（生物物理学专业论文）耐辐射球菌dna连接酶的研究.pdf

致谢 本论文是在导师华跃进教授的悉心指导下完成的。自硕士生入学起，恩师就 在学习、工作、生活等方面给予了无微不至的关怀和帮助，他渊博的学识、严谨 的治学态度、宽厚待人的人格令我铭记在心。衷心感谢恩师三年来的信任、器重 和栽培! 三年的研究生期间，我有幸在浙江大学原子核农业科学研究所学习，得到了 全体老师的热心指导和支持。感谢陈予元院士、徐步迸教授、张永熙老师等给予 的关心和帮助。感谢浙江大学辐照中心傅俊杰副教授、赵小俊老师等在实验上给 予的热情帮助。同时，也要感谢给过我支持与帮助的所有老师。在此向他们表示 诚挚的谢意。 感谢本所全体同学给予的热情帮助和支持。感谢高冠军、张春潮师兄在我刚 进实验室时给予的耐心指导和点拨。感谢林军博士对我生物信息学知识耐心细致 的指导。感谢陆辉明博士、黄丽芬博士等同学在实验过程中的帮助。感谢实验室 其它可爱而又充满朝气的兄弟姐妹们，真诚的感谢他们所给予的无私而又令人难 以忘怀的帮助，与他们共度过的快乐时光永远值得我珍惜( 恕不一一举名) 。 非常感谢我的父母与家人，由于有你们在精神与物质上不断的支持，让我顺 利的完成学业，在此向他们深深的鞠躬! 要感激的人太多，也许你的名字并没有 在上面，也谢谢你的默默付出。 本研究受到国家基础研究项目( 2 0 0 4c b1 9 6 0 4 ) ，国家杰出青年基金 ( 3 0 4 2 5 0 3 8 ) 和国家自然科学基金重点项目( 3 0 3 3 0 0 2 0 ) 的资助。 乐东海 2 0 0 5 年5 月于浙大华家池 摘要 在耐辐射球菌基因组中有两个基因分别编码d n a 连接酶，一个是n a d + 依 赖型d n a 连接酶( l i g a ) ，一个是a t p 依赖型d n a 连接酶( l i g b ) 。本文对其 进行了生物信息学，突变和生化特性分析研究。结果如下： 1 系统进化和保守区域局部联配表明d r l i g a 在n a d + 依赖型d n a 连接酶 中与t h e r m u s 连接酶非常接近，而d r l i g b 与其它a t p 依赖型d n a 连接酶关 系很远，除了n i t r o s o m o n a se u r o p a e a e 18 8 4 ，真核d n a 连接酶i i i 的类似同源 物) 。 2 对d r b 0 1 0 0 和d r 2 0 6 9 进行了定向突变。d i 也0 1 0 0 为纯合子突变， d r 2 0 6 9 为持续的杂合子突变。因而，d r b 0 1 0 0 是个非必需基因，d r 2 0 6 9 是 必需的。 3 在大肠杆菌中表达出两者的重组酶，均一性纯化后进行了生化鉴定。两 种d n a 连接酶的最佳反应温度和p h 值分别为6 0 。c 和7 0 。它们的最佳m g c l 2 浓度为5 m m 。各自的1 0 0 热失活的半活性期大约为3 分钟和5 分钟。此外， d r l i g b 比d r l i g a 在粘性和平末端d n a 的连接上表现出更高的活性。 关键词：d n a 连接酶；耐辐射球菌：生物信息学；突变；生化特性 a b s 仃a c t t w og e n e se n c o d i n gan a d - 。_ d e p e n d e n t d n al i g a s e ( l i g a ) a n d a n a t p d e d e n d e n td n al i g a s e ( l i g b ) w e r ei d e n t i f i e di n t h eg e n o m eo ft h ee x r e m e l 3 7 r a d i o r e s i s t a n tb a c t e r i u m ，d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ( d r ) t h i sd i s s e r t a t i o n c o n t a l n 5 t h r e ea s p e c t sc o n c e m i n gb i o i n f o r m a t i c s ，m u t a t i o na n db i o c h e m i c a la n a l y s i s o fd r d n al i g a s e s r e s u r sa r ea sf o l l o w s ： 1 p h y l o g e n e t i ca n dr e g i o n a la l i g n m e n to f c o n s e r v e ds e q u e n c ea n a l y s i ss h o wt h a t d r l i g a 啪sh i g h l yr e l a t e dt o t h e r m u sl i g a s e s ，an a d + - d e p e n d e n td n a1 i 9 8 3 8 w h e r e a sd r l i g bh a dn os i g n i f i c a n th o m o l o g yw i t h s o l i l ea t p d e p e n d e n td n a l i g a s e ，o m e rt h a n i 打臼占o ， o 门口se u r o p a e a ( n e l8 8 4 ，ap o s s i b l eh o m o l o go fe u k a r y o t i c d n a l i g a s ei i i ) 2d r b 0 10 0a n dd r 2 0 6 9w e r eb o t hs u b j e c t e dt ot a r g e t e dm u t a g e n e s i s m m 8 n t d r b 0 1 0 0s h o w e dt ob eh o m o z y g o u s ，w h e r e a sd r 2 0 6 9w a s p e r s i s t e n t l yh e t 。r e z y g o “8 t h e r e f o r e ，d r b 0 10 0i sc o n s i d e r e dt ob ea n o n - e s s e n t i a lg e n e ，b u td r 2 0 6 9i sl i k e l y e s s e n t i a l 3t h er e c o m b h a n te n z y m e sw e r ee x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l t ，p u r i f i e d t o h o m o g e n e i t ya n dt h e i rb i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s w e r ec h a r a c t e r i z e d t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r ea n dp hv a l u eo ft h et w od n al i g a s e sw e r e6 0 。ca n d7 0 ，r e s p e c t i v e l y t h e i ro p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fm g c l 2w a s5 m m t h e i rh a l f - l i f eo fh e mi n a c t i v a t i o na t 1 0 0 。cw e r ea b o u t3m i na n d5r a i n ，r e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n ，d r l i g bd i s p l a y e d h i g h e ra c t i v i t yt h a nd r l i g a a ts t i c ka n db l u n te n d e dj o i n i n go fd n a 、 k e yw o r d s ：d n al i g a s e ；d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ；b i o i n f o r m a t i c s ；m u t a n t b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n 第一章文献综述 第一节耐辐射球菌的文献综述 耐辐射球菌( d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ) ( 简称d r ) 菌株r 1 ( a t c cb b a 8 1 6 ) 最早是由a wa n d e r s o n 于1 9 5 6 年发现，它在高剂量v 射线电离辐射灭菌过的 肉类罐头中以粉红色菌落出现( 1 ) 。d r 现在被认为是d e i n o c o c c a c e a e 的一员，属 于d e i n o c o c c a e e a e 纲的细菌是至今发现的最耐辐射的生物之一( 2 1 。该菌通过积 极修复受损的基因组，能够在极端剂量的电离辐射下存活，并未致死或造成突变。 另外，对其他d n a 受损条件包括干燥、紫外线、过氧化氢和众多的d n a 致损 化学药剂都具有抗性( 3 5 ) 。尽管d r 具有这些超凡能力，但并没有引起许多研究 机构的广泛兴趣，直到最近美国能源部( u n i t e ds t a t e sd e p a r t m e n to f e n e r g y , d o e ) 将它作为放射混合废料的一个潜在生物修复工具，这一兴趣以及随之而来的基金 资助大大推动了d r 的研究并促进了该菌基因组的测序。1 9 9 9 年1 1 月，美国基 因组研究所( t h ei n s t i t u t ef o rg e n o m i cr e s e a r c h ，n g r ) 在s c i e n c e ( 6 ) 上发表了 d r 的完整基因组序列。虽然基因组序列的公布对该菌的研究团队们来说受益匪 浅，但还是存在内在的缺陷，因为其几乎没有揭露任何关于该菌的抗性机制。事 实上，大多数的蛋白同源物能在己注释序列之内，电离辐射敏感性2 0 0 多倍于该 菌的大肠杆菌上找到与其相一致的蛋白。然而，基因组内超过一半的预测开放阅 读框( o r f s ) 编码的蛋白是未知功能的，并且直到现在，这其中的一大半( 1 0 0 2o r f s ) 在其他测序生物的基因数据库中还完全没有发现匹配物。目前，新型修复和应激 蛋白及途径的发现主要通过以下几个方式：1 ) 通过全突变、反向插入和副本插 入突变的方法，对那些与野生型相比不能在特定逆境中存活的突变体进行研究 ( 7 。1 0 ) ：2 ) 通过d n a 微阵列，对特定逆境下的总诱导反应进行分析( 1 1 ) 。我们 相信通过这些手段，在这些未鉴定基因的数据库里最终会找到该菌辐射抗性的关 键基因及其调控网络。 1 耐辐射球菌的特征与分类 d r 的特征颇为奇特，在丰富介质中该菌以典型的1 至2 9 r n 的四个细胞簇( 四 4 叠体) 生长( 1 2 ，1 3 ) ，虽然染色反应为革兰氏阳性，但其细胞壁的构造却接近董 兰氏阴性，如缺乏壁酸，具有外膜等( 1 4 ) 。但因其细胞壁的厚度及结构与一般革 兰氏阳性菌相似，故结晶紫染上后就不易被脱色，而呈革兰氏阳性反应。该菌没 有孢子，不具运动性，不会致病，需氧，含有红色色素，具有与般细菌不同的 脂质( 1 j ) 。而该菌的外膜外还具有sl a y e r ，是一层由蛋白质组成的h e x a g o n a l t y p a c k e di n t e r m e d i a t e ( h p i ) l a y e r ( 六边形填充介质层) ，h p il a y e r 紧密的结合在 外膜上具有支持和保护的功能。然而真正在d r 菌体最外层的则是一层碳水化 合物的外套，基部固定于外膜上，穿过h p il a y e r 形成一层厚而密集的构造，碳 水化合物外套也具有保护细胞的功能( 1 6 1 8 ) 。 d r 因其特征与微小球菌m i c r o c o c c u s 属细菌有若干相似，所以初期将它归 类于m i c r o c o c c u s 这一属( 1 ) ，并命名为m i c r o c o c c u sr a d i o d u r a n s 。后来经由一些 构造组成特征比对的差异，才由b r o o k s 和m u r r a y 二人更名为d e i n o c o c c u s r a d i o d u r a n s ( 1 9 ) 。经由演化上的研究，不论5 sr r n a 或者1 6 sr r n a 序列的比对 结果，均发现d e i n o c o c e u s 属与t h e r m u s 属的亲源关系十分密切( 图1 】) ( 2 0 ，2 1 ) 。而w h i t e 等人将zt h e r m o p h i l u s 的1 7 j 个蛋白质与dr a d i o d u r a n sr 1 的蛋白质做一比较，发现两者有1 4 3 个蛋白质十分相似，t h e r m u s 属为高温菌， d e i n o c o c c u s 属中有两种是微嗜高温的，因此推测两属的共同祖先是嗜高温性 的，也因为在高温环境中会对于细胞组成造成伤害，故而推测d e i n o c o c c u s 属的 耐辐射能力可能是由抗高温演化修改而得( 6 ) 。且dr a d i o d u r a n s 和z t h e r m o p k i l u s 体内相似的这1 4 3 个蛋白质全部都是由第一染色体( c h r o m o s o m ei ) 上的基因转录、翻译得来的( 只有一个蛋白质除外) ，因而推论dr a d i o d u r a n s 和 rt h e r m o p h i l u s 的c h r o m o s o m ei 是来自同一祖先，而其它的染色体和质粒则是各 自从不同来源发展而来的( 6 ，2 2 ) 。 d r 具有高度的抗辐射性，其大约可以耐受1 5 0 0 0 g y 的辐射剂量及8 8 0 3 m ： 的紫外光辐射能，如此高的辐射剂量足以杀死许多生命体了，例如人类对x 射 线的中间致死剂量仅约为4 g y 。该菌对于u v 的抗性约为大肠杆菌的3 0 倍( 2 3 ) ； 而对于离子辐射( y - r a y ) 的抗性为大肠杆菌的2 0 0 倍( 2 4 ) 。而其它同为d e i n o c o c c u s 属中的细菌，如dr a d i o p u g n a n s 、dr a d i o p h i l u s 及dp r o t e o l y t i c u s ，对于辐射 线或致突变剂也有高度的耐受性。另外耐辐射球菌对于d n a 致突变化学药剂( 如 丝裂霉素c ) 也有较高的抗性。将该菌置于浓度2 0 斗g m l 的丝裂霉素在3 0 。c 下培 养1 0 分钟，并不会使其失去生存能力；而在培养4 0 分钟后，仍然有l 的菌体 存活( 2 5 ) 。在较早期的研究中指出，该菌对于其它d n a 致突变化学药剂如n i t r o u s a c i d ( 亚硝酸) 、h y d r o x y l a m i n e ( 羟胺) 、n m e t h y l - n 一n i t r o n _ n i t r o s o g u a n j d i n e ( m n n g ) ( n 一甲基一n 一硝基- n 亚硝基胍) 和4 - n i t r o q u i n o l i n e - n o x i d e ( 4 - 硝基喹啉 一n 一氧化物) 也有抗性( 2 6 ) 。除此之外，d r 也具有高度耐干旱的能力，在干旱环 境下培养六星期，仍会有6 3 的菌体可修复，能力是十分惊人的，因干旱环境与 辐射线的照射皆会造成菌体内d n a 的损伤，因此该菌的耐干旱特性与抗辐射能 力是有关联性的。如该菌所衍生出的一些抗辐射能力较差的突变株，其酬干旱的 能力也降低了很多( 2 7 ) 。 09 e o t h e r m e l i s dp ( s u b s t i t u t l o np erp o s i t i o n ) 图1 1d e i n o c o c e a c g a e 的系统进化树 f i g i 1 n e i g h b o r - j o i n i n gu n r o o t e dp h y l o g e n e t i ct r e ew a sb u i l tu s i n gt h ep h y l i pp r o g r a mo nt h e b a s i so fl6 sr r n as e q u e n c e s f i v et h e r m u ss p e c i e sa r ei n c l u d e da sa no u t g r o u p 目前，d r 的分离株遍及全世界，分离来源从北美、欧洲、亚目，i i 至u 南极，从 辐照灭菌过的肉类罐头、动物粪便、牡蛎、空气、纺织品、土壤、温泉到极地冰 雪( 2 8 3 7 ) 。因为分离来源环境有潮湿、干燥、养分缺乏、养分丰富的地方，差 异颇大，所以对于d r 在自然界中的栖息环境目前尚未明了。在这些栖息环境中 有些环境是缺水的，干燥和水化的不断循环能引起单双链断裂和大范围的核苷酸 碱基损伤，因而长期从事该细菌的干燥耐性和d n a 修复机制的美国路易斯安娜 州立大学的j o h nb a t t i s t a 博士就认为，d r 在漫长的干旱抗性的进化过程中形成 了其自身的强大的d n a 修复系统，超强的辐射抗性是该细菌偶然地利用了其 d n a 修复机制，是一种附属的能力，即所谓的“协同进化说”( 2 7 ) 。 耐辐射球菌3 3 m b p 的基因组包含了四个环状分子：第染色体( 2 6 4 m b p ) ， 第二染色体( 4 1 2 k b p ) ，巨型质粒( 1 7 7 k b p ) 和质粒( 4 5 k b p ) ，编码了总共3 1 9 5 个预测基n ( 2 2 ) 。这四个遗传分子在稳定期为每个细胞4 个基因组拷贝，指数期 为每个细胞8 1 0 个基因组拷贝，并总以1 ：l ：1 ：l 等比例的于d r 细胞中，为同源 重组依赖型修复过程提供了充足的底物( 3 8 ) ，也意味着这四个遗传成分都是该菌 正常生长所必需的。四个遗传分子均为g c 丰富型，平均g c 含量为6 6 6 。不 过，4 5 k b p 质粒的g c 含量比其他三者低，为5 6 。基因组d n a 序列中每隔5 0 0 0 0 碱基的重复序列很有可能为该菌提供了冗余保护。对该菌全面的基因组分析( 2 2 ) 表明基因组不仅包括了1 0 0 0 个未知功能的基因，而且还存在许多典型的编码 d n a 复制和修复的细菌基因。值得注意的是，该菌中编码己知d n a 修复基因的 数目少于其他辐射敏感的原核生物，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。该菌中的有些 基因只是以前在真核或古细菌中发现过，对此现象的最好解释是这些共有的基因 是通过水平基因转移来实现的( 2 2 ) ，而水平基因的转移被认为是古细菌和细菌进 化中非常重要的贡献者( 3 9 ) 。d r 对外源d n a 供体具有很高的转化率，有可能这 一整合d n a 的倾向在其进化中起了重要作用。 目前，基因转化和操作系统只有在d e i n o c o c c u sg e o t h e r m a l i s 和d r a d i o d u r a n s 这两个神奇球菌上发展起来( 4 0 ，4 1 ) 。神奇球菌在整个指数生长期间 都是待转化和吸收的，它整合带特异性标签的同源d n a 的效率为0 叭一3 ( 4 2 ) ， 这其中dr a d i o d u r a n s 是已报道的具有最高自然转化率的神奇球菌( 4 3 ) ，这也推 动了对该菌各种各样基因操作技术的发展( 4 4 ，4 5 ) 。尽管关于d r 在吸收期间如何 进行d n a 转化的准确机制还没有确定，但是从我们的实验来看环状和线性d n a 的转化效率是相同的。环状d n a 的转化会导致环形的整合，并在整合位点的侧 翼形成直接重复，但这种整合方式是不稳定的，在压力选择时存在整合片段串联 副本的潜在可能，并在无压选择时可能形成插入的完全缺失。相反，线性d n a 的转化会在转化予和受体d n a 之间形成稳定的基因交换。另外，染色体d n a 、 质粒d n a 甚至p c r 扩增产物都可以被用来转化。 2 耐辐射球菌的抗辐射机制 在d r 基因组测序之前的4 3 年里，只有约2 0 0 篇相关研究文献发表，而在 序列公布后的5 年多中，论文篇数已经增加了18 0 篇左右，不管该菌的研究是多 么的汹涌至今始终有个问题困扰着研究人员：“为什么d r 这么刷电离辐射? ” 关于d r 抗辐射机制的研究相当多，而对于该菌高度抗辐射的可能原因有以 下的推测：1 ) 具有保护色素：例如此菌具有多种的类胡萝h 素，类胡萝h 素可以 抑制单一氧原子及具有氧化力的自由基，可以保护细胞免于受到光氧化的伤害。 根据研究指出d r 的类胡萝h 素成份是以叶黄素为主( 4 6 ) 。因此一些具有色素的 细菌如d r 、绝对嗜盐菌( o b l i g a t eh a l o p h i l e s ) ( 4 7 ) 及a r t h r o b a c t e rr a d i o t o l e r a n s ( 4 6 ) 等，对于紫外光等辐射线所产生的光氧化伤害均具有抗性。有研究指出d r 的色 素生成量减少时，其对于自由基( 如o 。一) 的抵抗能力则会下降( 4 6 ) 。2 ) 具有多层 的膜状构造：细胞壁复杂多层且具有外膜，外膜外还有sl a y e r ( h p il a y e r ) 与碳水 化合物外套，这些构造对于辐射线和紫外光具有阻隔作用。3 ) 锰离子的保护作用： 锰离子会和染色体结合，减少由光氧化伤害所形成的胸腺嘧啶二聚体，增加细菌 对辐射的抗性( 4 8 ) 。根据研究指出d r 能摄取大量的锰离子累积于细胞内，菌体 内所含的锰离子约为大肠杆菌的一百倍( 4 9 ) ，且细胞内高锰离子和低铁离子浓度 能促进耐辐射球菌y 射线辐射后的损伤修复( 5 0 ) 。4 ) 指环状染色体结构：研究 发现d r 具有致密有序的d s b s 环状堆积结构可能也是其抗辐射能力的一个关键 因素，这种基因组的指环状结构有利于该菌进行模板独立性的d n a 断裂免错连 接( 5 1 ) ，并且当r e c a 依赖型同源修复不能有效发挥作用时，可以将d s b s 紧紧 的包裹住再通过非同源末端连接( n h e j ) 和d n a 断裂片段的单链突出末端来 进行同源退火连接。此环状结构的内在稳定性受温度、m n 离子浓度、d n a 结合 蛋白和生长阶段的影响( 5 2 ) 。但最近也有学者认为此结构不是辐射抗性所必需 的，只是基因组在细胞内浓缩的结果，跟形状无关( 5 3 ) 。目前我们实验室的结果 也支持此类观点，认为环状结构只是和生长期有关，线性结构照样具有辐射抗性 ( 未发表) 。5 ) 对于受损的d n a 具有高效率的修复能力。目前大多的研究重点 都集中在d r 的抗离子辐射“一r a y ) 、紫外线和交联试剂的特性上。以离子辐射线 照射d r 及ec o l i ，使染色体上的双链d n a 断裂，d r 可修复多达一百多处的双 链断裂d n a 而c o t i 只能修复2 至3 个断裂处( 5 4 ) 。甚且有学者研究在外层 空间无重力的状况下，d r 的d n a 修复能力并没有多大的影响，但ec o l i 的d n a 修复能力却受到很大的抑制( 5 5 ) 。目前己确定d r 具有两种d n a 修复方式：切 除修复及基因重组修复。d n a 修复系统是预防性、耐受性的特性之外，d r a d i o d u r a n s 的主要抗辐射机制，该菌与d n a 修复有关的酶已陆续被发现，例 如：例如：核菅酸切除修复( u v ra b c d 、u v d e 与u ve n d o n u c l e a s eq 和b 相似) 、 碱基切除修复( d n ag l y c o s y l a s e 及a p u r i n i c a p y r i m i d i n i ce n d o n u c l e a s e ) 、错配切 除修复( m u t l 及m u t s ) 和多种重组修复( 如：r e c a 、r u r a b c 和s b c c d ) ( 6j 。 就d r 的d n a 修复机制而言，本菌远较一般原核生物完善，于此可归纳下 列四点：基因组注释预测的编码具有新型修复功能的假定基因( 6 ，2 2 ，5 6 ) ，或 是仍使用了传统的d n a 修复途径，但其效率大大高于其它细菌( 5 6 一j 9 ) ，使得 d n a 受损后的基因重组修复很有效率。辐射线照射后，d n a 复制停止( 6 0 ) ， 降解的d n a 可作为单链d n a 的重组之用。调节d n a 的复制及辐射线照射后 所引起的d n a 降解，使d n a 修复的的效率达最大值( 6 1 ，6 2 ) 。将受损的核苷 酸输送至细胞外，以防止其合并到正常基因组中，避免变异的发生( 2 2 ，i 8 ) 。细 胞内d n a 的复制、降解及重组修复，皆必须由菌体内的信号来共同调节才能完 成( 5 8 ) 。图1 2 阐明了这些未鉴定的信号蛋白或途径在d n a 修复过程中的作用。 我们认为p p r i ( d r 0 1 6 7 ) ( 6 3 ) 或称i r r e ( 6 4 ) 新鉴定的负责抗性的开关基因， 就是其中一个信号的感应器。该基因在d n a 损伤修复中起着极为重要的作用， 它能诱导跟d n a 修复相关基因r e c a 和p p r a 的表达并显著提高该菌中过氧化氢 酶的活性，此基因的缺失将急剧增加耐辐射球菌对电离辐射的敏感性( 6 3 ) ，它在 大肠杆菌中的外源表达增强了细胞的抗辐射和氧化能力( 6 5 ，6 6 ) 。到目前为止， 在n c b i 基因组数据库中并未发现具有较高同源性的类似物，是个特异性基因。 而与p p r l 相对应的r e c x ( d r l 3 1 0 ) 对r e c a 重组酶和清除r o s ( r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ) 的抗氧化酶则起了下调调控的作用( 6 7 ) 。当然，以上只是目前我们对于 d r 在d n a 修复机制上所了解的部分：至于有关d r 在受到辐射的照射后，细 胞内的信号是如何传递，以及抑制d n a 裂解的蛋白质发生哪些变化，乃至于这 些蛋白质的特性仍有待研究。 e x o o r f d e l o n m n gr a d l a t i o n h f g h l yc o n d e n s e o g e n o m e 愈毯於 0 n a r e p | i c a t i o r l 图1 2 耐辐射球菌对离子辐射诱导d n a 损伤的反应 f i g1 2 s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o ft h e r e s p o n s e o fd e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s t o i o n i z i n g r a d i a t i o ni n d u c e dd n ad a m a g e a sd n ar e p l i c a t i o n ，d e g r a d a t i o na n dr e c o m b i n a t i o n r e p a i ra r ec o o r d i n a t e l yr e g u l a t e d ，i ti sp r o p o s e dt h a tt h e s ep r o c e s sa r es e n s i t i v et o ，o rr e s p o n s i b l e f o rt h eg e n e r a t i o no fi n t r a c e l l u l a rs i g n a l s i ti sb e l i e v e dt h a tt h e a b i l i t yo fdr a d i o d u r a n st o s u r v i v ei o n i z i n g r a d i a t o ni n d u c e dd n a d a m a g ei n v o l v e sr e c o m b i n a t i o nr e p a i r ，t h er e g u l a t i o no f d n a r e p l i c a t i o na n dt h ee x p o r to fd a m a g e dn u c l e o t i d e s ( 5 8 ) 第二节细菌d n a 连接酶的文献综述 d n a 连接酶连接d n a 分子磷酸二酯键的断裂处，细胞内的很多主要反应都 用到了此酶。所有的d n a 连接酶都经历了相同的反应机制，但它们可以使用a t p 或是n a d + 来作为辅助因子。所有细菌( 真细菌) 包含了, , t a d + 依赖型d n a 连 篙 一 i 黜 j j 心 l - 一 甲至 接酶，此类酶对于细菌的独特性使得它们成为了新型抗生素的作用目标。除了 n a d + 依赖型连接酶外，一些细菌还包括了a t p 依赖型d n a 连接酶的假定基因。 细菌中这些不同同工酶的需求是未知的，不过可能跟不同方面d n a 代谢里的使 用有关。细菌中发现的假定a t p 依赖型d n a 连接酶与来自古细菌和病毒的关系 很接近。系统进化分析表明所有n a d + 依赖型d n a 连接酶的进化关系都是非常 接近的，而a t p 依赖型d n a 连接酶只是在极少数的细菌基因组中获得。 1 d n a 连接酶紧密的参与d n a 代谢 对于细胞内的许多基本反应，包括d n a 复制、重组和修复，适当d n a 末 端的正确连接是个关键的步骤。一类命名为d n a 连接酶的特殊酶，执行了这些 末端连接反应( 6 8 ) 。上个世纪的6 0 年代后期，好几个实验室从真细菌中分离出 了宿主和噬菌体诱发的d n a 连接酶( 6 9 ) 。随后，有关酶从更广泛的生物体包括 人中被鉴定和进行生化研究( 7 0 7 2 ) 。 d n a 连接酶反应机制的详细生化步骤在早期的文献评述中论述的很清楚 ( 7 l ，7 3 ，7 4 ) 。简要的说，所有d n a 连接酶形成共价的酶腺苷酸中间物t 图 1 - 3 a ) ，腺苷酰基( 龇订p ) 再转移到d n a 的5 一磷酸基端( 图1 3 b ) 。最后，被激 活的5 一磷酸基端可以和d n a 的3 - - o h 端反应合成磷酸二酯键，从而封闭缺口， 同时释放出a m p ( 图1 3 c ) 。对于所有的d n a 连接酶，a m p 被结合在酶催化模 体( m o t i f ) 的特异性赖氨酸残基上( k x d gi nm o t i fi ) ，n a d + 或a t p 可以作为 a m p 的供体。这些辅酶因子和d n a 连接酶袋状结合部位的高解析度结构分析表 明n a y ) + 腺苷酸基与酶的结合方式与依赖a t p 的d n a 连接酶相似( 7 l ，7 4 ) 。然而， n a d + 和a t p 总体结构不相似性( 图1 - 3 a ) 以及每个同工酶喜欢各自特异性辅酶因 子的事实说明这些辅酶因子和各自d n a 连接酶之间存在着不同的相互作用。 在进化里，现存生物体可以分为3 个界：真核生物，古细菌和细菌，对每一 界生命体和不同病毒基因组编码的d n a 连接酶的研究已经开展了起来。真核细 胞包括了许多使用a t p 的各种连接酶，且每个酶被用于具体的末端连接反应星。 从古细菌和病毒中分离到的d n a 连接酶也使用a t p 。直到最近，所有的细菌基因 组都编码了n a d + 依赖型d n a 连接酶，且被普遍认为独自承担起了所有的d n a 连 接反应。然而，现在来源于许多细菌基因组序列的证据表明某些细菌包含了2 个 或更多的d n a 连接酶，其中也包括a t p 依赖型连接酶。这些额外的a t p 依赖型连 接酶的出现意味着原核生物像真核生物一样，特异性的连接酶或许在体内具有各 自特异的作用，例如d n a 修复和重组( 7 5 ) 。因而这里要强调的是，目前通过实验 来确定a t p 依赖型和n a d + 依赖型d n a 连接酶在体内的功能差异是非常重要的。 图1 3d n a 连接酶的反应机制 f i g 1 3 r e a c t i o nm e c h a n i s m f o rd n a l i g a s e s a t h ee n z y m er e a c t sw i t ha t po rn a d + t of o r m ap h o s p h o a m i d e - l i n k e da m pw i t ht h ea m i n og r o u po f t h ea c t i v es i t el y s i n e b t h e5 - p h o s p h a t e a tt h en i c ka t t a c k st h ea c t i v a t e dp h o s p h o r y lg r o u po ft h ea m pt of o r ma na d e n y l a t e dd n a c d n al i g a s ec a t a l y s e sa t t a c ko f t h e3 - o ho f t h ed n a a tt h en i c ku p o nt h ea c t i v a t e d5 - p h o s p h a t e t of o r mt h ep h o s p h o d i e s t e rb o n da n dr e l e a s ea m p ，t h ed i s p o s i t i o no ft h ep r o t o nr e l e a s e dd u r i n g t h er e a c t i o ni su n k n o w n ( l e h m a n ，19 7 4 ) 2 古细菌、病毒和真核生物d n a 连接酶 除了昆虫痘病毒( e n t o m o p o x v i r u s ) 之外( 7 6 ) ，古细菌、病毒和真核生物中 鉴定到的d n a 连接酶基本上都以a t p 作为辅酶因子。古细菌基因组中至少编码 了一个d n a 连接酶，这些酶大部分都在嗜热古细菌里发现( 7 7 7 9 ) 。在那些研究 的最好的d n a 连接酶中，各种病毒基因组编码的d n a 连接酶就是其中的一部 分( 6 9 ，7 1 ) 。噬菌体t 4 连接酶经过了详细的生化分析，其克隆重组d n a 的分子 生物学程序也己被广泛的使用，并且x 一射线晶体衍射提供了t 7 噬菌体( 8 0 ) 和 小球藻病毒( 8 1 ) d n a 连接酶的高解析度结构。 所有真核生物的d n a 连接酶都是利用a t p 提供能量，且一种真核生物含有 多种d n a 连接酶同工酶：d n a 连接酶i 、i i i 和i v 。这些真核d n a 连接酶的各 种形式在大小和催化连接各种核酸底物的能力上存在差异。d n a 连接酶i i i 以许 多变体出现，且只在哺乳生物里被鉴定到，而d n a 连接酶i 和i v 的同源物发现 于人、老鼠、果蝇、酵母和拟南芥( 6 8 ，7 1 ，8 2 ，8 3 ) 。各种真核d n a 连接酶在细胞中 发挥了不同的、特异的功能( 6 8 ，7 1o 例如，d n a 连接酶i v 特异的使用于真核生 物d n a 非同源末端连接( n h e j ) 期间。 3 细菌n a d + 依赖型d n a 连接酶 大肠杆菌d n a 连接酶是最早被纯化和生化分析的连接酶之一，现已成为研 究n a d + 依赖型d n a 连接酶的范例( 6 9 ) 。大肠杆菌d n a 连接酶是个必需酶，由 6 7 1 个氨基酸( 分子量为7 4 k d a ) 组成并为妇4 所编码，此同源酶在枯草芽孢杆 菌中也是必需的( 8 4 ) 。对大肠杆菌n a d + 依赖型d n a 连接酶有条件的突变会导 致在特定温度下的生长停止，不过能被其他细菌n a d + 依赖型d n a 连接酶和真 核a t p 依赖型d n a 连接酶所补偿( s 5 ，8 6 ) 。类似的，大肠杆菌1 g a 和肺结核分支 杆菌t i g a 能充分的支持含a t p 依赖型连接酶突变的酵母的有丝分裂生长( 8 7 ，8 8 ) 。 因而，至少有一些n a d + 依赖型和a t p 依赖型连接酶，能有效的在细菌或是真核 生物的细胞罩发挥功能，意味着每个同工酶限于自身的生物体发挥功能是没有生 化理由的。不过细菌中都存在n a d + 依赖型d n a 连接酶，这样使其很有可能 成为新型抗生素富有成效的目标( 8 9 ，9 0 ) 。有报道称p y r i d o c h r o m a n o n e s ( 吡啶二 氢色原酮) 能单一的抑制多样的真细菌d n a 连接酶而不影响真核连接酶或是其 它d n a 结合酶( 8 8 ，9 1 1 。 一些嗜热属细菌和适冷海水细菌p s e u d o a l t e r o m o n a sh a t o p l a n 灯i s 在内的其它 细菌早，n a d + 依赖型d n a 连接酶也已被纯化和生化鉴定( 表1 1 ) 。到目前为 止，预测编码n a d + 依赖型d n a 连接酶的o r f s 在n c b i 公布的己测序完成的 每个细菌种属里都有存在( 表1 1 和表1 2 ) 。这些酶具有大致相同的大小和广泛 的氨基酸同源序列：表1 1 和表1 2 里所列的n a d + 依赖型连接酶与大肠杆菌i g a 的基本b l a s t 比对得到的氨基酸序列的一致性在3 5 5 0 之间( 均值为4 2 ) 。 来源于嗜热细菌的酶具有高热稳定性的特点帮助了d n a 连接的结构和机制 的研究，并使得这些生物体中的d n a 连接酶成为了用来研究这些酶的模式系统， 热稳定性细菌d n a 连接酶曾被证明是检测导致各种癌症突变的有用工具( 9 2 ) 。x 一射线晶体成像为我们提供了两种嗜热细菌的d n a 连接酶的高解析度结构， t h e r m u s ， z i f o r m i s 的全长蛋白( 8 9 ) 和b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s d en 末端腺苷化 结构域( 9 0 ) 的结构信息。这些高解析度结构大大的增强了我们对于d n a 连接酶 生化机制的了解，尽管作为基本方面的d n a 结合这些酶的本质还是没有解决。 有趣的是，t h e r m u s ，；f i f o ，m 抽d n a 连接酶的三维结构提出这种n a d + 依赖型酶的 两个区域独自的与d n a 相互作用( 7 4 ，8 9 ) 。 两者的x 一射线晶体成像结构很好的一致性以及n a d + 依赖型d n a 连接酶 全长的高度同源性表明所有这些酶都可能有相似的结构。在t h e r m u st 7 1 i f o r m i s n a d + 依赖型d n a 连接酶中含有四个不同的结构域，包括c 末端的b r c t 结构 域( 7 4 ，8 9 ) 。b r c t 结构域最早发现于胸腺癌感染基因b r c a l 的编码蛋白，包括 真核d n a 连接酶i i i 和i v 的d n a 修复蛋白的广大蛋白里也有存在( 9 3 ) 。可是那 些细菌内的一些a t p 依赖型d n a 连接酶中不存在b r c t 结构域，说明此结构域 并不是连接活性所需要的，而b r c t 结构域被认为可以促进大分子问的相互作 用( 蛋白和蛋白、蛋白一d n a ) ( 9 3 ) 。 事实上，n a d + 依赖型和a t p 依赖型d n a 连接酶保守模体的结构有很好的 同源性，虽然它们在序列水平上的相似性很差，只有包括催化位点的核心区域有 点保守( 7 4 ，9 0 ) 。这个发现f 好支持所有d n a 连接酶都经历了相同的基本反应机 制的观点。n a d + 依赖型d n a 连接酶模体i 、i i i 、i v 和v 在细菌中的保守性好 于a t p 依赖型，生化和基因的研究发现这些保守残基对于d n a 的连接反应很关 键( 7 1 ，7 4 ) 。序列和结构的比对为连接酶是怎样获得特异性辅酶因子提供了线索 而要是作为潜在的抗生素目标的话，对于其更为详细的理解将是必需的。 表1 1 经实验研究的真细菌d n a 连接酶 t a b l e1 1 e x p e r i m e n t a l l ys t u d i e dd n a l i g a s e sf r o me u b a c