（食品科学专业论文）提高郫县豆瓣氨基态氮含量关键技术的研究.pdf

i - 。一 illiflfli i l i ft i i i f l l lr l l l r f f l l 17 5 0 5 2 0 西华大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 蓄簧端茗芎谚锣日期：歹d 矿2 7 夕 西华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，西 华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。( 保密的论文在解 密后遵守此规定) k ， ， 一 ， - ， 提高郫县豆瓣氨基态氮含量关键技术的研究 摘要 本课题采用传统工艺在实验室条件下对影响郫县豆瓣制曲过程的因素进行了研究 分析，对影响米曲霉生长过程中各因素温度，时间，曲精量进行了严格控制，以获得一 种最优的制曲工艺条件；然后在获得最佳制曲条件的基础上，加入各种激活剂，考察对 米曲霉产酶的影响；之后对郫县豆瓣的蛋白质水解过程的影响因素进行了研究，确定了 水解过程的最佳作用条件。本课题的目的在于不改变郫县豆瓣的原有风味上，对提高郫 县豆瓣氨基态氮含量的关键技术进行研究，以提高目前行业内的整体水平。以下是本课 题研究的相关内容和结果。 ( 1 ) 制曲工艺试验探索：根据米曲霉的生长条件和制曲的原理，对影响米曲霉生长 的主要因素温度，时间，曲精量进行了单因素分析，并在此基础上进行响应面实验，以 酶活为指标：最后以米曲霉的酶活指标来确定最优制曲方案，最终确定了制曲的最佳工 艺条件为：制曲时间9 4 8 h ，制曲温度3 3 7 8 ，加曲量0 2 5 8g 1 0 0 0 9 胡豆。 ( 2 ) 考察添加微量元素、激活剂、植酸对米曲霉产酶的影响：在获得最佳制曲条件 的基础上，加入z n s 0 4 ，k h ：p 0 , ，c u s o , ，c a c i ：，f e s 0 4 ，m g s 0 4 ，m n s 0 , 等微量元素的混合 溶液进行了分析；分别考察激活剂：6 一苄氨基嘌呤，激动素，玉米素，吲哚乙酸在单独 或配比使用下对产酶的影响；在添加植酸的条件下的效果，以酶活为指标。结果显示微 量元素对米曲霉产生蛋白酶有起到促进作用；在使用激活剂的条件下有一定影响，特别 当单独使用激动素和吲哚乙酸，产酶量得到显著提高；而植酸的加入量在0 0 6 - - 0 1 4 时，对米曲霉产生蛋白酶的作用效果较好。 ( 3 ) 豆瓣的最佳水解条件的探索：通过考察米曲霉蛋白酶的最佳初始p h 、作用温度 和时间这3 个因素对蛋白质水解产生氨基酸态氮的影响，先以氨基酸态氮含量为指标初 步探索发酵工艺条件，然后通过响应面法分析，并再次以氨基酸态氮为指标确定水解的 最佳工艺条件，初始p h 5 7 6 ，发酵温度4 8 6 5 ，发酵时间1 4 1 6 h 。得到的郫县豆瓣中 氨基酸态氮含量达到氨基氮含量平均值为1 9 4 9 1 0 0 9 豆瓣。 关键词：郫县豆瓣、米曲霉、酶活、氨基氮 i - 一一 西华大学硕士学位论文 a b s t r a c t 1 h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so ft h ep i 。x i a ns o y b e a np a s t e s t a r t e rp r o p a g a t i o np r o c e s sw e r e s t u d i e da n da n a l y z e di nl a b o r a t o r yc o n d i t i o n sb yu s i n gt h et r a d i t i o n a lt e c h n i q u ei nt h i sp a p e r t h ei n f l u e n c eo fa s p e r g i l l u so r y z a e g r o w t hf a c t o r s ，s u c ha st e m p e r a t u r e ，t i m e ，l e a v e n a d d i t i o n ，w e r es t r i c t l yc o n t r o l l e di no r d e rt oo b t a i nak i n d so fo p t i m a lc o n d i t i o n so fs t a r t e r p r o p a g a t i o np r o c e s s ：t h e na d d i n gav a r i e t yo fa c t i v a t i n ga g e n t s ，t h ee n z y m ep r o d u c t i o no f a s p e r g i l l u so r y z a ew e r ei n v e s t i g a t e do nt h eb a s i so ft h ec o n d i t i o n s o ft h eb e s ts t a r t e r p r o p a g a t i o np r o c e s s ；t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so fp i x i a ns o y b e a np a s t e p r o t e i nh y d r o l y s i s p r o c e s sw e r es t u d i e dt od e t e r m i n et h eb e s to fh y d r o l y s i sr o l ec o n d i t i o n s n ep u r p o s eo ft h i s s u b j e c td o e sn o tc h a n g et h eo r i g i n a lf l a v o ro fp i x i a ns o y b e a np a s t e ，i m p r o v i n gt h ea m i n o n i t r o g e nb yt h ek e yt e c h n o l o g yr e s e a r c h ，t h e ni m p r o v i n gt h eo v e r a l ll e v e lo ft h ec u r r e n t i n d u s t r y t h ef o l l o w i n ga r et h es u b j e c t r e l a t e dc o n t e n t sa n dr e s u l t so fs t u d y ： ( 1 ) t e c h n o l o g i c a le x p l o r a t i o no fs t a r t e rp r o p a g a t i o np r o c e s s ：a c c o r d i n gt ot h eg r o w t ho f a s p e r g i l l u so r y z a ec o n d i t i o n sa n dt h ep r i n c i p l eo fs t a r t e rp r o p a g a t i o n ，t h em a i nf a c t o r s o fi m p a c to i la s p e r # l l u so r y z a eg r o w t hs u c ha st e m p e r a t u r e ，t i m e ，a d d i t i v ea m o u n to f l e a v e nw e r et ot h es i n g l ef a c t o rp r e c i s i o na n a l y s i s ，a n dt or e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s b a s e do ne n z y m ea c t i v i t y ；f i n a l l y , t od e t e r m i n et h eb e s tp r o g r a mt of i n a l i z et h e o p t i m a l c o n d i t i o n sf o rs t a r t e rp r o p a g a t i o np r o c e s sw i t ht h eb e s ta c t i v i t yo fa s p e r g i l l u s o r y z a e e n z y m ea c t i v i t y ：s t a r t e rt i m e9 4 8 h ，s t a r t e rt e m p e r a t u r eo f3 3 7 8 ，p l u sv o l u m e 0 2 5 8g l o o o gs t r i c t o s i d i n e ( 2 ) ( 3 ) i n v e s t i g a t i n gt h ee f f e c to fe n z y m ep r o d u c t i o no fa s p e r g i l l u so r y z a eb ya d d i n gt h e t r a c ee l e m e n t s ，a c t i v ea g e n t ，p h y t i ca c i d ：o nt h eb a s i so ft h eb e s ts t a r t e rc o n d i t i o n s ， a d d i n gz n s 0 4 ，k h 2 p 0 4 ，c u s 0 4 ，c a c l 2 ，f e s 0 4 ，m g s 0 4 ，m n s 0 4a n dl i k e n e s s ； a c t i v a t o rw e r ei n v e s t i g a t e d ：t h ei m p a c to f 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e ，k i n e t i n ，z e a t i n ， i n d o l ea c e t i ca c i di np r o p o r t i o nt ou s eo ra l o n eo ne n z y m ep r o d u c t i o n ；t h ee f f e c to f a d d i n gp h y t i ca c i dc o n d i t i o n st ot h es p e c i f i ca c t i v i t y n er e s u l t ss h o w e dt h a tt r a c e e l e m e n t sh a v ep l a y e dac a t a l y t i cr o l ei nt h ea s p e r g i l l u so r y z a e e n z y m ep r o d u c t i o n ； t h e r ea r ec e r t a i ni n f l u e n c eu n d e rt h ec o n d i t i o n so ft h ea c t i v a t o r s ，e s p e c i a l l yw h e nu s e d a l o n ek i n e t i na n di n d o l ea c e t i c a c i d ，p r o d u c i n gam a r k e di n c r e a s eo fe n z y m e p r o d u c t i o n ；w h i l et h eq u a n t i t yo fp h y t i ca c i di n0 0 6 0 1 4 ，t h er o l eo fa s p e r g i l l u s o r y z a e e n z y m ep r o d u c e di sb e t t e rr e s u l t s e x p l o r a t i o no fo p t i m a lc o n d i t i o n so na s p e r g i l l u so r y z a e p r o t e i ne n z y m eo fp i x i a n s o y b e a np a s t e ：f i r s tt h ei n i t i a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ee x p l o r e dw i t ht h e i n d i c a t o ro fa m i n o n i t r o g e nc o n t e n tb yt e s t i n gt h ei m p a c to ft h e s et h r e ef a c t o r s ，t h eb e s t i n i t i a lp h ，r e a c t i o n a lt e m p e r a t u r ea n dt i m e ，o nt h ep r o t e i n h y d r o l y s i s ；t h e nd or e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i st od e t e r m i n et h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fh y d r o l y s i sb yu s i n ga m i n o n i t r o g e na sa ni n d e xa g a i n ：t h ei n i t i a lp h 5 7 6 ，f e r m e n t a t i o n a lt e m p e r a t u r e4 8 6 5 f e r m e n t a t i o n a lt i m e1 4 1 6 h n ea m i n on i t r o g e nc o n t e n to fp i x i a n s o y b e a np a s t e 。 一一 提高郫县豆瓣氨基态氮含量关键技术的研究 二二二= 二 ： r e a c h e s1 9 4 9 1 0 0 9o na v e r a g e k e y w o r d s ：p i x i a ns o y b e a np a s t e ，a s p e r g i l l u so r y z a e , e n z y m ea c t i v i t y , a m i n o n i t r o g e n 西华大学硕士学位论文 目录 第一章引言j 1 1 1 郫县豆瓣一1 1 2 米曲霉的特性与应用3 1 3 氨基酸态氮概述3 1 4 本课题研究的内容、目的意义、创新点。4 第二章最佳制曲工艺试验探索6 2 1 材料与设备6 2 2 方法7 2 3 实验结果厶。1 0 2 4 本章结论_ 1 9 第三章考察无机元素、激活剂和植酸对米曲霉产酶活力的影响2 0 3 1 材料与设备2 0 3 2 方法2 1 3 3 实验结果2 2 3 4 结论2 6 第四章豆瓣中蛋白质最佳水解工艺的探索2 8 4 1 材料与设备2 8 4 2 实验方法。2 8 4 3 实验结果3 1 4 4 结论4 0 第五章其它影响因素考察_ 4 l 结论4 3 参考文献。j ：4 5 攻读硕士学位期间学术论文及科研情况4 9 蜀c 谢。5 0 w 西华大学硕士学位论文 第一章引言 郫县豆瓣是具有二百余年悠久历史的调味食品，可直接佐餐，亦是川菜烹调中必不 可少的调味品。它以色泽油润红亮，酱酯香浓郁，味鲜辣醇和，体态粘稠绒实等特点著 称。其生产过程中不添加任何香辛料，色泽油润却没有加入一滴油脂，全靠酿造过程中 精细独特的传统工艺。它可用来烹调著名的川菜，如麻婆豆腐、回锅肉、红烧鲤鱼，还 是四川火锅底料必须之主料，它不仅可以增色提味，而且是别有风味，是真正意义上的 “川菜之魂”【1 1 。 “郫县豆瓣 作为四川的地方名产，饮誉海内外，它的生产自有一套独特之处，其 生产过程中自成的微生物区系也较为独特，而这种多菌的微生物区系的小生态形成亦经 过了较长时间，独特的微生物群的共同作用对于“郫县豆瓣的生产起着十分重要的作 用，由此形成了“郫县豆瓣 的独特外观品质和内在的风味。 1 1 郫县豆瓣 1 1 1 郫县豆瓣的来源及现状 相传明末清初，一移民在入蜀途中，其赖以充饥之蚕豆遇连日阴雨而霉生。不忍弃， 遂置于田埂晾干就以鲜辣椒拌和而食，竞鲜美无比，余味悠长，其后竟以此为生。此概 为郫县豆瓣之最初起源1 2 1 。郫县地处成都平原中部，因得都江堰灌溉之利，盛产稻、小 麦、油菜籽、胡豆( 蚕豆) 、大麻等。这里的胡豆品质优良，以它作为主要原料加工制 成的豆瓣酱，油润红亮，瓣子酥脆，有较重的辣味，香甜可口，除用作调味外，也可单 独佐饭；用熟油拌，其味其佳。郫县豆瓣产于中国四川省成都市郫县的唐昌、郫筒、犀 浦等十九个乡镇，已有3 0 0 年历史。郫县境内1 0 0 多家豆瓣企业取得了使用“郫县豆瓣” 证明商标资格。“郫县豆瓣 产业已成为郫县食品工业的支柱，2 0 0 5 年销售额达8 亿元， 产品远销全国及美国、日本、加拿大等国。 1 1 2 郫县豆瓣的制备方法及原理 原料包括鲜红辣椒、蚕豆、食用盐、面粉等。制作方法蚕豆经脱壳，浸泡，接种， 制曲，撒盐水等工序后，加入辣椒再入池发酵；然后经过消毒，与各种辅料按比例进行 配制，方为成品豆瓣瞥3 1 。 如图1 1 所示： 西华大学硕士学位论文 在豆瓣生产过程主要是利用米曲霉分解蛋白质的能力，将原料中的蛋白质转化为氨 基酸态氮，因此，原料分解过程很大程度上决定于酶活力的高低。传统的豆瓣工艺采用 的是自然接种的方式生产米曲霉，所制得的米曲质量难以保证，且也不利于优良菌种的 代代相传。近几年来出现的多菌种混合接种制曲，由于不同微生物的最佳生长条件和产 酶条件不同，因此制曲条件很难控制。因而目前市面所销售的豆瓣酱质量都停留在一个 较低的水平，其质量特征指标氨基氮含量偏低。 1 1 3 郫县豆瓣的作用 ，分外提色增香，是郫县最著名的特产，是烹调川菜的必备调料， 之魂”。特别是郫县豆瓣烹制的“回锅肉 、“豆瓣鱼 、“麻婆豆 具有浓郁的四川风味，被公认为是川菜家常昧中的代表 在制作川菜的时候，没有豆瓣制作的川菜就不是正宗的川菜，无 味道方面，都将受到影响。其色泽红亮滋润辣味浓厚；郫县豆瓣 调味料，用在汤卤中能增加鲜味和香味使汤汁具有温醇味和浓稠 能外，还具有营养。调节人体生理活动和食疗保健功效。调节酸 由于豆瓣酱中含有钾、锌等多种矿物质元素，这些矿物元素在体 ，能防止血液向酸性方面转化，达到调节酸碱平衡的目的。豆瓣 内与钙质合成，增加钙质的吸收，提高机体的免疫力。豆瓣中含 2 西华大学硕士学位论文 有丰富的维生素c ，能在体内形成一种活性很强的抗氧化剂，防止细胞癌变和细胞衰老。 维生素c 还能阻止致癌物亚硝胺在体内的合成，并促使其分解，使亚硝胺在体内含量下 降，保护机体免受损害，防止胃癌，肠癌等绝症的发生。豆瓣中含有可促进心血管扩张、 产生降压效果的黄酮成分，对高血压、动脉硬化、脑血栓等多种疾病具有防治作用。经 常摄取豆瓣酱可使得葡萄糖在胃内滞留时间延长，因此使得餐后血糖峰值出现的时间推 迟，血中胰岛素分泌量减少，有效地缓和了进食后血糖的急剧变化，从而起到抑制血糖 值升高的作用。另外个人的消化与吸收功能直接关系到其健康水平，而豆瓣能促进人体 对食物中钙、磷等营养物质的吸收，所含有的氨基酸能刺激大脑的食欲中枢，促进消化 液的分泌，提高胃液浓度，健胃消食，增进食欲。豆瓣还有益气健脾、利湿消肿之功， 同时它还含有大脑和神经组织的重要组成成分磷脂，并含有丰富的胆碱，有健脑作用， 可增强记忆力。此外，豆瓣酱也是抗癌食品之一，是降低前列腺增生症及肠癌发病率的 食疗佳品。 1 2 米曲霉的特性与应用 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 属于丝状真菌中的半知菌亚门，为丝孢纲、丝孢目、丛梗孢 科、黄曲霉属，属于需氧型丝状真菌，察氏培养基上，菌落形成较快，培养1 0 天后， 直径可达5 6 厘米，质地疏松，中央呈现絮状，初为白色、黄色，继而变为黄褐色至 淡绿褐色，反面无色。米曲霉最适生长水分为3 4 4 5 ，生长最适温度为3 2 - 3 5 ，生 长p h 6 5 6 8 ，产酶温度2 8 3 4 c 1 4 j 【引。；米曲霉也是美国f d a 公布的4 0 余种安全微生 物菌种之_ _ 1 6 1 ， 因此被广泛地应用于食品、医药及饲料等工业。 米曲霉是酿造业中的重要微生物，在其生长过程中能分泌多种酶系，其中较重要的是 蛋白酶，可将豆类中的蛋白质降解成多肽、氨基酸等可溶性氮物，对酱油、豆瓣、米酒 等的产率和风味起着重要作用；然而现在工业用米曲霉菌株蛋白酶活性高的往往生长速 度慢；而生长速度快的菌株往往蛋白酶活性低，这就大大降低了生产效率，难以形成规 模化生产线。提高米曲霉的蛋白酶活力，可以提高原料的利用率，降低生产周期，降低 成本，这也是利用米曲霉进行生产的企业长期以来的奋斗目标【7 l 。近年来，米曲霉的研 究工作在我国大多集中在菌种的选育、发酵工艺的优化、酶的提取纯化及性质研究：而 在国外，2 0 0 5 年1 2 月2 2 日出版的英国 n a t u r e 杂志上已发表了日本研究人员对米曲霉 基因组的破译结果。米曲霉蛋白酶在食品工业中可用于酱油、食醋、豆酱等食品的酿造， 其用于将米渣蛋白降解成复合氨基酸和肽的方法已获得成功，因此国内外对米曲霉蛋白 酶都有广泛的研究。目前，关于提高米曲霉蛋白酶活性的研究多是从微生物育种这个角 度人手；也有关于改善发酵培养基成分及培养条件以提高米曲霉蛋白酶活力的研究报道 【8 】1 9 】【1 0 1 。 1 3 氨基酸态氮概述 3 西华大学硕士学位论文 大多数郫县豆瓣的生产厂家采用米曲霉作为动力微生物，主要是因为米曲霉产生 的酶系十分丰富。米曲霉的酶系包括蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶、淀粉酶、脂肪酶、果 胶酶、转化酶、纤维素酶及麦芽糖酶等。各种酶系对郫县豆瓣风味的形成有着各自不同 的作用【1 1 1 。 蛋白酶是米曲霉所产酶系中最重要的酶之一，直接影响原料的蛋白利用率和最终产 品的风味【1 2 l ，按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类1 1 3 】。 氨基酸态氨( a 如为蛋白质的分解产物，是评价调味食品的质量及营养价值的一项主 要指标，在发酵性食品的分析中有重要的意义【1 4 】，它能使郫县豆瓣鲜味柔和，并增进 色泽，调和香气，氨基酸态氮从而成为评价郫县豆瓣质量的重要因素之一；其主要来自 原料中蛋白质的水解和微生物自溶。一般来讲，原料中的蛋白质含量高，郫县豆瓣中氨 基酸态氮的含量也高。本实验旨在通过对制曲工艺和米曲霉蛋白酶水解最佳条件的研 究，对豆瓣生产工艺过程进行改进，在不改变原有风味的基础上，寻找出一个提高郫县 豆瓣中氨基酸态氮含量的最佳途径。 1 4 本课题研究的内容、目的意义、创新点 1 4 1 目的与意义 当前我国郫县豆瓣生产厂家的生产还停留在一个比较落后的水平，大都采用传统的作 坊工艺，这就决定了豆瓣生产周期长，原料利用率低，劳动强度高，制曲以及发酵工艺 往往依靠经验判断。这就造成了不仅产量低，而且质量也高低不一，时好时坏，尤其是 氨基酸态氮这个重要的质量指标一直停在一个较低的档次。随着经济发展和人民生活质 量的提高对高品质的豆瓣需求量将不断增加，现在国内郫县豆瓣的市场相当丰富与低豆 瓣产量之间的矛盾；人们对高营养、高质量的郫县豆瓣需求不断膨胀与低质量的郫县豆 瓣的矛盾日夜加剧。因此我国需要在结合我国庞大的豆瓣市场的同时在豆瓣生产技术上 加大技术攻关，这必将给我国社会经济带来巨大的经济效益，也将提高人民的生活质量 水平。本课题意在通过实验获得提高郫县豆瓣氨基酸态氮含量的最佳工艺，希望能给广 大同行予参考，共同促进我国豆瓣事业的发展。 本课题在不改变郫县豆瓣原有风味、口感的基础上对影响最终氨基酸态氮的各种因 素进行考察。在传统豆瓣制造工艺的基础上，将胡豆原料经过热水烫煮，并加入一定比 例的豆粉，拌入曲精进行制曲。实验中对豆瓣制曲过程进行研究，找出最佳制曲工艺条 件，并同时对无机元素，激活剂等对制曲过程的影响进行了研究，最后对豆瓣的发酵过 程进行研究，探索最佳发酵工艺条件，为今后豆瓣生产控制与工艺改造提供一定的理论 基础和科学依据。 1 4 2 本论文研究的主要内容 4 西华大学硕士学位论文 ( 1 ) 豆瓣制曲最佳条件研究 在试验中，采用近似拟合设计和响应面分析法，重点考察了制曲温度、时间、曲精 加入量对制曲过程的影响，以所产的米曲霉酶量作为制曲效果的主要指标，得到了最佳 制曲条件并关联相应的统计数学模型，确立豆瓣制曲的最佳工艺参数，以便于指导实际 生产。 ( 2 ) 考察微量元素、激活剂、植酸对米曲霉产酶的影响 在试验中，分析了微量元素，激活剂，植酸等对米曲霉的影响，连续监测了制曲过 程中加入无机元素，激活剂，植酸后米曲霉酶活指标变化以求获得一个最大的产酶量， 为今后生产提供有价值的数据。 ( 3 ) 蛋白质最佳水解条件研究 试验中，采用可旋转中心组合设计和响应面分析法，在获得最佳制曲条件及微量元 素等的影响作用基础上，重点考察了初始p h 值、水解温度和时间，等对豆瓣生产的影 响，以最终的氨基酸态氮含量为指标，得到最佳水解工艺条件并关联了相应统计数学模 型，确立了豆瓣中蛋白质水解的最佳工艺参数，用于指导实际生产。 本课题的创新点在于：( 1 ) 第一次系统性的，针对性的对豆瓣生产过程的制曲工艺， 发蛋白质水解工艺有了准确的研究。( 2 ) 在豆瓣生产过程中首次采用微量元素，激活剂， 植酸等刺激米曲霉的产酶。( 3 ) 在豆瓣生产中，首次使用胡豆开水浸泡，混合加入豆粉 等流程，在不改变风味的基础上，创造性的提高氨基酸态氮。 5 西华大学硕士学位论文 第二章最佳制曲工艺试验探索 制曲是我国传统技术，谚语：一曲、二醪、三熬油，说明制曲的重要性。郫县豆瓣的 生产中采用米曲霉作为发酵菌种【1 5 l1 1 6 】。因米曲霉具有丰富的蛋白酶系，能产生酸性、 中性和碱性蛋白酶，其稳定性高，能耐受较高的温度，广泛地应用于食品、医药及饲料 等工业中。制曲是豆瓣生产中至关重要的一环，其实质就是使米曲霉在原料上生长繁殖， 以分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，以备后期发酵所用，尤以蛋白酶最为重要， 直接影响原料的蛋白利用率和最终产品的风味【1 7 l 【1 8 】。曲料的形态可以在一定程度上体 现出制曲质量的好坏，基本指标为黄绿色外观、孢子有飞扬感、没有异味。制曲过程中 米曲霉的生长好坏是直接关系到后面蛋白质的水解，而这个过程又是受温度，时间，曲 精量等的影响。鉴于此，本部分拟采用在常规生产条件下考察这三种因素对制曲过程的 影响，再用响应面法进行分析，以酶活为指标，最终获得制曲的最优条件。 2 1 材料与设备 2 1 1 实验材料 f o l i n 一酚试剂 碳酸钠 三氯乙酸 磷酸盐缓冲液 酪蛋白溶液 酪氨酸溶液 甲醛溶液 氢氧化钠 9 5 乙醇 无水乙醇 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 西华大学硕士学位论文 p h s 2 5 型p h 计 j j 1 精密增力电动搅拌器 s h b 3 循环水多用真空泵 d h g 9 0 7 0 a 电热恒温干燥箱 s h a b 数显水浴恒温振荡器 d l 1 型万用电炉 冰箱 紫外可见分光光度计 h h b 1l 型电热恒温培养箱 2 0 2 a 型恒温干燥箱 电子天平 2 2 方法 上海雷磁仪器厂 金坛市金伟实验仪器厂 郑州杜甫仪器厂 上海齐欣科学仪器有限公司 金坛市富华电器有限公司 北京中兴伟业仪器有限公司 山东青岛海尔集团 2 2 1 实验工艺 本次实验研究重点是制曲工艺中各因素对目的产物的各个指标的影响情况，主要实 验流程如下： 工艺流程：胡豆一蒸煮一出锅一冷却一拌入面粉一接种一入培养箱一制曲一翻曲一成曲 一发酵 2 2 - 2 实验内容 2 2 2 1 酶活的测定方法【1 9 】 采用福林法 2 2 2 1 1 试剂的配制 a 0 4 m o l 碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠( n a 2 c 0 3 ) 4 2 4 9 ，定容至1 0 0 0 m l 。 b 0 4 m o l 三氯乙酸( tca ) 溶液：称取三氯乙酸( c c l 3 c o o h ) 6 5 4 9 ，定容至1 0 0 0 m l 。 c p h 7 2 磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠( n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 ) 3 1 2 9 ，定容至1 0 0 0 m l ，即成 0 2 m o l 溶液( a 液) 。称取磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ) 7 1 6 3 9 ，定容至1 0 0 0 m l ，即成 0 2 m o l 溶液( b 液) 。取a 液2 8 m l 和b 液7 2 m l ，再用蒸馏水稀释1 倍，即成0 1 m o lp h 7 2 的磷酸盐缓冲液。 d 2 酪蛋白溶液：准确称取干酪素2 9 ，称准至0 0 0 2 9 ，加入o 1 n 氢氧化钠1 0 m l ，在水浴 中加热使溶解( 必要时用小火加热煮沸) ，然后用p h 7 2 磷酸盐缓冲液定容至1 0 0 m l 即成。 配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 e 1 0 01 3 g m l 酪氨酸溶液：精确称取在1 0 5 c 烘箱中烘至恒重的酪氨酸o 1 0 0 0 9 ，逐步加 入6 m l1 n 盐酸使溶解，用0 2 n 盐酸定容至1 0 0 m l ，其浓度为1 0 0 0p # m l ，再吸取此液 l o m l ，以0 2 n 盐酸定容至1 0 0 m l ，即配成1 0 0 l ag m l 的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应 7 西华大学硕士学位论文 及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。 2 2 2 1 2 实验仪器 a 分析天平：感量0 1 m g ； 一 b 5 8 1 g 型光电比色计或7 2 型分光光度计； c 水浴锅： d 1 、2 、5 、1 0 m l 移液管等。 2 2 2 1 3 标准曲线的绘制 a 先取事先标号1 到6 的6 根试管，分别加入1 0 、8 、6 、4 、2 、0 m l 蒸馏水，再分别加 入1 0 0l ag r n i 。酪氨酸o 、2 、4 、6 、8 、1 0 m l ，即每支试管中的酪氨酸浓度为：0 、2 0 、 4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 。 b 测定步骤：再取6 支试管编号于上述试管中分别吸取不同浓度酪氨酸l m l ，各加入 0 4 m o l 碳酸钠5 m l ，再各加入己稀释的福林试剂l m l 。摇匀置于水浴锅中。4 0 c 保温发 色2 0 m i n 在7 2 型分光光度计进行测定( 波长6 6 0 n m ) 。一般测三次，取平均值。将1 6 号 管所测得的光密度( o d ) 减去l 号管( 蒸馏水空白试验) 所测得的光密度为净o d 数。以净 o d 值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线( 或可求出每度o d 所相当的酪 氨酸量k ) 。 。 2 2 2 1 4 样品稀释液的制备。 a 测定酶制剂：称取酶粉o 1 0 0 9 ，加入p h 7 2 磷酸盐缓冲液定容至1 0 0 m l ，吸取此液5 m l ， 再用缓冲液稀释至2 5 m l ，即成5 0 0 0 倍的酶粉稀释液。 b 测定成曲酶：称取充分研细的成曲5 9 ，加水至1 0 0 m l ，在4 0 。c 水浴内间断搅拌1 h ，过滤， 滤液用o 1 m o lp h7 2 磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数( 估计酶活力而定) 。 2 2 2 1 5 样品测定：取1 5 1 0 0 m m 试管3 支，编号1 、2 、3 ( 做2 只也可) ，每管内加入样品 稀释液l m l ，置于4 0 水浴中预热2 m i n ，再各加入经同样预热的酪蛋白l m l ，精确保温 1 0 m i n ，时间到后，立即再各加入0 4 m o l 三氯乙酸2 m l ，以终止反应，继续置于水浴中保温 2 0 m i n ，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取1 5 1 5 0 m m 试管3 支，编号1 、2 、3 ，每 管内加入滤液l m l ，再加0 4 m o l 碳酸钠5 m l ，已稀释的福林试剂l m l ，摇匀，4 0 4 c 保温发色 2 0 m i n 后进行光密度( o d ) 测定。空白试验也取试管3 支，编号( 1 ) 、( 2 ) 、( 3 ) ，测定方法同上， 唯在加酩蛋白之前先加 0 4 m o l 三氯乙酸2 m l ，使酶失活，再加入酪蛋白。 样品的平均光密度( od ) 一空白的平均光密度( o d ) = 净o d 值。 2 2 3 计算t ? 在4 0 。c - f 每分钟水解酪蛋白产生1ug 酪氨酸，定义为1 个蛋白酶活力单位 样品蛋白酶活力单位( 干基) 2 旦4 l 1 0 81 一 西华大学硕士学位论文 式中：a 一由样品测得o d 值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数( 或o d 值k ) ； 4 _ 4 毫升反应液取出1m l 测定( 即4 倍) ；， n 酶液稀释的倍数： 。j ： 1 卜反应1 0 r a i n ； w 一样品水分百分含量。 2 2 4 试剂浓度的规范 本实验中不同浓度的氢氧化钠溶液和盐酸溶液的使用比较频繁，在实验过程中需要 对这些现配试剂浓度进行规范，故需要标定。本次实验脱酯所用氢氧化钠溶液均采用邻 苯二甲酸氢钾标定，所用盐酸溶液采用已标定的氢氧化钠进行反标定。 2 2 5 豆瓣制曲工艺的主要影响因素 2 2 5 1 制曲时间对豆瓣制曲的影响 制曲的过程，即是米曲霉生长繁殖的过程，时间过短，米曲霉繁殖量较低，产酶量也 相应降低，原料利用率降低，时间过长，米曲霉繁殖数量过大，营养物质消耗过多，酶 活随时间的增加相应降低，也不利于生产。因此，要选取适宜的制曲时间。精确称取预 处理后的胡豆1 0 0 0 9 ，加入1 5 0 r a g 的曲精量，充分拌匀，置于培养基中，固定制曲温度3 4 ，制曲时间为2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 、1 2 0 h ，以酶活为指标，确定制曲时间对制曲效果 的影响。 2 2 5 2 制曲温度对豆瓣制曲的影响 米曲霉的最适宜生长温度为2 8 - - 3 5 ，在一定温度范围内，制曲温度过低，米曲霉 生长缓慢，产酶率较低，能耗增大，亦将延缓发酵周期，从而使得生产成本增加，制曲 温度过高，会使微生物的生长受到抑制，使产酶量减少。因此，适宜的温度对制曲的成 功有很大的影响。精确称取预处理后的胡豆1 0 0 0 9 ，加入1 5 0 m g 的曲精量，充分拌匀， 置于培养基中，分别放入温度为2 6 、2 8 、3 0 、3 2 、3 4 、3 8 的培养箱中，固 定制曲时间为7 2 h 。以酶活为指标，以确定温度对制曲效果的影响 2 2 5 3 曲精量对豆瓣制曲的影响 在一定范围内，适当增加曲精的加入量，可以缩短豆瓣制曲周期，加快产酶速度。 但添加量过大，胡豆中的营养物质主要用于米曲霉菌的增殖，营养物质的消耗和较多代 谢物质的生成，使米曲霉菌所处环境恶化，菌体细胞会较早衰老，反而不利于制曲，所 以要选取适宜的添加量。精确称取预处理后的胡豆1 0 0 0 9 ，固定制曲温度3 4 c 、制曲时 间7 2 h ，加入曲精量为：1 5 0 r a g 、2 0 0 m g 、2 5 0 m g 、3 0 0 r n g 、3 5 0 r a g ，以酶活为指标，确 定曲精量对制曲效果的影响。 2 2 5 4 郫县豆瓣制曲工艺参数优化实验 9 j 表2 1 郫县豆瓣制曲过程试验因素水平表 t a b l e2 1f a c t o rl e v e lt a b l eo fp i x i a ns o y b e a l lp a s t e s t a r t e rp r o p a g a t i o np r o c e s s 2 3 实验结果 2 3 1 制曲时间对工艺的影响【2 0 】 2 1 】【2 2 】 制曲时间的长短对微生物生长繁殖、豆瓣发酵有着极其重要的影响。制曲的时间过 短，米曲霉的生长没有达到最佳，所产生的蛋白酶也相应减少。制曲时间过长，错过米 曲霉的最佳生长时间，也将严重影响后面的发酵过程；并一定程度上延缓了整个生产工 艺的时间，不利于生产。 表2 2 时间对制曲工艺的影响 t a b l e2 2e f f e c to fs t a r t e rt i m eo ns t a r t e rp r o p a g a t i o np r o c e s s 1 0 两华大学硕士学位论文 图2 1 时间对制曲工艺的影响 f i g u r e2 1e f f e c to fs t a r t e rt i m eo ns t a r t e rp r o p a g a t i o np r o c e s s 结果表明，培养3 4 h 后酶活力仍然很低，然后酶活随着培养时间的延长而直线上升， 至7 2 h 迭到最高峰一般来说，米曲霉从3 9h 左右进入产孢子的对数期，一直到7 5h 左 右达到最大，产酶量也在7 5h 达到最大，然后又逐渐降低。由图2 1 可以看出，制曲7 2 h 时蛋白酶的活力达到最大值，接下来逐渐下降。因此，可控制制曲时间在3 - - - 4 天左右。 2 3 2 制曲温度对工艺的影响 温度是微生物生长繁殖的重要影响因素之一，在一定范围内微生物的生长繁殖随着温 度上升而增加。而当温度升高到一定程度时，微生物的生长代谢开始受阻，进一步升高 温度将会导致菌体细胞内酶蛋白和核酸等发生不可逆变性或者细胞膜受损而死亡【2 3 】 b 4 1 。因此，要获取较好的制曲效果，就必须将制曲温度控制在适当的水平。温度对米曲 霉孢子发芽的影响很大，生产上孢子发芽温度大多控制在3 0 3 2 ，温度低于2 5 ， 孢子发芽缓慢，易染杂茵；温度高于3 8 ( 2 ，也不适于孢子发芽。曲霉的孢子吸收营养 在4 h 一5 h 开始发芽，在发芽期本身不产生热量，需要外界保温。随着进入茵丝生长繁殖 期时，会放出大量的热，使品温上升很快【2 习，此时，应及时翻曲并注意通风，使热量散 发，防止烧曲，保证酶类的大量分泌。实践证明，制曲温度不同，各种酶类的活性也各 不相同。米曲霉培养温度适宜时，氧化酶的活性较高，温度较高或较低都会影响氧化酶 的活性；制曲温度偏高，蛋白酶活性低。 表2 3 温度对制曲工艺的影响 t a b l e2 3e f f e c to fs t a r t e rt e m p e r a t u r eo ns t a r t e rp r o p a g a t i o np r o c e s s 西华大学硕士学位论文 图2 2 温度对制曲工艺的影响 f i g u r