（植物病理学专业论文）利用AFLP分子标记和无毒基因构建小麦白粉菌遗传连锁图谱.pdf

摘要 小麦是我国第二大粮食作物，而由小麦白粉菌引起的病害使小麦的产量及品质受到严重的影 响，因此我们对其病原菌小麦白粉菌进行研究，为寻找适合的防治措施提供理论基础。目前国内 对小麦白粉菌的遗传学研究还很薄弱，在国际上也尚未获得小麦白粉菌无毒基因克隆的报道。在 国内，虽然李志英( 2 0 0 4 ) 、梅丽宏( 2 0 0 6 ) 分别构建了一个小麦白粉菌的遗传图谱，但已构建 的图谱在饱和度和与功能基因连锁的分子标记方面均有待于改进。国外目前也还未有小麦白粉菌 遗传连锁图谱的报道。由于对布氏禾白粉菌的研究还很有限，到目前为止布氏禾白粉菌的染色体 数目也还没有定论。小麦白粉菌遗传连锁图谱的构建，不仅对该病原菌的基因组及遗传研究具有 重要意义，而且为其他功能基因的定位及克隆奠定了基础。 本研究以具有8 个无毒基因差异的小麦白粉菌亲本菌株e 1 7 和c p w - 1 及其经杂交获得的f l 代9 7 个后代菌株作为实验群体即h a p 群体，利用a f l p 分子标记方法，对两小麦白粉菌亲本及 其后代群体进行多态性分析，符合1 ：1 分离比的a f l p 标记采用m a p m a k e r e x p ( v e r s i o n 3 0 ) 软件并利用j o i n m a p 4 0 软件进行比较作图，最后结合m a p d r a wv 2 1 软件绘制小麦白粉菌的 遗传连锁图谱。 实验选用1 0 2 对a f l p 引物组合对亲本菌株进行多态性分析，有6 1 对引物产生多态性。这 6 1 对引物在后代群体中共产生1 3 8 个多态性标记位点，与6 个通过毒性鉴定获得的无毒基因数据 共1 4 4 个进行分析。利用m a p m a k e r 分析，结果绘制小麦白粉菌连锁群1 0 个，共包含1 1 7 个标记 位点，其中包括5 个无毒基因位点和1 1 2 个a f l p 标记位点，图谱总长1 4 2 5 1c m ，标记间平均 距离为1 2 2c m 。5 个无毒基因分别被标记到3 个连锁群中，其中2 个无毒基因a v r 4 b 、a v r 4 a 紧 密连锁，距p l l m 2 3 3 为4 2c m 、距p 1 8 m 1 5 1 为4 5c m ，并定位在b g t l 中；a v r l 3 位于p 2 2 m 1 8 1 和p 1 3 m 1 7 之间，遗传距离分别为0 6c m 和o 1c m ，定位于b g t i ；a v r 3 c 位于b g t 2 ，距离标记 p 2 0 m l l 为3 0c m ；a v r 3 f 被定位在b g t 8 中。 本实验所构建的遗传连锁图谱为首个在小麦白粉菌中构建的具有1 1 7 个位点的遗传图谱，而 且首次获得了与无毒基因紧密连锁的a f l p 分子标记位点。这些为小麦白粉菌无毒基因的克隆、 无毒基因的功能和遗传学研究提供了基础。 关键词：小麦白粉菌，a f l p 分子标记，遗传连锁图谱，无毒基因 a b s t r a c t w h e a ti st h es e c o n dl a r g e s tf o o d c r o pi nc h i n a p o w d e r ym i l d e w ( b l u m e r i ag r a m i n i sf s p t r i t i c i ) i s o n eo ft h em o s ts e r i o u sd i s e a s e si nw h e a t s ot h er e s e a r c ho nt h i sd i s e a s ei sv e r yi m p o r t a n t i ti sl i m i t e d i nt h er e s e a r c ho fw h e a tp o w d e r ym i l d e wg e n e t i c si nc h i n aa n dt h e r ei sn or e p o r to nt h ec l o n eo f a v i r u l e n c eg e n e so ro t h e rf u n c t i o n a lg e n e s a l t h o u g hal i n k a g em a po fw h e a tp o w d e r ym i l d e wh a sb e e n c o n s t r u c t e db yl iz h i y i n g ( 2 0 0 4 ) ，t h el i n k a g em a pi ss t i l lq u i t ei n c o m p l e t ew i t hl i m i t e dn u m b e ro f m a r k e r s ，a n dt h e r ea r en om a r k e r st h a ta r el i n k e dc l o s e l yt oa v i r u l e n c eg e n e so ro t h e rf u n c t i o n a lg e n e s t h e r ei sn oo t h e rr e p o r to nt h el i n k a g em a po fw h e a tp o w d e r ym i l d e ws of o r t ha n dt h ec h r o m o s o m e n u m b e rh a sn o tb e e nf i n a l l yd e t e r m i n e d n ec o n s t r u c t i o no fl i n k a g em a pi st h ef u n d a m e n t a lo ft h e f u n g a lg e n o m i c sa n dg e n e t i cr e s e a r c h n el i n k a g ea n a l y s i sw a sc o n d u c t e do n9 7s e g r e g a t i n gh a p l o i dp r o g e n yi s o l a t e sf r o mac r o s s b e t w e e n2i s o l a t e s ，e 1 7a n dc p w - 1 ，d i f f e r i n gi ne i g h ta v i r u l e n c eg e n e s t h ea m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ( a f l p ) t e c h n i q u ew a su s e dt oa n a l y z et h ep o l y m o r p h i s mo fp a r e n ta n dp r o g e n yi s o l a t e s m a p m a k e 剐e x p ( 3 0 b ) a n dm a p p i n gs o f t w a r em a p d r a wv 2 1w e r eu s e dt oc o n s t r u c tt h el i n k a g e m a p 1 0 2p a i r so fa f l pp r i m e r sw e r eu s e dt oa n a l y z et h ep o l y m o r p h i s mo fp a r e n ti s o l a t e sa n d6 1p a i r s s h o w e dp o l y m o r p h i s m 1 4 4d a t aw a so b t a i n e di n c l u d i n g6a v i r u l e n c ed a t ai nt o t a l at o t a lo f1 1 7l o c i w e r em a p p e d c o m p r i s i n g1 1 2a f ipm a r k e r sa n d5a v i r u l u n c eg e n e s n em a r k e r sa r ed i s t r i b u t e do v e r 1 0l i n k a g eg r o u p sc o v e r i n gat o t a lo f1 4 2 5 1c ma n dt h ed i s t a n c eo ft w ol o c ii sa b o u t1 2 2c mi n a v e r a g e n e5a v i r u l e n c el o c ia r ed i s t r i b u t e di nf o u rl i n k a g eg r o u p s a m o n gt h e m 。a v i r u l e n c eg e n e s a v r 4 ba n da v r 4 aa r ec l u s t e r e dt i g h t l yi nb g t la n dl i n k e dt om a r k e r sp l l m 2 3 3a n dp 1 8 m 1 5 1w i t ht h e e s t i m a t e dg e n e t i cd i s t a n c eo f4 2c ma n d4 5c m a v r l 3l o c a t e sb e t w e e nm a r k e r sp 2 2 m 1 8 1a n d p 1 3 m 1 7i nb g t lw i t ht h eg e n e t i cd i s t a n c eo f0 6c ma n d0 1c m r e s p e c t i v e l y a v r 3 ca n dp 2 0 m l la r e l i n k e da n dt h eg e n e t i cd i s t a n c ei s3 0c mi nb g t 2 a v r 3 fw a st a r g e t e di nb g t 8 t h i si sam u c hm o r ec o m p l e t eg e n e t i cl i n k a g em a po fw h e a tp o w d e r ym i l d e w , c o m p a r e dw i t ht h e e x i s t i n go n e sw i t h1 1 7l o c ia n dt h e 圃譬m o l e c u l a rm a r k e r st h a ta r ec l o s e l yl i n k e dt oaf e wa v i r u l e n c e g e n e sa r er e p o r t e df o rt h ef i r s tt i m e t h i sl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rt h ec l o n i n go fa v i r u l e n c eg e n e sa n d p r o v i d e dt h eb a s i so fg e n e t i ca n df u n c t i o n a lg e n o m i cr e s e a r c h e sf o rt h ep o w d e r ym i l d e wp a t h o g e ni n w h e a l k e yw o r d s ：w h e a tp o w d e r ym i l d e w , 氏n 里m o l e c u l a rm a r k e r , g e n t i cl i n k a g em a p a v i r u l e n c e g e n e 英文缩略表 茎奎箜量 菱銮全整 奎鱼整 a f l 。p a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 b c lb a c kc r o s s1 回交一代 b p b a s ep a i r s 碱基对 c m c e n t i m o r g a n s 厘摩 d hd o u b l e dh a p l o i d 双单倍体 d n a d e o x y f i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 hhour 小时 h a p h a p l o i dp o p u l a t i o n 单倍体群体 i s s r i n t e r _ s i m p l es e q u e n c er e p e a t 简单重复序列间多态性 k b k i l o b a s e s千碱基对 m i n m i n u t e分钟 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r a p d r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m e r p h i s md n a 随机扩增多态性d n a r f l pr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m e r p h i s m 限制性片段长度多态性 r i lr e c o m b i n a n ti n b r e dl i n e s 重组自交系 r n ar i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 ss e c o n d 秒 s s r s i m i p i es e q u e n c er e p e a t s 简单序列重复 s n p s i i l 盟旦塑竺! ! ! 竺! 塑! ! 竺! ! 里! 堡皇坐坐兰鏊重堕童查丝 - _ - _ _ - - - = 。一一 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：；夯 时间：滩月口日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农 业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用 不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名： 多季蟊 时间：加多年占月夕日 导师签名： 话素屿 时间： 印8 年石月f o 日 中国农业科学院硕f 论文第章引言 第一章引言 小麦是世界性的粮食作物，世界上种植小麦的国家很多，产量主要集中在中国、印度、美国、 俄罗斯、加拿大、澳大利亚和阿根廷等国家。根据世界粮农组织2 0 0 6 年统计数据这几个国家小 麦产量占世界总产量的5 7 ：中国是唯一总产量超过1 亿吨的国家，位居世界第一，其次是印度、 美国和俄罗斯。 在中国，现在小麦生产中重要的常发病害小麦白粉病，在2 0 世纪9 0 年代曾两次造成超过数 亿公斤甚至十几亿公斤的小麦损失( 刘万才，1 9 9 5 ) 。2 0 0 0 年至2 0 0 5 年每年的发病面积基本上均 在6 0 0 万公顷以上( 病虫害防治绿皮书，2 0 0 1 2 0 0 6 ) ，对小麦产量及品质的影响比较严重，因此 小麦白粉菌也成为了研究的重点。 以前，科学工作者对作物抗病性的研究重点一直是寄主植物，但基因对基因假说的提出，使 得科研工作的重点不仅仅局限于寄主植物，对病原菌的研究也逐渐得到重视。目前，对小麦白粉 菌的研究还处于起始的阶段，而构建遗传连锁图谱现己成为研究生物体传统遗传学、群体遗传学、 分子遗传学及基因组学的基础，因此小麦白粉菌遗传连锁图谱的构建具有重要的实际意义。 1 1 小麦白粉病概况 1 1 1 小麦白粉病的发生及危害 小麦白粉病是由专性寄生菌禾布氏白粉菌( b l u m e r i a g r a m i n i s l s p t r i t i c i ) 引起的小麦生产上 的主要真菌性病害之一，在全世界大多数小麦产区都有发生。1 9 0 0 年以前，欧洲就有报道。在 2 0 世纪6 0 年代以前，小麦白粉病仅在具有充沛雨量的海洋性和半大陆性气候环境的小麦种植区 流行并造成严重的产量损失( b e n n e t ，1 9 8 4 ) 。目前，小麦白粉病在亚洲、东非、：l b l 、北欧及 北美的东部冷凉地区发生严重。此外，该病还在温暖潮湿、冬天气候温和的美国东南部和南美南 部锥状地带秋麦区危害严重( 许红星，2 0 0 4 ) 。 我国小麦白粉病最初于1 9 2 7 年在江苏省发现，后逐渐在西南各省和部分沿海地区发生。2 0 世纪7 0 年代以后我国也随着矮杆小麦品种的推广和水肥条件的改善，发病面积和范围不断扩大， 并向北方麦区蔓延( 董金皋，2 0 0 1 ) 。从发生面积来看，1 9 8 0 年以前，全国常年发生面积一般在 1 0 0 万公顷以下，之后发生面积开始扩大，在1 9 8 0 、1 9 8 1 、1 9 8 5 、1 9 8 7 、1 9 8 9 年几个较重发生年 份，发病面积分别达到2 2 0 、2 8 7 、4 5 3 、4 7 0 和6 7 0 万公顷，1 9 9 0 1 9 9 1 年创历史最高纪录，两年 发病面积均达到1 2 0 0 万公顷；从发生范围来看，7 0 年代后期以来，白粉病在滇、黔川、鄂、湘 等省发生相继加重，并在江淮流域开始流行。1 9 8 0 除在川、黔等省偏重至大发生外，在江淮及黄 淮地区的苏、皖、豫等省的麦区也偏重发生，8 0 年代中期以后自粉病继续向我国北方黄淮麦区发 展，病害逐年加重，范围不断扩大。到1 9 9 0 1 9 9 1 年白粉病全国大流行时，发生范围不仅遍及黄 淮、江淮等主要产麦区，而且界限进一步北移，波及到辽宁、吉林、黑龙江等省的春麦区，分别 1 中同农业科学院硕 ：论文 第一幸引言 造成小麦减产达1 4 3 8 亿和7 7 亿公斤，并因此成为我国小麦生产上最重要的常发病害之一( 刘 万才，1 9 9 5 ) 。近几年来，虽然由于气候等因素不利，病害发生程度有所下降，但无论是面积， 还是程度都维持在一个较高的水平。2 0 0 0 年至2 0 0 5 年小麦白粉病发病面积分别为6 0 0 万、6 4 2 万、6 7 0 万、6 6 0 多万、5 9 0 万和6 9 0 9 万公顷( 病虫害防治绿皮书，2 0 0 1 2 0 0 6 ) ，因此我国小麦 白粉病防治的形势依然十分严峻。 1 1 2 小麦白粉病的防治 抗病品种的选育和使用是防治农作物病虫害最经济有效的措施。到目前为止，已经有5 0 多 个抗小麦白粉菌的基因被鉴定出来( h u a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；z h ue ta 1 ，2 0 0 5 ；m i r a n d ae ta 1 ，2 0 0 7 ) ，其 中有一部分抗病基因已经被转到栽培品种中并取得了良好的抗病效果。由于单一抗病品种的大面 积种植会对病原菌群体产生定向选择，使品种在3 , - 5 年中“损失”抗性，因此抗病品种使用过 程中需要注意避免抗源的单一化，要因地制宜选用包括地方品种在内的各种来源的抗病品种，合 理的布局、轮换使用，减缓菌株毒性的产生，延长抗病品种的使用年限。 因此，对小麦自粉菌及小麦相互作用的研究具有重要的意义，而对病原菌遗传连锁图谱的构 建则是对病原菌研究的基础。 1 2 植物病原真菌遗传连锁图谱的构建 通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁 的遗传标记之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩( c m ) 来表示。构建遗传图谱现 已成为研究生物传统遗传学、群体遗传学及分子遗传学的基础。从上世纪8 0 年代人们便开始了 植物病原真菌遗传连锁图谱的构建t 作，目前已有包括小麦白粉菌在内的1 2 种植物病原真菌构 建了遗传连锁图谱。 1 2 1 植物病原真菌遗传连锁图谱的构建 稻瘟菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 是研究比较深入的植物病原真菌。n a g a k u b o 等于1 9 8 3 年便初步 构建了该茵的遗传图谱( n a g a k u b oe ta 1 ，1 9 8 3 ) 。其后，随着研究的不断深入，稻瘟菌遗传图谱 不断丰富，稻瘟菌全序列也已在2 0 0 5 年公布( d e a ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。目前，最新的稻瘟菌遗传图谱中 已包括6 个无毒基冈位点在内的2 6 2 个标记位点。 稻恶苗病菌( g i b b e r e l l a 历伽l 蚴，册括) 可以引起玉米恶苗病，其遗传图谱的构建中除包括一些常 见的分子标记外也包括水稻恶苗病菌自身独有的一些基因位点，如雌性不育位点( s t e l ) 、孢子致死 位点( s k ) 和控制产生串珠镰刀菌毒素的位点( r u m l ) ，共6 3 4 个位点。这些特殊位点在遗传图谱中 的定位为今后的克隆及功能研究奠定了基础( p u h a l l ae t a l ，1 9 8 3 ；x ue t a l ，1 9 9 6 ) 。 麦类赤霉病菌( g i b b e r e l l az e a e ) ，到目前为止已构建了两个麦类赤霉病菌的遗传图谱 2 中国农业科学院硕l ：论文第章引言 o u r g e n s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ；g a l ee ta 1 ，2 0 0 5 ) ，且二者的连锁群数相同，遗传图谱的长度也相似。没有 出现其它真菌构建遗传图谱时不同图谱之间存在的连锁群数及图谱长度存在较大差异的现象。因 此所构建出的遗传图谱具有较高的可信度。构建的图谱中有包括a f l p 标记在内的共计2 3 5 个位 点。 致病疫霉病菌( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ) ，v a nd e rl e e 等继1 9 9 7 年构建第一个致病疫霉遗传 图谱后又分别于2 0 0 1 年和2 0 0 4 年对此遗传图谱进行完善，完成了6 个无毒基因的定位及连锁群 的重新划分，最新的遗传图谱中包括5 0 8 个标记位点，其中有6 个无毒基因位点( v a nd e rl e ee t 口， 1 9 9 7 ，2 0 0 1 ，2 0 0 4 ) 。 大豆疫霉病菌( p h y t o p h t h o r as o j a e ) ，2 0 0 2 年m a y 等构建了大豆疫霉菌的遗传图谱，其中共有 3 8 6 个位点，是包括1 0 个无毒基因位点的较为饱和的遗传图谱，通过该图谱所提供的信息可以对 某些无毒基因进行克隆( w h i s s o ne ta 1 ，1 9 9 5 ；m a ye ta 1 2 0 0 2 ) 。 莴苣霜霉病菌( b r e m i al a c t u c a e ) ，2 0 0 3 年s i c a r d 等构建了第二个莴苣霜霉菌遗传图谱。该图 谱由8 3 个r f l p 标记、3 4 7 个a f l p 标记组成，其中7 个无毒基冈位点连锁子3 6 个连锁群中； 获得2 个与a v r 4 ，1 个与a v r 7 紧密连锁的标记( s i c a r de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 油菜黑胫病菌( l e p t o s p h a e r i am a c u l a n s ) ，2 0 0 0 年c o z i j n s e n 等在p o r g a m 等研究的基础上构建 了油菜黑胫病菌高密度的遗传图谱。该图谱共2 1 个连锁群，包括1 5 5 个a f l p 标记、3 个r a p d 标记、1 个交配型位点和1 个寄主特异性位点( 决定病斑的形成) 。其中交配型位点与1 个a f i j 标记定位在遗传图谱的同一位置，这意味着这个a f l p 标记是交配犁位点基冈片段的一个组成部 份( p o r g a me ta 1 ，1 9 9 8 ；c o z i j n s e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 玉米小斑病菌( c o c h l i o b o l u sh e t e r o s t r o p h u s ) ，1 9 9 2 年t z e n g 等利用r f l p 标记技术构建了玉米 小斑菌的遗传图谱( t z e n g e t a l ，1 9 9 2 ) 。通过脉冲场凝胶电泳及与特定探针的杂交，将1 2 5 个r f l p 标记分配到特定的染色体上，其中1 2 0 个r f l p 标记的连锁关系已被证实，6 个r f l p 标记与t o x l 基因紧密连锁，构建的连锁群中有1 4 个长度大于4 0 c m 的缺口。根据创建 勺图谱推算玉米小斑菌 基因组全长在3 5 m b 左右，现构建的图谱将近覆盖基因组全长的6 3 。 小麦根腐病菌( c o c h l i o b o l u ss a t i v u s ) ，2 0 0 2 年z h o n g 等建立了小麦根腐菌的遗传图谱。该图 谱共2 7 个连锁群( z h o n ge t a l ，2 0 0 2 ) ，包括9 7 个a f l p 标记、3 1 个r f l p 标记、2 个由p c r 扩增 所得的标记、1 个交配型位点和1 个毒性基i 习( v h v l ) 。v h v l 与6 个a hp 标记共分离。利用r f l p 及a f l p 标记作为探针通过钳位均匀电场电泳将2 7 个连锁群中的2 5 个划分到特定的染色体中。 小麦叶斑病菌( m y c o s p h a e r e l l ag r a m i n i c o l a ) ，2 0 0 2 年k e m a 等已得到一个较为饱和的遗传图 谱( k e m a e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，其中包括1 个无毒基因位点在内的2 8 2 个标记位点。与其它图谱不同的是 该菌的遗传图谱中存在很多成簇的a f l p 标记，这些成簇标记的存在使人们很难利用构建的图谱 来估算小麦叶斑菌基因组的大小。 1 2 2 大、小麦白粉菌遗传连锁图谱的构建 1 2 2 1 大麦自粉病菌( b l u m e r i ag r a m i n i sf s p h o r d e t 0 遗传连锁图谱的构建 1 9 9 0 年，c h r i s r i a n s e n 等初步构建了大麦白粉菌的遗传图谱( c h r i s r i a n s e ne ta 1 ，1 9 9 0 ) 。3 1 3 中国农、i k 科学院硕卜论文 第一章引言 个r f l p 标记与5 个毒性位点被连锁于7 个连锁群中。与毒性位点最近的r f l p 标记距离9c m 。 1 9 9 4 年，b r o w n 等利用e 9 探针( 大麦白粉菌基因组d n a 中一段4k b 长的片段) 构建了大麦白 粉菌的遗传图谱( b r o w ne t a l ，1 9 9 4 ) 。获得了7 个连锁群，共2 2 个标记位点。 1 9 9 9 年b r o w n 等在第一届国际白粉病大会上公布其进一步构建的大麦白粉菌的遗传连锁图谱 ( b r o w n e t a l ，1 9 9 9 ) 。该图谱由8 个无毒基因、1 个抗杀菌剂基因e t h l 、1 个交配型基因m a t l 与 3 5 0 个a f l p 标记构成，共1 2 个连锁群，总长为1 2 0 5c m ；采用b s a 法获得与a v r 。1 2 连锁的标 记，a v r a l 2 位于连锁群的末端，与其最近的标记距离1 4c m ，这个结果表明a v r 。1 2 处于一个高重组 区域；发现了a v r 。9 与a v r a 2 2 相距6 c m ，获得了1 个距a v r 。9 2 c m 和2 个距a v r 。9 与a v r a 2 2 均为1c m 的标记；p 1 1 m 4 8 3 6 5a f l p 标记紧密连锁于a v r a 2 2 。 2 0 0 2 年p e d e r s e n 等构建了一个内容较丰富的大麦白粉菌遗传连锁图谱( p e d e r s e ne t 口l ，2 0 0 2 ) 。 该图谱有连锁群3 4 个，总长2 1 1 4c m ；包括1 8 2 个a f l p 标记、1 6 8 个r f l p 标记( 包含4 2 个反 转录转座子位点，9 9 个e s t 序列，6 3 个r e p e a l ，1 个交配型位点) 、7 个无毒基因位点和1 个s n p 位点；在7 个无毒基因位点中，a v r 。l o 、a v r 。恐、a v r a k l 紧密连锁，并定位在3 4 号连锁群中；a v r 。2 、 a v r a 3 紧密连锁，定位在2 9 号连锁群中；加a 6 、a v r a 7 也分别位于第1 5 和第2 5 连锁群中；在无毒 基因与分子标记之间位于1 5 号连锁群的a v r a 6 与2 个a f l p 标记和1 个e s t 标记共分离，这有利 于a v r 。6 进行图位克隆。 。 从后两个遗传图谱看，大麦白粉菌的遗传连锁图谱还需要很好的完善。 1 2 2 2 小麦白粉病菌( b l u m e r i ag r a m i n i sf s p 翮把o 遗传连锁图谱的构建 小麦白粉菌与大麦白粉菌是同种不同专化型的植物专性寄生病原真菌。构建小麦白粉菌遗传 连锁图谱，对其遗传研究具有重要意义，同时为进一步基因定位，特别是无毒基因定位及克隆奠 定了基础。目前国外尚未有小麦白粉菌遗传图谱构建的报道，而国内对小麦白粉菌遗传图谱构建 工作处于起步阶段。 2 0 0 4 年李志英在遗传分析的基础上利用a f l p 标记技术初步构建了小麦白粉菌的遗传连锁图 谱。该图谱共2 2 个位点，连锁于7 个连锁群中，总长1 7 3 4c m ，平均距离为7 9c m ，均为a f l p 标记。同时获得一个与白化性状相连锁的标记，其遗传距离为2 8 2c m 。 2 0 0 6 年梅丽宏构建了一个小麦白粉菌遗传连锁图谱，有1 7 个a f l p 位点，连锁于5 个连锁 群中，图谱总长1 2 5c m ，标记间平均距离7 3 5c m 。 这两个获得的遗传连锁图谱由于饱和度不够，因此小麦白粉菌遗传连锁图谱构建工作亟待完 善，为今后开展更深入的工作奠定基础。 构建遗传连锁图谱已成为克隆基因与研究基因功能的有力工具，并为今后真菌基因组学的研 究奠定了基础。通过建立的植物病原真菌遗传连锁图谱，我们可以更深入地获知相应的目标基因 的结构及功能，这有利于我们了解病原菌与植物之间的互作，同时也有利于加深对植物抗病性的 认识，为植物病害的防治提供新的理论基础。 1 3 遗传连锁图谱的构建方法 遗传连锁图谱构建主要包括以下几个方面：选择建立适合的作图群体；选择适合的分析方法， 4 中同农、也科学院硕十论文 第章引言 如分子标记等；确立连锁群；基因排序及遗传距离的确定等。 1 3 1 作图群体的选择 1 3 1 1 亲本的选择 遗传连锁图谱构建的理论基础是染色体片段的交换与重组。因此，亲本的选择是至关重要的， 一般用于构建图谱的植物材料亲本选择包括：第一，选择亲本的多态性高，亲缘关系远的材料； 第二，选择亲本要选择纯度高的材料，并进一步纯化；第三，考虑杂交后代的可育性；第四，选 配亲本时还应对亲本及杂种进行细胞学鉴定等等。而对真菌遗传图谱的构建而言，真菌亲本的选 择与植物亲本选择的方法有所不同。真菌在形态学上的差异很多都不是用肉眼所能观察到的，因 此要借助一些生物学和遗传学实验来寻找亲本差异，如毒性、交配型等等。总之，一定要选择亲 缘关系远且多态性高的材料作亲本。 1 3 1 2 作图群体类型 用于遗传作图的群体类型有多种，各种不同类型的分离群体有其各自的优缺点，要具体情况 具体分析。 f 2 群体：此群体是比较常用的作图群体，目前大多数的植物标记图谱构建群体是f 2 群体。 因为f 2 群体的建立比较容易，所需时间不长，遗传信息丰富，而且可以计算出显性效应( t a n k s l e y , 1 9 9 4 ) 。而f 2 群体最大的缺点就是不易长期保存，自交一代群体的遗传结构就会发生变化，无法 满足不同实验对同一材料研究的需要。 b c ，群体：回交一代群体也是较常用的作图群体。b c ，群体每个分离的基因座只有两种基因 型，它直接反应了f 1 代配子的分离比例，因而此群体作图效率高。b c l 群体还可用来检验雄、 雌配子在基因间的重组率上是否存在差异。b c ，群体的缺点与f 2 群体相同，都不能长期保存。另 外，对于一些人工杂交比较困难的植物，b c l 群体也不太适合，一是因为难以建立较大的b c l 群 体，二是容易出现假杂种，造成作图误差。 r i l 群体：重组自交系群体是杂种连续自交不施加选择直到纯合所产生的群体。因此群体是 是可以长期使用的永久性分离群体，可满足不同时间、不同地点、不同实验研究的需要，特别适 合数量性状基因座的定位研究，而且可以比较准确地鉴定其每个系的表型值，减少环境误差。但 群体构建时间长、工作量大，一般应用较少。 d h 群体：双单倍体群体是通过花药培养或其它途径得到的单倍体材料加倍而形成的群体。 d h 群体植株是纯合的，自交后即产生纯系，因此群体可以稳定繁殖，长期使用，是一种永久性 分离群体。因为此群体的遗传结构直接反映了配子中基因的分离和重组，因此d h 群体与b c l 群 体一样，作图效率是较高的。但是，获得d h 群体植株有赖于花药培养技术，一些植物花药培养 较难，无法通过花药培养来建立群体。另外，植物的花药培养能力跟基因型关系较大，因而花药 培养过程会对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏群体的遗传结构，造成较严重的偏分离 现象，影响遗传图谱的准确性。 h a p 群体：单倍体群体是多数真菌类生物在其有性生殖产生f 1 代子囊孢子，经无性繁殖产 生的分生孢子单孢菌株所构成的单倍体群体。此群体与d h 群体相似，但它为单倍体群体。 5 中国农业科学院硕i 。论文第一章引言 本实验所构建的小麦白粉菌群体即为h a p 群体。 1 3 2 遗传图谱的绘制 1 3 2 1d n a 分子标记方法 遗传标记( g e n e t i cm a r k e r s ) 是研究生物遗传变异规律及其物质基础的手段。其方法主要有 四种类型，即形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 、细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 、生化标记 ( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 和分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r s ) 。近1 0 年来，在人类基因组研究计划 ( h u m a ng e n m o ep r o j e c t ，简称h g p ) 的推动下，分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。下 面为几种常用的d n a 分子标记技术比较： 6 中圈农业科学院硕十论文 第一章弓f言 表1 1 几种常用d n a 分子标记技术比较 t a b l e1 1 c o m p a r i s o no f s e v e r a ld n a m o l e c u l a rm a r k e r s 除了以上的分子标记技术外，还包括m r n a 差别显示( m r n a d i f f e r e n t i a l d i s p l a y , m r n a d d ) 、 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ，e s t s ) 、抑制消减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ， s s h ) 、顺序表达位点扩增( s e q u e n c e dc h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s ，s c a r s ) 、序列标签位点 ( s e q u e n c e t a g g e ds i t e ，s t s ) 等等。 决定一个标记的利用价值取决于两个方面，一是标记信息的容量，另一个是多态性比例。许 占友等( 2 0 0 0 ) 对r f l p 、r a p d 、s s r 和a f l p 等四种标记技术进行了比较分析，综合考虑了遗 传稳定性和标记的系统机制( 速度、费用、可靠性等) ，得出结论：a f l p 具有最高的e m r ( e f f e c t i v e m u l t i p l e xr a t i o 是指单位实验里能同时检测到的位点数) ，s s r 具有最高的d i ( d i v e r s i t yi n d e x 是指 信息含量即期望异质性1 。p o w e u 等( 1 9 9 6 ) 利用大麦的r f l p 、a f i p 、s s r 和r a p d 标记进行 比较，也表明a f l p 是唯一多态性比例最高的分子标记。1 9 9 5 年在加拿大召开的园艺学会上，专 家一致认为当今四大标记系统综合效用大小应该是a f l ，p s s r 鼬廿d r f l p 。 以上各种类型的遗传标记方法有其各自的优缺点，在特定的领域中都有不可替代的作用。但 总体来看，理想的分子标记应具备以下几条主要标准：具有较强的多态性；表现为共显性，能够 鉴别出纯合基因型或杂合基因型；遍布整个基因组，分布均匀；试验程序易自动化，检测手段简 单、快速，成本较低；结果重复性好，便于数据交换。 本实验采用a f l p 分子标记技术来构建小麦白粉菌的遗传连锁图谱。 1 3 2 2 遗传连锁图的绘制 数据统计及转换：利用分子标记的方法获得的均为电泳条带图，通过统计将谱带图进行数值 化处理。如真菌群体的a f l p 标记，根据带型中一些特征条带的存在或缺失来比较，带型的差异 7 中困农业科学院硕t 论文第一章引言 曼鼍曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼皇! 鼍曼量曼曼ii i i i 一i i _,：-量 是实验菌株之间遗传距离的直接反映；一般将来源于亲本a 的带型记为a ，来源于亲本b 的带型 记为b ，缺失或模糊带型记为0 或“”，此统计数据即为进行连锁分析的基本数据。 遗传连锁图的构建：同经典图谱一样，即根据自由组合规律和连锁遗传的两点、三点和多点 测验为基础，建立作图函数，编制电子计算程序，计算各标记问的遗传图距，构建分子连锁图谱。 目前有多种作图软件可供选择，如m a p m a k e r ，j o i n m a p ，m a p ，c p r o p 等。其中m a p m a k e r 是目 前应用最广泛的作图软件之一，本实验主要利用此软件计算确定标记间遗传距离，同时结合 j o i n m a p 的结果比较作图，获得遗传连锁图谱。 1 4 植物病原真菌无毒基因的克隆 无毒基因是病原物遗传因子，其编码的产物激发病原物与植物特异性相互作用。病原物无毒 基因与植物抗病基因产物间直接或间接相互作用才会引起植物的抗病反应，因此无毒基因的研究 对寄主的抗病性研究具有重要作用，为抗病育种工作提供依据。而遗传图谱的构建其中一个主要 的作用就是为了能找到与无毒基因或是其他功能基因紧密连锁的标记，进而克隆目的基因。 到目前为止只克隆到少数几种病原真菌的部分无毒基因，以下为部分已克隆到的无毒基因。 、 1 4 1 番茄叶霉菌 番茄叶霉病是由叶霉菌( c l a d o s p o r i u mf u & u m ) 侵染而引起的真菌性病害。目前，对叶霉菌的 无毒基因与抗性基因的研究也比较深入。对感染叶霉菌的番茄叶片质外体的分析，发现病菌繁殖 过程中至少分泌4 种生理小种特异无毒蛋白a v r 9 ( v a nd e na c k e r v e k e ne ta 1 ，1 9 9 2 ) 、a v r 4 ( j o o s t e ne ta 1 ，1 9 9 4 ；v a nd e nb u r ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 、a v r 2 ( l u d e r e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 、a v r 4 e ( j o o s t e n a n dd ew i t ，1 9 9 9 ) 和4 种胞外蛋白e c p l ( v a nd e na c k e r v e k e ne t a l ，1 9 9 3 ；l a u g ee t 口是，1 9 9 7 ) 、e c p 2 ( v a nd e na c k e r v e k e ne ta 1 ，1 9 9 3 ；l a u g ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 、e c p 4 ( l a u g ee t a l ，2 0 0 0 ) 和e c p 5 ( l a u g e e t a l ，2 0 0 0 ) 。 1 4 2 水稻稻瘟病菌