冰淇淋的微生物检验.doc

第一节 冰淇淋的微生物检验 由于冰淇淋中营养丰富，特别适合微生物繁殖，一旦操作规程执行不当，消毒工作未做好，再加上夏、秋两季温度与湿度都适合于细菌的繁殖，结果不但使产品不合格，失去了其自身的营养价值，严重的还会危及人体健康。为了督促、检查从原料、半成品、成品到操作人员及各工序的卫生、消毒情况，冰淇淋生产厂家必需建立化验室，有专职人员按照国家、行业或企业制定的产品质量标准和规定的方法对产品进行检验，只有符合质量标准的产品方可出厂，未经检验的产品一律不准出厂销售。 一、抽样规则及方法 在存放冰淇淋的冷库中抽样。每批产品抽样0.25千克（或3支、块、杯），放入样品瓶中，封上标签，标明生产日期、批号等。 二、抽样注意事项 抽样工作人员必须换上专门用于抽样的工作服、帽、鞋等。 抽样前双手应彻底清洗和消毒。洗净双手并将双手浸入含有效氯300毫克/千克的氯水中，时间3060秒。再用含75%酒精的棉花球揩拭双手。 抽样工具及设备必须严格消毒，如抽样台、取样匙、取样钳、样品瓶等必须用消毒水消毒，取样钳还需火焰灭菌。样品瓶清洗干净后需置于160温度进行3小时干热灭菌，取样匙在121蒸汽消毒15分钟。 在抽样时双手不得接触样品，动作应敏捷、准确、迅速，不得出错。应避免一切外来的污染，抽样后，必须在四小时内检验完毕。做好原始记录。 三、细菌总数的测定细菌总数是指1克或1毫升冰淇淋经过处理，在一定条件下培养后所得细菌菌落的总数。细菌总数是判断食品被污染程度的标志，也可根据这个指标，观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价提供依据。冰淇淋菌落总数的测定参照GB4789.2-94冰淇淋具体的检验步骤为：1样品的稀释将冰淇淋样品的外包装用灭过菌的镊子去掉，镊子灭菌的方法是用75%的酒精溶液揩拭。然后将样品放在样品瓶内，置于46水浴锅上熔化并不时摇动，待样品熔化后用无菌吸管吸取25毫升，移入灭菌过的含有225毫升生理盐水的广口瓶或三角瓶内，充分振摇即成为1：10的稀释液。用1毫升灭菌吸管吸取1毫升1：10的稀释液，沿管壁徐徐注入含有9毫升灭过菌的生理盐水的试管内，轻轻摇动混合均匀，即成为1：100的稀释液。再用1毫升灭过菌的吸管吸取1毫升1：100的稀释液，沿管壁徐徐注入含有9毫升灭菌后生理盐水的试管内，轻轻摇动混合均匀，即成为1：1000的稀释液。每次递增稀释时需换用另一支干净的1毫升灭过菌的吸管。2样品的培养 取四只灭过菌的培养皿，将稀释后的样液按由高至低的顺序，将1：10、1：100、1：1000的稀释样液各吸取1毫升，然后分别注入灭过菌的培养皿内，在培养皿上写清编号、及稀释度。及时将配制好琼脂培养基，待凉至46时各取15毫升左右分别加入上述的培养皿内，其中一培养皿做空白实验。使培养皿内的样液与培养基混和均匀。待琼脂培养基完全凝固后，将培养皿倒置于361的恒温箱内培养482小时。3菌落计数方法将培养482小时后的培养皿取出，放在细菌计数器上，在放大镜下仔细观察，分别记下十倍、百倍、千倍的稀释样液的菌落数，并按规定求出每毫升或每克中的杂菌数。 在菌落分布合理的情况下，即十倍的最多，百倍的多于千倍，且此均落数在30300之间时，则乘上稀释倍数作报告。例：稀释度 1/10 1/100 1/1000 菌落数 1358个 145个 23个应选择145，因145在30300之间，因此，报告中应写每毫升含细菌数150100=14500个。一个稀释度中的菌落数有两个在30300之间，应用菌落数乘上各自的稀释倍数，两者数目之比小于或等于2时，取其平均数；若超过2时，则以低倍数作报告。例：稀释度 1/10 1/100 1/1000 菌落数 299个 80个 15个299和80均在30300之间，29910=2990，80100=8000；2990与8000之比为1：2.709，其数目之比超过2，应取低稀释度菌落数作报告，报告中应写明细菌总数为2990个/毫升。若三个稀释度中的菌落数均在300个以上，则取最接近300的乘上稀释度作报告。例：稀释度 1/10 1/100 1/1000 菌落数 无法计算 4500个 305个305最接近300，因此305乘以1000等于305000，即报告上应记录细菌总数为305000个/毫升。若三个稀释度中的菌落数均在300个以下，则取最低稀释度的菌落数乘以稀释倍数作报告。例：稀释度 1/10 1/100 1/1000 菌落数 30个 15个 8个上述三个稀释度中的菌落数均在300个以下，则取最低稀释度的菌落数30乘以稀释倍数10作报告，即报告上应记录细菌总数为300个/毫升。三个稀释度中的菌落数分布情况均不合理，则不计数取应进行复检。培养皿中蔓延菌落超过培养皿内面积一半时，则不计数；若不到一半，且另一半分布较均匀，可计数半皿后再乘以2，代表全皿的菌落数。三个稀释度中均无菌落生长，则取小于1乘以稀释倍数作报告。若三个稀释度中的菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数作报告。例：稀释度 1/10 1/100 1/1000 菌落数 无法计算 305个 15个例中的305接近300，应取305乘以100，即菌落总数为30500个/毫升。1琼脂培养基的配制配方：蛋白胨：20克 琼脂：1520克 牛油膏：3克 蒸馏水：1000毫升 食盐：5克 配制方法：先将琼脂用温水清洗干净，加适量的水加热溶解，然后将其它成分加入，边加热边搅拌，使之全部溶解，用15%的氢氧化纳溶液调PH值为7.47.6，呈热过滤，分装在培养皿中，放置在121高压蒸汽杀菌锅中，灭菌30分钟，保存待用。 四、大肠菌群的检验 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100毫升（克）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。在所有食品卫生标准中，所规定的大肠菌群均应为100毫升（克）食品中所允许含有大肠菌群的实际数值，而不再以发现大肠菌群之最小样品限量（即大肠菌值）为报告标准。大肠菌群的检测参照GB4789.3-94标准。1仪器与材料温箱：（361）；冰箱：04；恒温水浴：（44.50.5）；天平；显微镜；均质器或乳钵；平皿：直径为90毫米；试管；吸管；广口瓶或三角烧瓶：容量为500毫升；玻璃珠：直径约5毫米；载玻片；酒精灯；试管架。2培养基与试剂乳糖胆盐发酵管成分： 蛋白胨：20克； 猪胆盐（或牛羊胆盐）：5克； 乳糖：10克； 1.6%溴甲酚紫乙醇液：0.6毫升； 蒸馏水：1000毫升； PH=7.4制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于热水中，加热至沸趁热调PH=7.4（可用六孔比色杯校正PH或用试纸校正PH），加入指示剂，分装管中，每管约10毫升或13毫升，其中放入一个小倒管，然后以68.9千帕高压蒸汽灭菌15分钟即可。伊红美蓝琼脂平板乳糖发酵管成分： 蛋白胨：20克； 乳糖：10克； 1.6%溴甲酚紫乙醇液：0.6毫升； 蒸馏水：1000毫升； PH=7.4 制法：将蛋白胨及乳糖溶于热的蒸馏水中，加热至沸腾，趁热调PH=7.4，加入指示剂，分装管中，每管约3毫升，并放入一个小倒管，以0.1千帕高压蒸汽灭菌15分钟即可。EC肉汤磷酸盐缓冲稀释液生理盐水革兰氏染色液3检验程序检样稀释乳糖胆盐发酵管（361），242小时 产气 不产气 伊红美蓝琼脂平板（361），1824小时 大肠菌群阴性报告 革兰氏染色 乳糖发酵管（361），242小时 革兰氏阳性 革兰氏阴性，无芽胞杆菌 产气 不产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 报 告 报 告 报 告4操作方法（1）检样稀释 以无菌操作将检样25毫升（或克）放于含有225毫升灭菌生理盐水或其它稀释的灭菌玻璃玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以800010000转/分钟的速度处理1分钟，做成1：10的均质稀释液。 用1毫升吸管吸取1：10稀释液1毫升，注入含有9毫升灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。 另取1毫升灭菌吸管，按上述操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1毫升灭菌吸管。 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。（2）乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1毫升以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1毫升及1毫升以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置（361）温箱内，培养242小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。（3）分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于（361）温箱内，培养1824小时，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。 （4）证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于（361）温箱内培养242小时，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 （5）报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100毫升（克）大肠杆菌群的MPN值。5粪大肠菌群（faecal coliform） （1）用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物（见4.2条）转种于EC肉汤管内，置于（44.50.5）水浴箱内（水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面），培养242小时，经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则报告为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置（361）温箱内，培养1824小时，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。（2）结果报告 根据证实为大肠菌群的阳性管数。查MPN检索表，报告每100毫升（克）粪大肠菌群的MPN值。大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN100毫升（克）95%可信度1毫升（克）30.1毫升（克）30.01毫升（克）3上限下限0000000001233030609059000001111012330609012051300000222201236090120160000033330123901301601901111000001234070110150510200210111111110123701101501901030230360111122220123110150200240303601111333301231602002402902222000001239014020026010303603702222111101231502002703403070440890222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000注：本表采用3个稀释度1毫升（克）、0.1毫升（克）、0.01毫升（克），每稀释度3管。表内所列检样量如改10毫升（克）、1毫升（克）、0.1毫升（克）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.1毫升（克）、0.01毫升（克）、0.001毫升（克）时，表内数字应相应增加10倍。其余可类推。 五、微生物原始记录 在检验微生物时需填写好微生物检验原始记录表：样品名称生产日期批号班次抽样地点检测方法检测项目菌落总数、大肠菌群检测开始时间结束时间检测地点稀释度1毫升（克）0.1毫升（克）0.01毫升（克）计数菌落总数 个/毫升（克）稀释度1毫升（克）30.1毫升（克）30.01毫升（克）3计数大肠菌群近似值 个/100毫升（克）其他记录检测人 校核人 六、微生物检验室及检验人员的要求微生物检验室一般分为大小二间，小间为走廊，大间为工作室； 走廊通道上应