（水产养殖专业论文）南海笛鲷属几种鱼类的分子系统学研究.pdf

南海笛鲷属几种鱼类的分子系统学研究 摘要 采用聚合酶链式反应( p c r ) 技术对勒氏笛鲷、金焰笛鲷、红鳍笛鲷、紫红笛鲷、 画眉笛鲷、星点笛鲷、约氏笛鲷、千年笛鲷和金带笛鲷的m t d n a 的1 6 sr r n a 的部分基 因片段进行了扩增。p c r 产物纯化后经t 载体连接进行克隆、测序，序列结果编辑后提 交g e n b a n k 并获得序列登录号。比对后得到了有效长度为5 6 1 b p 的序列，a 、t 、g 、c 的含量平均为2 8 5 、2 2 2 、2 3 5 和2 5 8 ，a t 含量稍高于g c 含量，9 种笛鲷中 碱基组成差异不大。利用t e g a 软件检测到单碱基突变位点3 1 个，变异位点6 8 个，其 中包括信息位点3 6 个，在变异位点中6 9 2 3 的碱基替换是由于发生了转换，转换和 颠换比为2 3 。经过计算发现在9 种笛鲷中勒氏笛鲷和金焰笛鲷、勒氏笛鲷和金带笛鲷 的亲缘关系最近，碱基差异为2 5 7 ；而红鳍笛鲷和金焰笛鲷、红鳍笛鲷和画眉笛鲷 的距离则明显较大，碱基差异达到了7 0 3 。利用测得序列分别构建了n j 和m p 分子 系统树，选用高体长棘鲷为外群发现两种方法构建的系统树基本一致：红鳍笛鲷和千年 笛鲷首先聚在一起作为独立的一枝分化出来，紫红笛鲷和约氏笛鲷聚为一小枝后与其他 5 种聚在一起。总体来看除红鳍笛鲷和千年笛鲷较近外，其他物种间均保持了一定的遗 传距离，没有非常近的现象，这也说明了在南海海域的这九种笛鲷仍保持了自己的遗传 特性。 对勒氏笛鲷、金焰笛鲷、红鳍笛鲷、紫红笛鲷和画眉笛鲷的i t s 一1 区进行了扩增， 纯化产物后转入t 载体进行克隆和双向测序，将序列结果提交g e n b a n k 并获得序列号。 各物种序列长度差异很大，最长的勒氏笛鲷的i t s 一1 长度为7 6 9 b p ，而金焰笛鲷仅为 5 6 6 b p ，尽管长度差异很大，但是其碱基组成却没有很大的差别。a 、t 、g 、c 含量平均 为1 4 6 、1 7 o 、2 9 4 和3 9 1 ，g c 含量远远超过a t 含量。经过比对发现插入 或缺失位点共2 0 1 个，变异位点3 7 6 个，其中信息位点为1 4 4 个。在变异位点中4 8 2 3 的碱基替换是发生了转换。转换颠换比值为0 9 ，这一比值远远低于正常d n a 序列的 比值。根据双参数和单参数两种模型计算的5 种笛鲷的碱基差异都很大，一般都在4 0 以上，勒氏笛鲷和金焰笛鲷碱基差异为0 2 4 1 8 ，相对较小，红鳍笛鲷和紫红笛鲷最 小为0 1 8 8 0 。使用鳜鱼为外群构建的n j 和m p 系统树基本上一致：勒氏笛鲷和金焰笛 鲷聚为一枝，红鳍笛鲷和紫红聚为一枝，而画眉笛鲷作为独立的一枝出现。这和利用相 对保守的1 6 sr r n a 序列构建的系统树基本上一致。 此外，本文还利用s s c p 技术对上述5 种笛鲷进行了初步分析。使用通用引物l 1 4 8 4 1 和h 1 5 1 4 9 从总d n a 中均扩增出约3 8 0 b p 的c y t b 片段，利用p a g e 电泳分别从勒氏笛鲷、 金焰笛鲷、红鳍笛鲷、紫红笛鲷和画眉笛鲷中检出了2 种、1 种、2 种、2 种和4 种基 因型。在5 种笛鲷中画眉笛鲷的遗传多样性最高，而会焰笛鲷的相对较小。 关键词：笛鲷属，r d n a i t s 一1 ，1 6 sr r n a ，p c r - s s c p ，分子系统学，遗传多样性 i i m o l e c u l a rs y s t e m a t i ca n a l y s i so fs e v e r a ll u t j a n u sg e n e r ai n s o u t hc h i n as e a a b s t r a c t t h ea r t i c l eu s e dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r lt e c h n o l o g yt oa m p l i f yp a r t i a lg e n e t i c f r a g m e n t so f16 sr r n ao fm t d n ai nl u t j a n u sr u s s e l l i 、l u t j a n u sf u l v i f l a m m a 、l u t j a n u s e r y t h r o p t e r u s 、l u t j a n u sa r g e n t i m a c u l a t u s 、l u g a n i t sv i t t a 、l u t j a n u ss t e l l a t u s 、l u t j a n u s j o h n i 、 三“和n i t ss e b a ea n dl u t j a n u sf a i g i e n s i s a f t e rb e i n gc l o n e dw i mt - v e c t o ra n ds e q u e n c e do f t h ep u r i f i e dp r o d u c t i o no fp c r ，t h es e q u e n c e sw e r es u b m i t t e dt og e n b a n ka n da c c e s s i o n n u m b e r sw e r eo b t a i n e d a f t e rc o m p a r i n gt h es e q u e n c e s ，i ts h o w e dt h a tt h ee f f e c t i v el e n g t h w a s5 6 1 b p ，c o n t e n t so fa ，t ga n dcw e r er e s p e c t i v e l y2 8 5 ，2 2 2 ，2 3 5 a n d2 5 8 ， a tw e r es l i g h t l yh i g h e rt h a ng c ，a n dt h ed i f f e r e n c eo fc o m p o s i t i o n so fb a s e si nt h en i n e k i n d so fl u t j a n u sw a sm i n i m u m 3ls i n g l e t o np o s i t i o nl o c ia n d6 8v a r i a t i o nl o c iw e r ef o u n d b yt h ee x a m i n a t i o nw i t hm e g as o f t w a r e ，a n dl a t t e ri n c l u d e d3 6i n f o r m a t i o nl o c i ，6 9 2 3 o ft h er e p l a c e m e n to fb a s e sw a sc o u r s e db yt r a n s f o r m a t i o ni n i t ，a n dt h e r a t i oo f t r a n s f o r m a t i o na n dr e v e r s e - t r a n s f o r m a t i o nw a s2 3 b yc o m p u t i n g ，t h er e l a t i o n s h i p so f l u 玎a n u sr u s s e l l ia n dl u 玎a n u s f u l v i f l a m m a 、l u t j a n u sr u s s e l l ia n dl u 和n u s i g i e n s i sw e r e c l o s e dw i 也2 5 7 b a s ed i f f e r e n c e ，b u tt h o s eo fl u ( i a n u se r y t h r o p t e r u sa n dl u 和h i t s f u l v i f l a m m a 、l u t j a n u se r y t h r o p t e r u sa n dl u t j a n u sv i t t aw e r eo b v i o u s l yd i f f e r e n t 、i m7 0 3 b a s ed i f f e r e n c e t h en ja n dm pm o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ct r e e sw e r ec o n s t r u c t e db yt h e o b t a i n e ds e q u e n c es e p a r a t e l y , t h et w ot r e e sw e r ef o u n db a s i c a l l yc o n s i s t e n tb yc h o o s i n g a r g y r o p ss p i n i f e ra sao u t s i d eg r o u pt oa n a l y z et h e m ：l i t 玎a n u se r y t h r o p t e r u sa n dl u 和n u s s e b a ef i r s tg a t h e r e di nt h es a m ep l a c ea n dd i f f e r e n t i a t e da sai n d e p e n d e n tb r a n c h ，t h e n l u t j a n u sa r g e n t i m a c u l a t u sa n dl u 玎a n u s j o h n ig a t h e r e da sas m a l lb r a n c hw i t l lo t h e r5k i n d s g e n e r a l l y ，t h e r ei sc e r t a i nh e r e d i t yd i s t a n c eo ft h en i n el u t j a n u se x p e c tt h a to fl u t j a n u s e r y t h r o p t e r u sa n dl u t j a n u ss e b a e i sc l o s e d ，t h i sa l s oe x p l a i n st h a tt h el u t j a n u sf r o ms o u t h c h i n as e a h a v et h e i ro w n h e r e d i t yc h a r a c t e r i s t i c s t h es e q u e n c eo f i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r s1 ( i t s 一1 ) i so n e o f e x t r e m e l yu s e f u ln u c l e a r g e n es e q u e n c e si nt h er e s e a r c ho fp h y l o g e n e s i se v o l u t i o n t l i se x p e r i m e n ta m p l i f i e dt h e s e q u e n c eo fi t s lo fl u t j a n u sr u s s e l l i 、l u t j a n u sf u l v i f l a m m a 、l u t j a n u se r y t h r o p t e r u s 、 l u t j a n u sa r g e n t i m a c u l a t u sa n dl u # a n u sv i t t a ，t h e nt h ep u r i f i e dp r o d u c t i o n sw e r ec l o n e di n t o t - v e c t o ra n ds e q u e n c e dd i r e c t i o n a l l y , a n dt h er e s u l t sw e r es u b m i t t e dt og e n b a n ka n d i l i a c c e s s i o nn u m b e r sw e r eo b t a i n e d t h es e q u e n c el e n g t h so f t h ef i v ef i s hw e r el a r g e l yd i f f e r e n t ， a l t h o u g ht h es e q u e n c el e n g t ho fi t s 一1i nl u 驴a n u sr u s s e l l iw a st h el o n g e s tw i t h7 6 9 b pa n d t h a ti nl u 玎a n u s f u l v i f l a m m aw a s5 6 6 b p ，t h ec o m p o s i t i o n so f b a s e si nt h e s ef i s hw e r es l i g h t l y d i f f e r e n t t h ea v e r a g ec o n t e n t so f a t ga n dcw e r er e s p e c t i v e l y1 4 6 、1 7 o 、2 9 4 a n d3 9 1 ，t h ec o n t e n t so f g cw e r eo b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h o s eo f a t b yc o m p a r i n g ，2 0 1 s i n g l e t o np o s i t i o nl o c ia n d3 7 6v a r i a t i o nl o c iw i t h1 4 4i n f o r m a t i o nl o c iw e r ef o u n d 4 8 2 3 o f t h er e p l a c e m e n to fb a s e si nt h ev a r i a t i o nl o c iw a sc o u r s e db yt r a n s f o r m a t i o n ，a n dt h er a t i o o fr e p l a c e m e n ta n dr e v e r s e - t r a n s f o r m a t i o nw a s0 9 t h ed i f f e r e n c eo ft h eb a s e si n f i v e l u t j a n u sw h i c hw a sl a r g ew i t ho v e r5 5 b yc o m p u t i n gw i t ht w om o d e l s ，a n dt h ed i f f e r e n c e o ft h eb a s e sb e t w e e nl u t j a i q u sr u s s e l l ia n dl u i j n i i u sf u l v i f l a m m aw a ss l i g h t l ys m a l lw i t h o 2 4 18 t h a tb e t w e e nw a st h es m a l l e s tw i t ho 18 8 0 t h en ja n dm pm o l e c u l a rp h y l o g e n e t i c t r e e sw e r eb a s i c a l l yc o n s i s t e n tc o n s t r u c t e db yc h o o s i n gs c h u a t s ia sao u t s i d eg r o u p ：l u 和i i i i s r u s s e l l ig a t h e r e dt o g e t h e rw i t hl u t j a n u sf u l v i f l a m m aa sab r a n c h ，l u t j a n u se r y t h r o p t e r u s g a t h e r e dt o g e t h e rw i t hl u 和 wa r g e n t i m a c u l a t u sa sab r a n c h ，b u tl u 盯a n u sv i t t at u m e du pa s ai n d e p e n d e n tb r a n c h t h i sw a sc o n s i s t e n tw i t l lt h em o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ct r e ew h i c hw a s c o n s t r u c t e db yt h er e l a t i v e l yc o n s e r v a t i v es e q u e n c e si n1 6 s r r n a i na d d i t i o n ，t h i sa r t i c l eh a sa l s op r e l i m i n a r ya n a l y z e dt h ea b o v e5k i n d so fl u t j a n u sw i t h s s c pt e c h n o l o g y c y t bf r a g m e n t sw i t h3 8 0 b pw e r ea m p l i f i e df r o mt h et o t a ld n a b yu s i n g g e n e r a lp r i m e r sl 1 4 8 4 1a n dh 1 5 1 4 9 ，a f t e rb e i n ge l e c t r o p h o r e s e dw i t hp a g e ，2g e n o t y p e s ，1 g e n o t y p e ，2g e n o t y p e s ，2g e n o t y p e sa n d4g e n o t y p e sw e r ef o u n do u tr e s p e c t i v e l yi nl u 和n i t s r u s s e l l i 、l u 盯a n u sf u l v i f l a m m a ，l u 和n l j se r y t h r o p t e r u s 、l u 驷n u sa r g e n t i m a c u l a t u sa n d l u 巧a n u sv i t t a l u 矿a n u sv i t t ah a dt h eh i g h e s t g e n e t i cv a r i a t i o no ft h ef i v e ，b u tl u 和r i l l s f u l v i f l a m m ah a dl e s s k e yw o r d s ：l u q a n u s ，r d n a - i t s - 1 ，1 6 sr r n a ，p c r - s s c p ，m o l e c u l a rp h y l o g e n e t i c a n a l y s i s ，g e n e t i cv a r i a t i o n 广东海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人声明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得本校或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 本学位论文成果归广东海洋大学所有。 指导教师签名 年月 u 一- 。陵名 日 研究生签名：缘矽享 砖g 诘，7 r 广东海洋大学硕士学位论文 第一章生物多样性及其遗传多样性研究方法 1生物多样性研究的内容及其重要。i 生 生物资源是全人类赖以生存的物质基础，它给人类提供衣食住行的物质条件，改善 人类的生存和生态环境，与人类的生存息息相关。但是由于人类活动的扩展，人口的急 剧膨胀，对各种生物资源的需求迅速增加，g | 起全球环境的逐步恶化，并导致越来越多 的物种遭到破坏，许多物种已经灭绝。因此，保护生物多样性的问题已经同益成为整个 国际社会广泛关注的热点问题。在这一点上，各国政府和科学家达成共识，大力支持丌 展遗传多样性的研究，研究各种生物的起源，功能，以及发展和维持等方面的基础性工 作，以实现对生物资源的科学管理和可持续发展利用。 生物多样性( b i o d i v e r s i t y ) 是指一定空间范围内多种多样活的有机体有规律的综合在 一起的总称【l ，2 】。这包括物种内、物种之间和生态系统的多样性。不同的学者对此有不同 的定义，但是一般来说生物多样性是指地球上所有生物( 动物、植物、微生物等) 所包 含的基因以及由这些生物与环境相互作用所构成的生态系统的多样化程度。它涵盖所有 不同种类的动物、植物、微生物及其所拥有的基因以及与生存环境形成的复杂的生态系 统。生物多样性是人类生存和发展的基础，它表现在生命系统的各个组织水平，从分子、 基因到生态系统乃至整个人类社会，不仅直接提供人类生活所必须的各种食物、药物、 纤维、建筑材料，还通过参与各种生物地球化学循环过程来维持人类生存所必需的生存 环境吲。 生物多样性可分为遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 、物种多样性( s p e c i e sd i v e r s i t y ) 和生态系统多样性( e c o s y s t e md i v e r s i t y ) 三个层次 4 1 ，其中生态系统多样性是指生物及其 生存环境所构成的综合体。主要指生态系统的组成、结构与功能在时间上的变化以及生 态系统的生物组分之间及其与环境之间的相互作用或相互关系。物种多样性是指某一特 定地理区域内动物、植物以及微生物种类的丰富性。它是人类生存和发展的基础，物种 资源是农、林、牧、副、渔各类经营的主要对象，它为人类生活提供了必要的物质基础。 遗传多样性是生物多样性的核心，这是因为遗传多样性的降低可减低一个物种对环 境改变的适应能力，降低生态系统中物种的丰富度，导致渔业资源的崩溃，甚至物种的 灭绝【4 】。遗传多样性是生物适应环境能力的体现，也是生命进化和物种分化的基础。一 个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性，而物种的经济和生态价值也依赖其特有 的基因组成，所以遗传多样性是生物多样性的核心，保护生物多样性最终就是要保护其 遗传多样性。 遗传多样性广义上是指地球上生物所携带的各种遗传信息的总和。狭义的遗传多样 南海笛鲷属几种鱼类的分子系统学研究 性主要是指种内的遗传多样性，即生物种内基因的变化，包括种内个体之间或一个群体 内不同个体的遗传变异总和【5 】，任何一个物种或一个生物个体都保存着大量的遗传基因， 因此，可被看作是一个基因库。一个物种所包含的基因越丰富，也就是它的遗传多样性 越丰富，它对环境的适应能力越强。也就是说种内的遗传多样性是一个物种对人为干扰 进行成功反应的决定因素，另外，种内的遗传变异程度也决定其进化的潜势。 与物种多样性和生态系统多样性相比，基因的不可视性使得人们辨别遗传水平的多 样性比较困难。但它不仅是生物多样性的重要组成成分，而且是物种多样性和生念系统 多样性的基础，也是生命进化和物种分化的基础，是生物适应环境能力的体现，更是评 价自然生物资源的重要依据。一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性，而物种 的经济和生态价值也依赖其特有的基因组成1 6 】，在生物的长期演化过程中，遗传物质的改 变( 或突变) 是产生遗传多样性的根本原因。自然界中存在的变异般都源于突变的积 累。一些中性突变通过随机过程整合到基因组中，上述过程形成了丰富的遗传多样性。 遗传多样性的研究具有重要的理论和实际意义。首先，遗传多样性的高低是物种长 期进化的产物，是其生存和发展的前提，也是其适应环境能力强弱的标志，物种的多样 性越高，越容易拓展其生存空间。理论推导和大量实验证据还表明，生物群体中遗传变 异的大小与其进化速率成正比，因此对遗传多样性的研究可以揭示物种的进化历史( 起 源的时间以及方式) ，也能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要资料【7 】。其次， 遗传多样性指标为保护生物学研究提供依据。只有清楚种内遗传变异的大小、时空分布 及其与环境条件的关系，我们才能采取科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源， 挽救濒于绝灭的物种，保护受威胁的物种 8 , 9 1 。第三，对遗传多样性的认识为生物各分支 学科提供重要的背景资料。对遗传多样性的研究无疑有助于人们更清楚地认识生物多样 性的起源和进化，尤其能加深人们对微观进化的认识，为动植物的分类、进化研究提供 有益的资料，进而为动植物育种和遗传改良奠定基础。 2 分子标记技术与生物多样性保护 生物多样性保护的目的是使全球生物多样性保存量最大、损失最小以及保护生物种 群持续生存和繁衍依赖的生态环境。分子标记的飞速发展有助于清楚了解种群关系。种 群动态及进化历史，从而为物种保护和种群控制提供更精确的科学依据。 天然群体在长期的遗传漂变、迁移突变和选择过程中，其基因频率会在一定水平上 波动。应用分子标记技术可以准确评价群体遗传结构和变化。基因突变、遗传重组、自 然选择、遗传漂变和物种进化都是表现在d n a 水平上的变化。分子标记是解决系统分 类与进化问题的强有力工具，它可用来研究个体、群体、物种之间的遗传差异和进化关 系，以利用和保护世界的丰富的遗传资源。 借助分子标记技术还可以知道被保护物种和其他物种的关系，为在原来稀有种确定 广东海洋大学硕士学位论文 保护优先顺序的基础上提供选择依据，利于特有种的确定和保护。利用分子标记有助于 阐明近交衰退的机理，分析亲本问的亲缘关系，更详细的了解系统分类关系和基因型， 对种群进行有效的监控。特别是基因测定和微卫星等高特异性技术的发展对于弄清种群 间关系、确定种间遗传渗透的利弊以及种群管理措施的制定有极大帮助。 应用分子技术，我们还可以分析遗传因素对种群生存力的影响，从而采取保护措施 把种群内及种群间的遗传多样性保存在保护目标允许的范围内。另外，分子标记还可以 用来推测种群的遗传多样性、种群问遗传关系和种群进化史中的生态背景等。 虽然分子标记技术不能提供直接的种群状态和存活能力的信息，但它能跟踪基因或 个体的长周期、远距离迁移情况，这对研究异质种群个体迁移格局、栖息地需求和扩散 格局，对确定异质种群及其结构，对研究种群问基因流以及近交衰退机理提供依据。我 国生物资源非常丰富，然而对其保存、评价和利用分子研究却相对落后。今后，随分子 生物学的发展及分子标记技术的完善，利用分子标记技术必将对保护生物多样性和提高 种质资源的研究水平起促进作用。 3 遗传多样性的研究方法 在研究遗传多样性的过程中，人们一直在致力于寻找一些可靠的遗传标记来提高研 究效率和效能。遗传标记的种类和数量随着遗传学和分子生物学等学科的发展而不断增 加，经历了一个从简单到复杂、从宏观到微观、从表型到本质的进步过程【m 1 。随着生物 学技术的不断发展，遗传标记技术也在不断发展，主要经历了形态学、细胞学、生物化 学及分子标汜等几个主要发展阶段“14 l 。 3 1 遗传标记的发展及其类型 遗传标记( g e n e t i cm a r k e r s ) 是指与目标基因性状紧密连锁，同该性状共同分离且易 于识别的可遗传的等位基因变异。1 9 世纪6 0 年代，m e n d e l 以豌豆为材料研究相对性状 的遗传规律，构成了最早的遗传标记一一形态学标记，奠定了近代遗传学的基础。2 0 世 纪初，m o r g a n 等将m e n d e l 提出的遗传因子的行为和染色体行为结合研究，由此诞生了 细胞遗传学，产生了细胞学标记。1 9 4 1 年b e a l d 和t a t u m 创立了生化遗传学，使得生化 标记得以应用。1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 提出d n a 分子结构双螺旋模型，预示了分子 遗传学时代的到来，开始了直接应用d n a 多态性为遗传标记的新阶段。1 9 8 5 年m u l l i s 等发明了聚合酶链式反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，p c r ) ，实现了可直接扩增d n a 的 多态性。p c r 技术的诞生在分子标记进展上具有里程碑式的意义，由于p c r 技术的迅速 发展，相继产生了各种新型的分子标记，遗传标记由此进入了一个全新的发展阶段。 3 1 1 形态学标记 形态学标记是与目标性状紧密连锁，表型上可识别的等位基因突变体。如植物的花 南海笛鲷属几种鱼类的分子系统学研究 型、花色等。目前，已建立了许多作物的形态标记遗传图谱，如：水稻、棉花等。但是 生物表型是遗传因素与环境因素相互作用的综合结果，仅靠形态学的观察并不能完全或 真实的反映遗传变异，得到的结果往往不够完善。 3 1 2 细胞学标记 生物学研究进入细胞学水平后，染色体组型分析成为重要研究工具。这种方法通过 比较细胞分裂时期染色体的形态参数，如相对长度、着丝点指数、臂比等将每条染色体 按各自特征区分开，得到一定的染色体组型。同时利用染色体显带技术进行差异显色， 借助特殊处理使染色体显示特定的带纹以便进行更细致的染色体带型分析 ”】。根据带型 和常规组型分析的指标识别染色体的异同，揭示染色体多态性。染色体多态性对于生物 遗传多态性的认识非常重要，但对染色体数目相等、形念相似的物种、类群或同一群体 不同个体来说，单纯用染色体多念性来进行遗传学研究是不够的。 3 1 3 生物化学标记 2 0 世纪6 0 年代中期，同工酶电泳技术问世，并在随后的二十多年时问内成为研究群 体遗传变异和群体问遗传分化、系统发育的主要手段。同工酶是基因表达的产物，如果 分子的大小和形状有所不同，在一定的缓冲介质中不同的同工酶所带电荷就不同，它们 可通过电泳分离，并经过与底物反应或是染色，检测其是否存在以及判断分子量大小。 通过同工酶的电泳表型可推断出编码同工酶的基因的基因型，并且可以得到基因及基因 型在群体中的分布频率，以此对群体的遗传结构和遗传变异水平进行研究。同工酶作为 共显性标记可以揭示基因的序列和功能差异。因此被广泛应用于建立遗传图谱、种群分 析、资源评价等的研究中。但是同工酶分析的是基因的表达产物而不是基因本身，由于 m r n a 翻译后存在一个修饰的过程，所以不能直接反应基因本身的变化，并且它也只能 分析编码可溶性酶的基因。 3 1 4 分子水平标记 随着分子生物学技术的进步，遗传标记发展到在核酸分子水平上分析具有相对差异 的等位基因。他们广泛存在于高等生物d n a 编码区及非编码区，因此被称为d n a 分子 标记。与前三种标记( 形态、细胞、生化标记) 不同，分子标记是d n a 水平上遗传变异 的直接反映，分析的对象是d n a 本身，所以更为直接和准确。 从第一代分子标记r f l p 诞生以来，分子标记的研究和应用飞速发展，各种分子标记 技术相继形成，已经发展到第二代( 以r a p d 为代表) ，第三代( 以s n p 为代表) 分子标记。 与其他三种遗传标记相比，分子标记具有下列优点：直接以d n a 形式表现，不受发 育时期、季节、环境限制。数量多，遍及整个基因组。多态性高，存在许多等位变 异。样品需求量少。很多分子标记表现为共显性，能鉴别出纯合基因型和杂合基因 型，能提供完整的遗传信息。由于分子标记具有上述优点，因此从它第一代标记技术诞生 以来，得到了迅猛的发展。 4 广东海洋大学硕士学位论文 3 2 分子标记的种类及其发展 分子标记研究的基本原理是利用可遗传的、离散的和稳定的标记去鉴别个体、群体 和种特征的基因型，从而达到分析生物遗传多样性，建立其种质标记的目的。 2 0 世纪8 0 年代以来发展起来的分子标记技术能够直接见到d n a 本身的序列变化， 为遗传多样性的研究提供了更直接、更准确的方法。由于避免了根据表型特征来推断基 因型时可能出现的各种问题，d n a 分析方法成为到目前为止最为有效的遗传分析方法。 原则上已经可以做到对任何基因组中的任何片段进行分析，包括d n a 的编码区和非编码 区，保守区和高变区，核d n a 和细胞器d n a 。所以d n a 的遗传标记几乎是无穷的，克 服了等位酶遗传标记数量有限等不足，但是并不是所有的分子标记都具有很大的优势， 一种理想的分子标记是要达到一定要求的。 3 2 1 理想的分子标记 作为一种理想的分子标记应该具有下面的要求【1 6 1 ：( 1 ) 具有高遗传多态性。( 2 ) 不 受环境、基因表达与否及其他因素影响。( 3 ) 共显性遗传，可鉴别j 下常二倍体个体中杂 合和纯合基因型。( 4 ) 能明确辨别等位基因。( 5 ) 除特殊位点的标记外，应均匀遍布整 个基因组。( 6 ) 选择中性，即没有基因多效性。( 7 ) 重复性好，检测手段简单、快速、 高效，试验程序易于自动化。( 8 ) 开发和使用成本尽量低廉。( 9 ) 具备科学、简洁的数 据统计分析方法。 3 2 2 分子标记的分类及代表性技术的简介 d n a 分子标记是指生物基因组d n a 经限制性内切酶酶切、p c r 扩增或是两者结 合等措施处理后电泳检测到的，反映基因组某种变异特征的特异性d n a 片段。根据所 采用的技术方法，分子标记大致可分为五大类： 3 2 2 1 建立在分子杂交基础上的分子标记技术 r f l p ：r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性片段长度多态性标记。r f l p 是1 9 8 0 年由美国学者b o s t s t e i n 【l7 】发现的快速识别d n a 多态性的第一种方法，是最早的 研究生物遗传多态性的d n a 分子标记。现在依然被广泛应用。其基本原理是用限制性内 切酶酶切不同个体的基因组d n a 后，产生大小不同的d n a 片段，通过电泳和s o u t h e r n 印迹转移到支持膜上，利用同位素或非同位素标记的某一片段d n a 作为探针，让酶切 片段与探针杂交，从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在长度上的差异。这种差异反 映了d n a 分子水平上的变异，它既可能是限制性内切酶识别位点的改变，也可能是部 分片段的缺失、插入、易位、倒位等。 r f l p 标记的优点是：r f l p 标记是一种共显性标记，它可以区分纯合体及杂合 体基因型，能够提供单个位点上较完整的信息；( 虿) r f l p 标记不存在表型效应，不受生物 个体发育阶段和环境条件的影响；非等位的r f l p 标记之间无基因互作，结果稳定可 靠，重复性好； r f l p 普遍存在于各种生物的基因组d n a 中。r f l p 标记的不足之处： 多态位点信息含量低，检测多态性水平过分依赖于限制性内切酶的选用；操作过程 南海笛鲷属几种鱼类的分子系统学研究 复杂，周期长，工作量大；检测中要用放射性同位素；需要的d n a 量大。 3 2 2 2 建立在重复序列基础上的分子标记技术 真核生物中存在着大量的重复序列，从2 0 6 0 不等，这些重复序列又可以分为中度 重复序列和高度重复序列，有的卫星d n a 可以重复上万次，这些序列不编码蛋白质，因 此在遗传上属于高度可变的序列，可以提供大量的遗传信息位点【l8 1 。根据重复单位的不 同主要包括以下几种：卫星d n a 、小卫星d n a 、短重复序列( s r s ) 、微卫星d n a 标 记( s s r ) 。目前在遗传多样性研究中被广泛采用的是微卫星d n a 标记。 微卫星d n a ，又称为简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) ，是由1 9b p 为重 复单位组成的高度重复序列。一般较短，如：( g a ) n 、( a c ) n 、( g a a ) n 。在染色体上随机 分布，d n a 重复单位的重复次数在同物种的不同基因型间的随机性，造成了每个基因位 点的多态性。微卫星d n a 作为遗传标记的优点是：多态性丰富，遍布整个基因组； 等显眭遗传，可从电泳结果中区分纯合体基因型和杂合体基因型；测定简单，结果 易鉴别，所需的d n a 量少；可以人工合成探针。因此，该标记目前已广泛应用于目 标基因的标记，绘制连锁图，遗传资源的鉴定和分类等。但是由于此技术需要知道重复 序列两端的序列信息，因此开发有难度，费用较高。 3 2 2 3 建立在以p c r 为基础的分子标记技术 p c r 技术是一种在体外快速扩增特定基因或d n a 序列的方法，因此又称为基因的体 外扩增法。这一技术的出现对分子生物学的发展具有里程碑式的意义，它可以在体外几 个小时内将微量的目的基因或某一特定的d n a 片段扩增数十万乃至千万倍，获得足够数 量的精确的d n a 拷贝。基于此技术诞生了许多分子标记技术，主要以r a p d ( 随机扩增 多态性d n a ) 为代表： r a p d ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ) 标记是由w i l l i a m s l l 9 1 和w e l s h 领导 的两个研究小组同时发现的一种新的d n a 分子标记。其原理是：是以p c r 为基础， 采用随机合成的较短的( 9 1 0 b p ) 单个随机引物对基因组d n a 进行p c r 扩增，一般 情况下，每个引物可以扩增出2 1 0 个片断，每个片断即可代表基因组上的一个位点。 就某一引物而言，尽管其检测基因组d n a 多态性的区域是有限的，但是如果使用一系 列的随机引物，则可以使检测区域扩大到整个基因组。该方法的优点是：简单易行， 周期短，需要的d n a 量少，无放射性：标记数量多，可以覆盖基因组中的所有位点： 合成一套引物可用于任何生物基因组的分析，且应用种类可以无限多。目前，r a p d 标 记已广泛应用于遗传资源的分类和鉴定、目标基因的标记等研究中。但r a p d 标记为显 性标记，不能提供完整的信息；易受实验条件的影响，表现为扩增产物稳定性差。 3 2 2 4 以d n a 特征序列为核心的分子标记 d n a 特征序列是指在生物基因组中有着特殊功能或者有着一些典型特征的序列。在遗 传学上常常将这样的序列作为研究遗传进化的一种标记。目前常用以d n a 特征序列为基 础的分子标记有：i s s r 、s t s 、s n p 以及i t s 等。 6 广东海洋大学硕士学位论文 s t s ( s e q u e n c et a g g e ds i t e ) 是指基因组中长度为2 0 0 5 0 0 b p ，且核苷酸顺序已知的 单拷贝序列，在基因组中只出现一次，并且通过p c r 可将其专一扩增出来。该技术由 o l s o n 于1 9 8 9 年开发成功。基本原理为：根据单拷贝的r f l p 探针、微卫星序列、a l u 因子等两端序列设计合适的引物，进行p c r 扩增，电泳显示扩增产物多态性。随着大规 模测序技术的发展，可以用于标记分析的s t s s 标记已经更加容易获得。s t s 标记的主要 特点为：标记来源广，数量多。共显性遗传，可区分纯合子和杂合予。技术简便， 检测方便。其开发依赖于序列分析及引物合成，成本比较高 l a n d e r l 2 0 1 1 9 9 6 第一次正式提出s n p ( 单核苷酸多态性) 作为新一代分子标记。 s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) 是指生物基因组d n a 序列中由于单个核苷酸( a ，t c 和g ) 的突变而引起的多念性。一个s n p 表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化， 源于单个碱基的转换或颠换。因此，通常所说的碱基的插入、缺失以及重复序列拷贝数的 变化等都不属于s n p 的范畴【2 “。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的 s n p s ，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区s n p s ( c s n p s ) 、基因周边s n p s ( p s n p s ) 和基因问s n p s ( i s n p s ) 等三类“j 。大多数s n p s 位于基因组的非编码区，它们 对个体的表现型是无意义的，但对群体而言，这些s n p s 作为遗传标记在群体遗传和生物 进化的研究中却很有用【2 3 j 。在描述s n p s 时，当前的一致意见是用单倍型( h a p l o t y p e ) 代 替等位基因。单倍型定义为在给定的一条染色体的紧密连锁的位点上多个等位基因的集合， 通常3 - 4 个相邻等位基因彼此靠近而构成的单倍型可作为一个整体而遗传( 称为单倍型 块，h