量子点表面进行硅烷化处理，并嵌入可与生物分子连接的官能团,2、表面修饰有三正辛基氧化磷（TOPO）的量子点先与双亲聚合物的疏水长链以疏水作用力相结合，再通过聚合物的亲水基团与生物分子连接,17,4、在量子点表面修饰带负电荷的基团，通过电荷作用力与带正电的生物分子结合,5、将量子点并入带空隙的微珠或纳米级的微球中，形成胶囊，再通过双功能试剂将微球与生物分子连接,18,生物成像荧光免疫分析生物芯片生物传感器基于FRET研究生物分子间作用,19,WuX,LiuH,LiuJ,NatBiotechnol,2003,21（1）:41-46,Wu等将CdSe/ZnS量子点与羊抗鼠IgG或链霉素结合，并将其作为二抗与抗Her2的单体克隆抗体进行免疫反应，从而实现乳腺癌细胞的特异性检测。,QDs用于生物成像技术,20,a.PEG-coatedCdSe/ZnS量子点标记的小鼠肺部：血管、肿瘤细胞、肿瘤中的血管和淋巴管b.近红外荧光QDs被前哨淋巴结吸收。,组织成像,KimS,LimYT,SolteszEG.Nat.Biotechnol.2004,22:93-97,21,c.包含各种量子点的不同颜色的微珠被注射到小鼠体内用于活体成像d.用连接有抗体的红色量子点进行小鼠活体内前列腺癌细胞的特异性标记和成像,XGao,ML.Richard,ShumingNie.Nat.Biotechnol,2004,22:959-960,活体成像,22,QDs用于免疫分析,是临床医学上鉴别某些生物标志的重要生物技术手段。,同时分析多种荧光物质,有机荧光染料,？,量子点,量子点与免疫球蛋白IgG结合，再捕捉抗原,23,GoldmanER,ClappAR,AndersonGP.AnaLChem,2004,76(3):684,Goldman等人用四种不同颜色的量子点分别于抗霍乱毒素、蓖麻毒素、志和菌毒素1和葡萄球菌肠毒素B的抗体偶联，在一个微孔板上实现了四种毒素的同时检测。,24,QDs应用于生物芯片技术量子点色彩的多样性满足了对生物高分子（蛋白质、DNA）所蕴含海量信息进行分析的要求,将聚合物和量子点结合形成聚合物微珠，微珠可以携带不同尺寸（颜色）的量子点，被照射后开始发光，经棱镜折射后传出，形成几种指定密度谱线（条形码），这种条形码在基因芯片和蛋白质芯片技术中有光明的应用前景。,25,CdSe/ZnS与有机磷水解蛋白（OPH）通过静电作用偶联，测定对氧磷。,QDs应用于生物传感器,26,XJi,JZheng,K.R.Vipin,M.L.Roger.J.Phys.Chem.B,2005,109,3793-3799,27,QDs基于FRET研究生物分子间相互作用,1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；,2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；,3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高,发生FRET的条件：,28,CZhang,L.W.Johnson,Anal.Chem.2009,81:30513055,29,SingleQuantumDot-BasedNanosensorforMultipleDNADetection基于单量子点纳米传感器用于多DNA检测,ChunyangZhang,JuanHu.Anal.Chem.2010,82,1921-1927,QDs用于DNA检测,30,传统,DNA检测,生物传感器单分子检测,核酸杂交技术,聚合酶链反应,操作复杂，条件难控制，耗时长，灵敏度受限制,双色重合法,双色荧光交联光谱,检测单个靶分子底物，荧光光谱重叠干扰,31,基于单量子点纳米传感器,本文根据量子点的宽激发谱带，窄且对称性好的发射谱带，高量子产率，光稳定性好的特点，基于双色同时检测法（two-colorcoincidence）以及荧光共振能量转移（FRET）检测法，在均相体系中的单分子水平下多通道检测HIV-1和HIV-2。,纳米传感器是以纳米级离子为敏感材料，能够探测、感受外界的信号、物理条件或化学组成，并将探知的信息传递给其他装置的功能单体或仪器。,32,twobiotinylatedcaptureprobes：captureprobe1,5-TAGTAAGAATGTATAGC-3-TEG-Biontin；captureprobe2，5-GCAACTAAATTCA-3-TEG-Biontin。,twoalexafluorreporterprobes：reporterprobe1，AlexaFluor488-5-CTGGGATTAAATAAAA-3；reporterprobe2，AlexaFluor647-5-AAAGGACCAGGC-3。,twotargetoligonucleotides：targetDNA1forHIV-1，5-GCTATACATTCTTACTATTTTATTTAATCCCAG-3；targetDNA2forHIV-2，5-TGAATTTAGTTGCGCCTGGTCCTTT-3。,ExperimentalSection,33,Thehybridizationexperiments：Bufferedsolution（pH=8.0）：100mMtris-HCl、10mM(NH4)2SO4，3mMMgCl2T=40,t=30mins,Mixbiotinylatedcaptureprobes,AlexaFluor488-andAlexaFluor647-labeledreporterprobes,andthetargetDNAs.（captureprobes:repoterprobes=1:1）.Atroomtemperature,Addthestreptavidin-coated605-nm-emissionQDs(605QDsc=2.510-11M).,34,Schematicviewoftheexperimentalapparatususedforsimultaneousdetectionofthephotonsemittedfromthe605QD,AlexaFluor488,andAlexaFluor647.Photonsemittedfromthe605QD,AlexaFluor488,andAlexaFluor647wereseparatedbythreedichroicmirrorsandetectedbythreeavalanchephotodiodes(APDs),respectively.,35,Thenormalizedabsorptionandemissionspectraofthe605QD,AlexaFluor488,andAlexaFluor647.Blueline,absorptionspectrumofAlexaFluor488;greenline,emissionspectrumofAlexaFluor488;blackline,absorptionspectrumofthe605QD;magentaline,emissionspectrumofthe605QD;cyanline,bsorptionspectrumofAlexaFluor647;redline,emissionspectrumofAlexaFluor647.,36,ResultsandDiscussion,37,RepresentativetracesofthefluorescenceburstsfromAlexaFluor488,the605QD,andAlexaFluor647detectedwithasingleQD-basednanosensorsformultipleDNAdetectioninamicrofluidicflow.ThefluorescencesignalsofAlexaFluor488wereshowningreen.Thefluorescencesignalsofthe605QDwereshowninblue.ThefluorescencesignalsofAlexaFluor647wereshowninred.,38,39,Conclusions,TheQDfunctionedasbothafluorescencepairforcoincidencedetectionandaFRETdonorforFRETdetection.,FunctionedasalocalnanoconcentratorwhichsignificantlyamplifiedthecoincidencerelatedfluorescencesignalsandtheFRETsignals,Simpleprobepreparation,PCR-free,highsensitivity,andlowcost,AsimpleandultrasensitiveapproachformultipleDNAdetectionatsingle-moleculelevelinahomogeneousformatandmightfindwideapplicationsingeneexpressionstudies,p