（果树学专业论文）柑橘CBF类似基因的克隆与分析.pdf

华中农业人学硕十学位论文 柑橘c b f 类似基因的克隆与分析 摘要 柑橘是亚热带水果，在栽培范围上受到低温的限制。周期性冻害往往导致柑橘 果实产量降低、品质下降，甚至树体死亡，从而造成巨大的经济损失。因此，防治 冻害就成为柑橘产业发展和提高其经济效益的一个重要问题。解决这一问题的主要 方法途径是加强f f l 问管理和选育抗寒新品种，而后者是根本途径。近年来，采用基 因工程手段培育新品种已成为农作物育种的一种趋势。植物抗寒性属于复杂的数量 性状，是多基因协同作用的结果。采用单一基因转化植物，虽能在一定程度上提高 转基因植物对低温的抗性，但实际效果往往不理想。c b f 是调控一系列植物冷驯化 相关基因表达的一种转录因子，在低温诱导下迅速合成，与相应顺式作用元件 c r t d r e 结合，促进基因的转录，进而合成糖类、脯氨酸和膜蛋白等物质，提高植 物的抗寒性。基因转化试验证明，c b f 基因在拟南芥和油菜等多种植物中超量表达， 转基因植株对低温的耐性均显著增强。这一发现为利用基因工程手段提高植物耐寒 性提供了一条新途径。 本研究从抗冻性明显不同的枳壳、脐橙和柠檬中分离出c b f 同源基因的a p 2 核心区段，初步确证了柑橘中同样存在c b f 介导的冷驯化过程。进一步从枳壳这一 抗寒性最强的柑橘种类中克隆出c b f 基因的全长c d n a ，并进行全面的生物信息学 分析，为今后利用这些基因提高柑橘抗寒性奠定基础。主要的试验结果如下： 1 探索柑橘叶片总r n a 提取方法，先后尝试了异硫氰酸胍法、t r i z o l 试剂法 和热酚法，最终确定采用热酚法，并用l i c l 沉淀的方法从柑橘叶片中提取的r n a 最完整，d n a 、蛋白质和多糖等杂质含量最少。 2 参考拟南芥等其它物种中c b f 蛋白的保守区域设计了四条简并引物，并筛 选出最优的一对引物，用于r t p c r 扩增。结果从枳壳、脐橙和柠檬中各分离出一 个c b f 同源基因a p 2 核心区段( 柑橘c b f a 基因) 。并从枳壳中分离出另一个不同 的c b f 基因a p 2 核心区段( 枳壳c b f l 基因) 。利用b l a s t 比对分析发现，这四 个c b f 片段与其它物种c b f 蛋白间具有很高的同源性。脐橙和柠檬c b f a 基因a p 2 区段的序列完全一样，而与枳壳c b f a 基因a p 2 区段存在数个核苷酸位点的差异和 一个氨基酸残基的差异。 3 依据所分离的两个枳壳c b f 基因a p 2 区段的核苷酸序列，设计分别指向5 和3 端的嵌套特异引物，参考s m a r tr a c e 技术，采用巢式p c r 分别扩增枳壳 c b f a 和c b f l 基因的5 和3 端。测序验证后，在5 - u t r 和3 - u t r 区设计引物， p c r 扩增获得全长基因，或者采用酶切拼接法获得全长基因。结果成功获得了枳壳 c b f a 和c b f l 基囚的全长c d n a 。 柑橘c b f 类似桀i 矧的克隆j 分析 4 利用g e n e b a n k 、e x p a s y 、e m b o s s 和j a l v i e w 等数据库和软件对所克隆的 两个枳壳c b f 基因全长c d n a 进行全面的生物信息学分析，结果发现枳壳c b f a 和 c b f l 基因都具有c b f 特征序列、核定位信号序列、保守的a p 2d n a 结合结构域 和潜在的酸性结构域。这是所有物种c b f 因子的典型结构特征。此外，它们还具有 一些其它的特征位点，包括酰基化、酪胺酸硫化和a m i d a t i o n 位点以及一些蛋白激 酶磷酸化位点，如蛋白激酶c 磷酸化位点和酪蛋白激酶i i 磷酸化位点等。推测这些 特征位点可能与翻译后加工、活性调节和正常功能的行使有关。 关键词：柑橘；冷驯化；c b f ；全长c d n a ；基因克隆；生物信息学 2 华中农业人学硕1 ：学位论文 c l o n i n ga n da n a l y s i so f c b f - - l i k eg e n e sf r o mc i t r u s a b s t r a c t a sas u b t r o p i c a lf r u i t ，c i t r u si sr e s t r a i n e db yl o wt e m p e r a t u r eo ni t sc u l t u r a la r e a n a t u r a lr e c u r r e n tl o w t e m p e r a t u r eo f t e ni n d u c e sd e c r e a s eo ff r u i tp r o d u c t i v i t y ，d e c l i n eo f f r u i tq u a l i t y ，a n de v e nc a u s e sd e a t ho ft r e e ，a l lo fw h i c hm a yd e c r e a s ee c o n o m i ca n d e c o l o g i c a lp r o f i tg r e a t l y s o ，a v o i d i n go rp r o t e c t i n gc i t r u sf r o ml o w - t e m p e r a t u r ed a m a g e i sa ni m p o r t a n tp r o b l e mo ne n l a r g i n gt h ec u l t u r a la r e aa n di n c r e a s i n gt h ep r o f i to fc i t r u s p r o d u c t i o n m a i nm e a s u r e so ns o l v i n gt h i sp r o b l e ma r ei m p r o v i n gf i e l dm a n a g e m e n t ， s e l e c t i n go rc u l t i v a t i n gn o v e lv a r i e t i e sw i t hh i g ht o l e r a n c et ol o wt e m p e r a t u r e a tp r e s e n t ， g e n e t i ce n g i n e e r i n gb e c o m e st h em a i nt r e n do fp l a n tb r e e d i n g c o l dt o l e r a n c ei sa c o m p l e xq u a n t i t a t i v et r a i to fp l a n tw h i c hi sar e s u l to fc o o p e r a t i o no fm a n yr e l a t e dg e n e s a sa r e s u l t ，s i n g l eg e n et r a n s f o r m a t i o no fp l a n tc a no n l ye n h a n c ec o l dt o l e r a n c ei nav e r y l i m i t e dd e g r e e b e i n gak e yf a c t o ri nr e g u l a t i n gt h et r a n s c r i p t i o no fas e r i e so fg e n e s r e l a t e dt oc o l da c c l i m a t i o n ，c b f ( c r t d r eb i n d i n gf a c t o r ) i si n d u c e db yl o w t e m p e r a t u r er a p i d l ya n di m p r o v et r a n s c r i p t i o n a ll e v e lo ft h e s eg e n e sb yb i n d i n gt o c r t d r e ( c - r e p e a t d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m e n t ) s p e c i a l l y ，r e s u l t i n gi nt h es y n t h e s i s o fs a c c h a r i d e ，p r o l i n e ，p r o t e i n sc o n t r i b u t e dt ot h es t a b i l i z a t i o no fb i o m e m b r a n e ，a n ds o m e o t h e rs u b s t a n c e sr e l a t e dt oc o l dr e s i s t a n c e ，t h u se n h a n c et h ec o l dt o l e r a n c eo fp l a n t f u r t h e rs t u d i e so ng e n et r a n s f o r m a t i o nt e s t i f i e dt h a tt h ec o l dt o l e r a n c eo f p l a n tc o n t a i n i n g h i g he x p r e s s e df o r e i g nc b fg e n ei si m p r o v e dg r e a t l y t h i ss u g g e s t san e ww a yo f i m p r o v i n gc o l dt o l e r a n c eo fp l a n tb yg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n i q u e i nt h i ss t u d y ，c o r ea p 2 f r a g m e n t so fc b f l i k eg e n e sf r o mt r i f o l i a t eo r a n g e ( p o n c i r u s t r i f o l i a t a ( l ) r a e ) ，n a v e lo r a n g e ( c i 驴u ss i n e n s 括( l ) o s b e c k ) a n dl e m o n ( c i t r u sl i m o n ( l i n n ) b u r m ) w e r ei s o l a t e dt ot e s t i f yw h e t h e rt h e r ea r ea l s oc b fe x i s t i n gi nc i t r u so n c o n t r o l l i n go fc o l da c c l i m a t i o n f u r t h e rc l o n i n gt h ef u l l - l e n g t hc d n ao fc b f l i k eg e n e s f r o mt r i f o l i a t eo r a n g e ，w h i c hi st h em o s tc o l d - t o l e r a n ts p e c i e so fc i t r u s ，a n dc o r r e s p o n d i n g b i o i n f o r m a t i c a la n a l y s i sw e r ea l s oc a r r i e do u tt o p a v et h ew a yo fi m p r o v i n gc o l d t o l e r a n c eo fc i t r u sb y u s i n gt h e s ec b f l i k eg e n e s t h em a j o rr e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： 1 g u a n i d i n u mt h i o c y a n a t e ，t r i z o lr e a g e n ta n dh o tp h e n o le x t r a c t i n gm e t h o d sw e r e t r i e dt oe x t r a c tt o t a lr n af r o ml e a v e so fc i t r u s m e t h o du s i n gh o tp h e n o le x t r a c t i o na n d l i c ip r e c i p i t a t i o nw a si d e n t i f i e da st h eb e s to n e t o t a lr n ae x t r a c t e db yt h i sm e t h o dw a s m o s ti n t a c t 诚t hl e a s tc o n t a m i n a n to fd n a ，p r o t e i na n dp o l y s a c c h a r i d e 3 柑橘c b f 类似暴的兜降j 分析 2 f o u rd e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt oc o n s e r v e dd o m a i no fc b f f r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n aa n ds o m eo t h e rp l a n t s ，t h eb e s tp a i ro fw h i c hw a sp i c k e do u t f o rf u r t h e rr t - p c ra m p l i f i c a t i o n a p 2f r a g m e n t so fac b f - l i k eg e n e ( c b f ag e n ef r o m c i t r u s ) w e r ec l o n e df r o mt r i f o l i a t eo r a n g e ，n a v e lo r a n g ea n dl e m o nr e s p e c t i v e l y ，a n d a n o t h e ra p 2f r a g m e n to fad i f f e r e n tc b f - l i k eg e n e ( c b f1g e n ef r o mt r i f o l i a t eo r a n g e ) w a sa l s oc l o n e df r o mt r i f o l i a t eo r a n g e s e q u e n c ea n a l y s i sb yb l a s t na l g o r i t h ms h o w e d t h a tt h ef o u rf r a g m e n t sh a dh i g hh o m o l o g yw i t hc b ff r o mm a n yo t h e rp l a n t s b o t ha p 2 f r a g m e n t so fc b f ag e n e sf r o mn a v e lo r a n g ea n dl e m o nw e r et h es a m ei n n u c l e o t i d e s e q u e n c e ，w h i l eh a dl i t t l ed i f f e r e n c ef r o ma p 2f r a g m e n to fc b f ag e n ef r o mt r i f o l i a t e o r a n g ea ts e v e r a ll o c i 3 t h e5 a n d3 c d n ae n d so fc b f aa n dc b f 1g e n e sf r o mt r i f o l i a t eo r a n g ew e r e a m p l i f i e dr e s p e c t i v e l yu s i n gn e s t e dp c ra c c o r d i n gt os m a r tr a c et e c h n i q u e ，w i t h p a i r so fn e s t e dp r i m e r sw h i c hw e r ed e s i g n e db a s e do nt h et w oa p 2f r a g m e n t sf r o m t r i f o l i a t eo r a n g e a f t e rc o n f i r m a t i o nb ys e q u e n c i n g ，t h ef u l l l e n g t hc d n ao fc b f aa n d c b f1g e n e sf r o mt r i f o l i a t eo r a n g ew e r eo b t a i n e db yp c rm e t h o dw i t hap a i ro fp r i m e r s l o c a t e di n5 - u t ra n d3 - u t ro re n z y m ec u t t i n ga n dc o n n e c t i n gm e t h o ds u c c e s s f u l l y 4 g e n b a n k ，e x p a s y ，e m b o s s ，j a l v i e wa n ds o m eo t h e rd a t a b a s e sa n ds o f t w a r e s w e r eu s e dt oa n a l y z et h et w oc b f - l i k eg e n e sf r o mt r i f o l i a t eo r a n g e t h er e s u l ts h o w e d t h a tb o t ho ft h e mp o s s e s s e ds i g n a t u r es e q u e n c e so fc b f ，n u c l e a rt a r g e t i n gs e q u e n c e ， c o n s e r v e da p 2d n a b i n d i n gd o m a i na n dp o t e n t i a la c i dd o m a i n ，w h i c hw a st h et y p i c a l s t r u c t u r eo fa l lc b fg e n e s b e s i d e s ，s o m eo t h e rl o c is u c ha sn m y r i s t o y l a t i o ns i t e ， t y r o s i n es u l f a t i o ns i t e ，a m i d a t i o ns i t e ，a n dp h o s p h o r y l a t i o ns i t e so fp r o t e i nk i n a s ec a n d c a s e i nk i n a s e1 1w e r ea l s oc o n s e r v e di nb o t hc b f - l i k eg e n e s i tp r e d i c t e dt h a tt h e s el o c i m i g h tb ei n v o l v e di np r o c e s sa f t e rt r a n s l a t i o na n dr e g u l a t i o no fa c t i v i t y ，t h u sc o n c e r n e d w i t hi t sn o r m a lf u n c t i o n k e y w o r d s ：c i t r u s ；c o l da c c l i m a t i o n ；c b f ；f u l l - l e n g t hc d n a ；g e n ec l o n i n g ； b i o i n f o r m a t i c s 4 华中农业人学硕十学位论文 缩略词表 5 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 毒如需保密，解密时间w g 年7 月日是否保密o 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 嘎姐 时间：知96 年易月i 呷日 签名日期：锄6 年6 月f7 日签名日期：抄移6 年 月7 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 柑橘c b f 类似堆闪的克隆j 分析 1 前言 1 1 课题的提出 柑橘作为世界第一大水果，有着悠久的栽培历史，深受人们的青睐。但它属于 亚热带水果，在栽培范围上受低温的限制。即使在传统的柑橘栽培区，由于周期性 冻害造成的果实产量降低、品质下降，甚至树体死亡所导致的经济损失就非常巨大 ( 章文才等，1 9 8 3 ) 。目前，我国的柑橘栽植面积约1 6 0 万h m 2 ，居世界首位，年 产量近1 5 0 0 多万吨，年创收入1 0 0 多亿元( 邓秀新，2 0 0 4 ) 。可见柑橘产业已成为 我国的一项重要农产业，在增加农民收入，提高国民生产总值中起着非常重要的作 用。因而，防范冻害就成为柑橘产业健康发展和提高其经济效益的一个关键问题。 传统的抗冻措施主要有两点：一是加强田间管理，提高田间温度或者从生理角度增 强树体的耐寒性；二是采用传统育种技术选育抗寒新品种( 存在随机性大、可控性 差、时问长等缺点) 。 传统育种技术主要有芽变选种，实生选种和杂交育种等。芽变选种和实生选种 的方法只能用于改进个别性状或提供育种材料，一般不能大幅度提高抗性，因为要 保持原有品种的优良特性，而且变异范围小，变异体类型少，可供人为操纵的余地 小( 李新国等，2 0 0 4 ) 。由于柑橘种子具有多胚性，大部分柑橘种类均白花授粉， 所以杂交育种的方法在柑橘育种中应用非常困难。此外，杂交后代遗传背景复杂， 难以获得综合性状优良的新品种。近年来，采用基因工程手段培育新品种已成为农 作物育种的一种趋势。与传统育种技术相比，这种方法易操作、可控性和针对性强、 所需时间短，效果显著，在果树等多年生农作物抗性育种上具有很大的优势。 植物抗寒性属于复杂的数量性状，是多基因共同协调作用的结果，采用单一基 因转化植物，虽能在一定程度上提高转基因植物的抗寒性，但实际效果往往不理想 ( a r t u se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。于是，人们将重心转向能够调控一系列抗性基因表达的转录 因子。其中，c b f d r e b l ( c r t d r eb i n d i n gf a c t o r ) 是调控植物冷驯化相关基因表 达的最重要转录因子之一( s t o c k i n g e re ta 1 ，1 9 9 7 ；t h o m a s h o w , 2 0 0 1 ) 。研究发现， c b f 基因在拟南芥和油菜等植物中超量表达，转基因植株对低温的抗性均显著增强 ( g i l m o u re ta 1 ，2 0 0 0 ；j a g l oe ta 1 ，2 0 01 ；k a s u g ae ta 1 ，19 9 9 ；k i r s t e ne ta 1 ，19 9 7 ；l i ue t a 1 ，1 9 9 8 ) 。c b f 冷胁迫反应途径的组成因子在开花植物中高度保守，而且不仅限于 冷驯化植物( j a g l oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。g e n b a n k 数据库搜索结果显示，许多植物中均有 潜在的c b f 同源基因( t h o m a s h o we ta 1 ，2 0 0 1 ) 。这表明，“c b f 技术 在提高各 种大田作物和园艺植物耐寒性中具有很大的利用价值。 6 华中农业人学硕l ：学位论文 1 2 植物抗寒研究进展 1 2 1 植物抗寒生理生化研究 对植物抗寒性的研究最初集中在生理生化方面，主要包括寒害和冻害对细胞和 组织造成损伤的机理及相应生理生化代谢的变化、植体内某些关键生化物质与抗寒 性的关系，以及细胞结构成分如细胞膜和质体与抗寒性问的关系等方面。 多方面研究证实，s o d 、c a t 、p o d 等与清除自由基有关的酶类在提高植物抗 寒性中发挥重要作用。c a 2 + c a m 系统是低温胁迫信号传导途径中的重要成员，其含 量与抗寒性呈正相关，而且外施c a 2 + 可明显提高植体的抗寒力( 李卫等，1 9 9 7 ；张 建霞等，2 0 0 5 ) 。细胞膜的稳定性与抗寒性间关系密切，低温对细胞的伤害首先表 现在对细胞膜的稳定性的破坏，而它的稳定性与其组成成分有关。研究发现，抗寒 性与膜脂中不饱和脂肪酸的含量呈正相关，而在不饱利_ 月t 日- - 肪酸中，亚油酸的含量与 抗寒性的关系最为密切( 孙中海等，1 9 9 0 ) 。其它一些生化物质如可溶性糖、渗透 调节物质、可溶性蛋白等都对植物的抗寒性起促进作用。 随着分子生物学和生物技术的迅速发展，以及对模式植物抗寒机理研究的深入， 人们对植物抗寒性的研究逐渐走向更微观的分子水平。 1 2 2 植物抗寒分子机理研究 1 2 2 1 胁迫诱导基因表达 植物在长期的进化过程中，演变产生了多种多样的适应各种逆境的机制。征低 温、干旱、高盐等逆境胁迫下，植物体内多种基因诱导表达并导致一系列的生理生 化变化，从而使植物对这些胁迫作出积极的反应，提高自身的抗逆性。胁迫诱导基 因表达的产物按功能可分为两类( s h i n o z a k ie ta 1 ，1 9 9 7 ；s h i n o z a k ie ta 1 ，1 9 9 8 ) ： 第一类是在植物的抗逆性中起直接作用的蛋白质，包括：( 1 ) 水通道蛋白，可 以形成选择性的水运输通道，提高细胞膜的透水性，使脱水胁迫下的细胞保持一定 的膨压，维持正常的生命活动；( 2 ) 保护生物大分子及膜结构的蛋白质，如l e a ( 1 a t e e m b r y o g e n e s i sa b u n d a n t ) 蛋白、a f p ( a n t i f r e e z i n gp r o t e i n ) 等功能蛋白；( 3 ) 合成渗透保护物质( 如脯氨酸和甜菜碱等) 的关键酶类，如脯氨酸合成酶等，可通 过诱导渗透保护物质的生物合成来降低细胞的渗透势，提高植物的抗胁迫能力；( 4 ) 具有保护作用的蛋白酶类，如毓基蛋白酶等，可降解变性蛋白质，为新蛋白质的合 成储备原料；( 5 ) 具解毒作用的酶类，如超氧化物歧化酶，可抵御逆境胁迫下产生 的高度反应性氧自由基所引起的氧化损伤和致死效应，提高植物抗胁迫能力。 第二类是在植物胁迫信号转导和基因表达过程中起调节作用的蛋白质因子，主 要包括：( 1 ) 与第二信使生成有关的酶类，如磷脂酶等；( 2 ) 与胁迫诱导基因表 7 柑橘c b f 类似桀i 大i 的克降j 分析 达调控有关的转录因子，如m y c 、m y b 、b z i p ( b a s i ch e l i x l o o p h e l i x ) 、e r e b p a p 2 ( e t h y l e n e - r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n a p e t a l a 2 ) 等； ( 3 ) 与蛋白质磷酸 化有关的蛋白激酶类，其中最重要的是促分裂原活化蛋白激酶级联中所包括的三个 关键激酶m a p k ( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ) 、m a p k k ( m a p kk i n a s e ) 和 m a p k k k ( m a p k kk i n a s e ) 。 1 2 2 2 植物冷诱导基因 低温是影响植物生长、发育及其地理分布的一个重要生态因子。很多植物在经 历一段时间的非冰冻低温胁迫后，其对低温的耐性会得到提高，这一现象称为冷驯 化( c o l da c c l i m a t i o n ，c a ) 。冷驯化是植物长期进化的结果。当外界温度下降时，植 物感受低温信号，引起许多基因表达的变化( t h o m a s h o w ，1 9 9 0 ) 。目前，已从拟南 芥、油菜、苜蓿、菠菜、马铃薯、小麦、大麦等多种植物中鉴定出许多冷诱导基因 ( 邓江明等，2 0 0 1 ) ，如拟南芥中的k i n l 、c o r 6 6 k i n 2 、c o r l 5 a 、c o r 4 7 r d l 7 、c o r 7 8 r d 2 9a l t i 7 8 和e r d l o ，油菜中的b n 2 8 和b n l1 5 ，小麦中的w c s l 2 0 和w c s 2 0 0 等。 近年来，在拟南芥冷诱导基因的研究中，发现了c b f 转录激活因子。这一类转录因 子对植物冷驯化十分重要，受到诸多研究者的关注。 1 2 3 冷诱导基因转录调控因子- - c b f 1 2 3 1c b f 的鉴定 y a m a g u c h i s h i n o z a k i 和s h i n o z a k i 等( 1 9 9 4 ) 在拟南芥r d 2 9 a 基因启动子中鉴 定出一个d n a 调控元件d r e ，含有9 b p 的核心序列( t a c c g a c a t ) 。同年，从 c o r l 5 a 基因的启动子中又鉴定出另一调控元件c r t ( t g g c c g a c ) ( b a k e re ta 1 ， 1 9 9 4 ) 。这两个元件均含有c c g a c 核心序列，即l t r e ( 1 0 w t e m p e r a t u r e r e s p o n s i v e e l e m e n t ) 元件( j i a n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。随后证明，c r t d r e 或其核心序列普遍存在 于冷诱导和脱水诱导基因的启动子中，为这类基因的冷诱导和脱水诱导表达所必需 ( 1 w a s a k ie ta 1 ，1 9 9 7 ；s t o c k i n g e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。进而推测，在含有c r t d r e 元件的 冷诱导和脱水诱导基因表达过程中，可能有相应调控蛋白的参与。s t o c k i n g e r 等 ( 1 9 9 7 ) 采用酵母单杂交( y e a s to n e h y b r i d ) 方法从拟南芥中分离出一个e d n a ，其 编码产物能与c r t d r e 特异结合，且在酵母系统中可激活含有c r t d r e 上游启 动子序列的报告基因的转录。可见，此蛋白具有转录激活因子的作用，命名为c r w d r e 结合因子c b f l 。以包含c b f l 编码区的片段作为探针，从拟南芥文库中筛选 又获得c b f 2 和c b f 3 基因( g i l m o u re ta 1 ，1 9 9 8 ；m e d i n ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。同时，l i u 等( 1 9 9 8 ) 鉴定出5 种d r e 结合蛋白，其中d r e b l a 、d r e b l b 和d r e b l c 分别 华中农业人学硕一f ：学位论文 对应于c b f 3 、c b f l 和c b f 2 。3 个c b f 基因构成一个小基因家族，以 c b f l 一c b f 3 c b f 2 的顺序正向重复排列于拟南芥染色体短臂的7 2 8 e m 处，相互 之间紧密连锁( g i l m o u re ta 1 ，1 9 9 8 ；m e d i n ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。3 个c b f 基因的可读框 都没有内含子，且核苷酸序列高度同源。3 个c b f 转录激活因子之间氨基酸序列的 同源性均在8 5 以上( g i l m o u re ta 1 ，1 9 9 8 ；l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ；t h o m a s h o we ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 据推测，3 个c b f 基因具有共同的起缘，可能是同一祖先基因连续重复两次后，通 过突变或群体选择演变而成( g i l m o u re ta 1 ，1 9 9 8 ；m e d i n ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 继拟南芥之后，z h o u 等( 1 9 9 8 ) 从油菜也中克隆出一个d r e 结合蛋白的编码 基因。j a g l o 等( 2 0 0 1 ) 从油菜e d n a 文库中筛选，鉴定出两个编码不同类似c b f 蛋白的c d n a 克隆。c h o i 和c l o s e ( 2 0 0 0 a ，2 0 0 0 b ) 从水稻和大麦中分别分离出编码 c b f 和类似c b f 蛋白的c d n a 。 类似c b f 的蛋白不只局限于能够进行冷驯化的植物。番茄不具冷驯化能力，对 温度十分敏感。数据库搜索结果表明，番茄产生多种a p 2 e r e b p 蛋白，这些蛋白 与拟南芥c b f i 显著同源。业已获得一个克隆，其推导多肽与拟南芥c b f l 具有5 3 的氨基酸序列同源性，并具有c b f 蛋白独有的两个特征序列( j a g l oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 2c b f 的结构特征 c b f 转录激活因子属于a p 2 e r e b p 类转录因子，一级结构中含有a p 2 ( a p e t a l a 2 ) d n a 结合结构域、推断的碱性核定位信号区和潜在的酸性转录激活域 ( l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ；m e d i n ae ta 1 ，1 9 9 9 ；s t o c k i n g e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。a p 2 结构域为植物所 特有，存在于拟南芥蛋白a p e t a l a 2 ( a p 2 ) 、a 烈t e g u m e n t a 和t y ，烟草乙烯 应答元件结合蛋白( e t h y l e n e r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，e r e b p ) 以及许多其 它功能未知的植物蛋白中( 1 e e h m a n ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。它由大约6 0 个氨基酸残基组成， 在不同植物中非常保守( o k a m u r oe ta 1 ，1 9 9 7 ) 。小麦和黑麦等作物中类似c b f 的 多肽与拟南芥c b f l 的序列同源性主要归因于它们的a p 2 结构域的高度同源( j a g l o e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。推断的碱性核定位信号区位于n 木端区域，富含精氨酸和赖氨酸残 基，控制c b f 转录激活因子进入细胞核的过程。位于c 一末端的潜在转录激活区酸性 氨基酸含量较高，可能在转录激活中起主导作用( s t o c k i n g e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 比较发现，来自拟南芥、油菜、小麦、黑麦和番茄的c b f 蛋白都含有两段短多 肽序列，即p k k r p ag r x k f x e t r h p 和d s a w r ( j a g l oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。前者直接 位于a p 2 结构域的上游，后者在a p 2 结构域的下游。在预测拟南芥编码产生的1 4 0 多种a p 2 e r e b p 结构域蛋白中( r i e c h m a n ne ta 1 2 0 0 0 ) ，只有c b f l 、c b f 2 和 c b f 3 才具有这两段短多肽序列，被称为c b f 蛋白的特征序列( 或称作标签序列) 。 9 柑橘c b f 类似摹i n 的克隆与分析 两特征序列在进化程度不同的物种中保守存在，说明它们具有重要功能。p k k r p a g r x k f x e t r h p 序列与核运输信号相似，表明它可能与蛋白运输有关。 根据二级结构预测，拟南芥c b f l 蛋白中有2 个a 螺旋，一个在n 末端区域， 另一个在a p 2d n a 结合结构域内。a p 2 结构域中的亲水脂0 【螺旋是c b f 蛋白的一 个核心结构，参与同其它转录因子及d n a 问的相互作用( 刘强等，2 0 0 0 ) 。该结 构域中还有3 个b 折叠，它们通过与d n a 大沟内碱基对的互作对识别各类顺式作 用元件起关键作用( a l l e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 2 3 3c b f 的表达特性 正常生长温度下，植物体内c b f 基因的表达量很低，几乎检测不到其转录物的 存在。将拟南芥植株转移到低温环境中，3 个c b f 基因的转录在1 5m i n 内明显提高， l 2h 内继续升高，2h 后开始下降，但在2 4h 内仍保持较高的水平。a b a 处理和 脱水胁迫条件下，没有c b f 转录物积累( l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ；g i l m o u re ta 1 ，1 9 9 8 ；m e d i n a e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。与拟南芥中的情况一样，油菜、小麦、黑麦和番茄中类似c b f 基因 的转录也在经受低温胁迫后1 5 3 0m i n 内快速提高，几小时内达到最高，随后开始 下降( j a g l oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。而且，c b f 基因的这种冷诱导表达是非器官特异的，它 们的转录物在叶、茎、根等器官中积累到相似的水平( m e d i n ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 拟南芥c b f l 、c b f 2 和c b f 3 基因与组成型强启动子c a m v3 5 s 连接导入拟南 芥和油菜后，它们在没有低温刺激的条件下也可以表达，而在低温胁迫下的表达则 更强( g i l m o u re ta 1 ，2 0 0 0 ；j a g l oe ta 1 ，2 0 0 1 ；k a s u g ae ta 1 ，1 9 9 9 ；k i r s t e ne ta 1 ，1 9 9 7 ； l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。用拟南芥r d 2 9 a 基因的启动子取代c a m v3 5 s ，则转基因植株中 c b f 3 基因的表达受到a b a 处理和脱水、高盐、低温等胁迫的强烈诱导( k a s u g ae t a 1 ，1 9 9 9 ) 。 c b f 基因冷诱导表达的具体机制还不是很清楚。g i l m o u r 等( 1 9 9 8 ) 根据低温 胁迫下c b f 转录物迅速积累、c b f 调控发生在转录水平以及c b f 基因启动子能介 导转基因植株中g u s 报告基因的低温诱导表达等研究结果，提出一种模型：正常生 长温度下，植物体内存在一种转录因子i c e ( i n d u c e ro f c b fe x p r e s s i o n ) ，被低温激 活后识别c b f 基因启动子中相应的冷调控元件，进而促使c b f 基因转录表达。正 常的环境条件下，i c e 处于一种不活动状态。但植株经受低温后，就会激活一条信 号转导途径，导致i c e 或相关蛋白的修饰，从而使i c e 能诱导c b f 基因的表达。随 后不久，c h i n n u s a m y 等( 2 0 0 3 ) 发现并鉴定了一种b h l ht f ，i c e l 。它能与c b f 3 基因启动子中m y c 序列特异结合并在低温下激活其表达。突变分析发现，c b f 2 启 动子中存在i c e r l 和i c e r 2 结构，它们在低温诱导c b f 2 基因表达中其作用。这说 明植物体内还存在其它i c e 类似蛋白。 l o 华中农业人学硕+ ：学位论文 i s h i t a n i 等( 1 9 9 8 ) 发现拟南芥h o s l 基因突变导致低温反应中c o r 7 8 、c o r 4 7 、 c o r l 5 a 和k i n l 等冷调控基因的超诱导表达。l e e 等( 2 0 0 1 ) 进一步研究发现，在h o s l 突变体中，c b f 2 和c b f 3 基因的冷诱导表达增强，冷处理后3 h ，c b f 2 基因的表达 大约要比野生型植