（遗传学专业论文）银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中重要相关基因的克隆和研究.pdf

复旦大学博士学位论文银杏黄酮和萜类化台物生物合成途径中重要相关基因的克隆和研究 银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中 重要相关基因的克隆和研究 指导教师 遗传学专业博士研究生 唐克轩教授 庞永珍学号0 2 1 0 2 3 0 7 8 复旦大学生命科学学院，遗传学研究所，遗传工程国家重点实验室 上海市邯郸路2 2 0 号中国，2 0 0 4 3 3 摘要 银杏是植物中的“活化石”，银杏叶提取物含有许多对人类健康有益的活性 成分，其中展重要的是银杏黄酮和萜类化台物。然而，银杏黄酮和萜类化合物生 物合成途径在分子遗传学水平上还很少报道。为了深入研究银杏黄酮和萜类化合 物生物合成途径，并为今后利用基因工程技术提高银杏黄酮和萜类化合物含量打 下基础，本文首次克隆并研究了参与银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中的六 个重要酶的基因，它们分别是黄酮类生物合成途径中的查尔酮合成酶基因 ( g b c h s ) 、黄烷酮3 一羟化酶基n ( g a f 3 仞、黄酮醇合成酶基因( g b f l 固和花色 素还原酶基因( g b a n r ) ，另外两个是萜类生物合成途径中的3 羟基3 甲基戊二 酰c o a 还原酶基因( g b h m g r ) 和甲羟戊酸5 焦磷酸脱羧酶基因( g b m v d ) 。 查尔酮合成酶催化黄酮类化合物生物合成途径的第一个关键步骤。本文采用 r a c e 和p c r 方法，获得了g b c h s 基因的全长e d n a 序列及其基因组序列，两 者之间的序列比对结果表明，g b c h s 基因含有两个外显子和一个内含子，这也 是c h s 基因的特征之一。推导的g b c h s 蛋白和其它植物来源的c h s 蛋白具有 很高的相似性，g b c h s 中存在与晶体结构和功能己知的苜蓿奄尔酮合成酶完全 相同的活性位点，如c o a 结合位点、袋状桂皮酰结合位点和袋状环化位点等。 使用同源性建模得到的g b c h s 三维结构与苜蓿m s c h s 2 的三维结构高度相 似。c h s 系统发生树分析结果表明，g b c h s 与裸子植物具有更近的进化关系。 s o u t h e r nb l o t 分析表明，g b c h s 基因属于一个多基因家族。r t - p c r 分析表明， g b c h s 基因在根、茎和叶中的表达水平不同，而且其表达受u v - b 和伤处理的 诱导。原核表达的重组g b c h s 蛋白的分子量大小和通过生物信息学预测的分子 量大小相同。w e s t e r nb l o t 分析表明，含有6 h i s 标签的重组g b c h s 蛋白可以 和6 h i s 的抗体产生特异的免疫反应。g b c h s 己被构建到植物表达载体p 1 3 0 4 复旦大学博士学位论文银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中重要相关基因的克隆和研究 中并用于植物的遗传转化，试验中已经得到p c r 检测为阳性的烟草植株。 黄烷酮3 羟化酶的活性对于黄酮类化合物的生物合成是必需的。本文采用 r a c e 和p c r 方法，获得了g 6 乃h 基因的全长e d n a 序列及其基因组序列，两 者之间序列比对结果表明，g b 乃h 基因含有三个外显子和两个内含子；蛋白多 重比对结果表明，推导的g b f 3 h 蛋白和其它植物来源的f 3 h 蛋白具有很高的相 似性，而且g b f 3 h 在相似的位置存在结合亚铁离子和酮戊二酸的保守位点。使 用同源性建模获得了g b f 3 h 的三维模型，结果显示，g b f 3 h 模型具有2 - o d d 酶特有的、由b s h e e t 片层组成的扭曲的果冻状结构( d i s t o n e d j e l l yr o l l ) 。f 3 h 系 统发生树分析表明，g b f 3 h 比被子植物分化得早。s o d o mb l o t 分析表明，g 6 丹日 基因属于一个多基因家族。r t - p c r 分析表明，g b f 3 h 基因在茎和叶中表达，且 在叶中的表达最高。原核表达的g b f 3 h 蛋白的分子量大小和通过生物信息学预 测的分子量大小相同，重组蛋白将被用来进行体外功能验证。 黄酮醇合成酶直接催化黄酮醇的产生，而黄酮醇及其糖苷则是银杏黄酮类的 主要组成部分。本文采用r a c e 和p c r 方法，获得了g b f l s 基因的全长e d n a 序列及其基因组序列，两者之问的序列比对结果表明，g 6 凡s 基因含有两个外 显子和一个内含子。通过基因组步移的方法获得了g 6 凡s 基因的5 侧翼序列， 其中包括t a t a 盒和胁迫应答元件在内的一些顺式作用元件也被预测和分析。蛋 白序列多重比对结果表明，推导的g b f l s 蛋白和其它植物来源的f l s 蛋白具很 高的相似性。同源性建模产生的g b f l s 三维结构与功能已知的、拟南芥f l s 的 三维结构一样，具有2 - o d d 酶特征型的扭曲的果冻状结构。f l s 系统发生树分 析表明，g b f l s 与其它植物的f l s 具有共同的祖先。s o h e mb l o t 分析表明， g b f l s 基因属于一个多基因家族。r t - p c r 分析表明，g b f l s 基因在根、茎和叶 中的表达水平不同，而且g 6 凡s 基因的表达受伤、低温和u v - b 的诱导；原核 表达的重组g b f l s 蛋白的分子量大小和通过生物信息学预测的分子量大小相 同。w e s t e r n b l o t 分析表明，含有6 h i s 标签的重组g b f l s 蛋白可以和6x h i s 抗 体产生特异的免疫反应。g b f l s 己被构建到植物表达载体p 1 3 0 4 中并用于植物 的遗传转化，试验中已经得到p c r 检测为阳性的烟草植株。 花色素还原酶是合成黄酮类化合物单宁的单体一2 ，3 顺式黄烷醇的一个重要 酶。本文采用r a c e 和p c r 方法，获得了g 醐j r 基因的全长e d n a 序列及其 基因组序列，两者之间的序列比对结果表明，g 柚n r 基因含有五个外显子和四 个内含子。蛋白质序列多重比对结果表明，推导的g b a n r 蛋白和其它植物来源 的a n r 蛋白具有较高的相似性。a n r 系统发生树分析表明，g b a n r 与其它植 物的a n r 具有共同的祖先。s o u t h e r n b l o t 分析表明，g m n r 基因属于一个多基 因家族。r t - p c r 分析表明，g 醐n r 基因在茎和叶中表达。g m 足已被构建到 复日大学博士学位论文银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中重要相关基因的克隆和研究 原核表达载体中并将用于该基因的蛋白表达和纯化研究中。 萜类生物合成m v a 途径的第一个关键步骤是由3 羟基3 甲基戊二酰c o a 还原酶催化的。本文采用r a c e 和p c r 方法，获得了g b h m g r 基因的全长e d n a 序列及其基因组序列，两者之间的序列比对结果表明，g b h m g r 基因含有四个 外显子和三个内含子。蛋白质序列多重比对结果表明，推导的g b h m g r 蛋白和 其它植物来源的h m g r 蛋白具有较高的相似性。h m g r 系统发生树分析表明， g b h m g r 与其它植物的h m g r 具有共同的祖先。s o u t h e r nb l o t 分析表明， 国脚懈足基因属于一个多基因家族。r t - p c r 分析发现，g b h m g r 基因仅在根 中表达。g b h m g r 已被构建到酵母表达载体中并将用于该基因的功能互补试验 中。 甲羟戊酸一5 焦磷酸脱羧酶直接催化萜类生物合成m v a 途径中异戊二烯单体 i p p 的生成。本文采用r a c e 方法，获得了g b m v d 基因的全长e d n a 序列。蛋 白质序列多重比对结果表明，推导的g b m v d 蛋白和其它植物来源的m v d 蛋白 具有较高的相似性。三维结构模型分析表明，g b m v d 形成了一个同源二聚体， 它具有和酵母m v d 相似的p 环结构。m v d 系统发生树分析表明，g b m v d 与 其它植物的m v d 具有共同的祖先。s o u t h e mb l o t 分析果表明，g b m - v d 基因属 于一个多基因家族。r t - p c r 分析发现，( 6 m 矿d 基因在根、茎和叶中组成型低 水平表达。酵母功能互补试验证明，g b m v r ) 能够互补酵母m n l 9 - 3 4 缺失的m v d 的功能。 文中提供的这些基因的研究结果表明，它们与其它同源基因具有很高的相似 性，但是也存在显著的差异，这可能是造成银杏中合成的黄酮和萜类化合物明显 不同于其它植物的主要原因。本文对这些基因的研究为进一步阐明银杏黄酮和萜 类化合物生物合成的分子生物学、分子遗传学和生物化学机理打下了坚实的基 础，同时也为利用代谢工程生产对人体健康有益的银杏黄酮和萜类创造了条件。 关键词 银杏，黄酮类化合物，萜类化合物，生物合成途径，查尔酮合成酶基因，黄烷酮 3 羟化酶基因，黄酮醇合成酶基因，花色素还原酶基因，3 羟基一3 一甲基戊二酰 c o a 还原酶基因，甲羟戊酸5 焦磷酸脱羧酶，分子克隆c d n a 末端侠速扩增， 生物信息学，系统发生树，基因组步移，蛋白表达，遗传互补，功能验证，遗传 转化，代谢工程。 中国图书分类号q 3 7 复旦大学博士学位论文银杏黄酮和萜类化合物生物台成途径中重要相关基因的克隆塑! ! 塞 m o l e c u l a rc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f i m p o r t a n tg e n e si n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e t i c p a t h w a y so f f l a v o n o i d sa n dt e r p e n o i d sf r o mg i n k g ob i l o b al s u p e r v i s o r p h dc a n d i d a t e m a j o r g e n e t i c s p r o f d r k e x n a nt a n g y o n g z h e np a n g s p e c i a l i t y ：p l a n tc e l lm o l e c u l a r g e n e t i c s s t a t ek e yl a b o r a t o r yo fg e n e t i ce n g i n e e r i n g ，i n s t i t u t eo fg e n e t i c s s c h o o lo f l i f es c i e n c e s ，f u d a nu n i v e r s i t y 2 2 0h a n d a nr o a d ，s h a n 【g h a i ，p r c h i n a2 0 0 4 3 3 a b s t r a c t g i n k g ob o l i b al i so f e nc a l l e d “l i v i n gf o s s i l ”i np l a n tk i n g d o m ，a n di t sl e a f e x t r a c tc o n t a i n sm a n ya c t i v ei n g r e d i e n t sf o rh u m a nh e a l t h ，a m o n gw h i c hg i n k g o f l a v o n o i d sa n dt e r p e n o i d sa r et w oo ft h em o s ti m p o r t a n to n e s h o w e v e r , t h eo v e r a l l b i o s y n t h e t i cp a t h w a y so ff l a v o n o i d sa n dt e r p e n o i d si ngb i l o b aa r eu n c l e a ra t m o l e c u l a rg e n e t i cl e v e l i no r d e rt od e e p e nt h er e s e a r c hi n t h i sa r e a ，a n dt ol a ya g r o u n d w o r kf o ri n c r e a s i n gc o n t e n t so fg i n k g of i a v o n o i d sa n dt e r p e n o i d sb yu s i n g b i o e n g i n e e r i n gi n t h en e a rf u t u r e ，c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fs i xk e yg e n e s i n v o l v e di nt h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo ff l a v o n o i d sa n dt e r p e n o i d s ，a r ep r e s e n t e di n t h i st e x tf o rt h ef i r s tt i m e ，a m o n gt h e m ，f i m rg e n e se n c o d i n gc h a l c o n es y n t h a s e ， f l a v a n o n e3 - h y d r o x y t a s e ，a n t h o c y a n i d i nr e d u c t a s ea n df l a v o n o ls y n t h a s ep a r t i c i p a t ei n f l a v o n o i d sb i o s y n t h e s i s ，a n do t h e rt w og e n e se n c o d i n g3 - h y d r o x y 一3 一m e t h y l g l u t a r y l c o e n z y m ea r e d u c t a s ea n dm e v a l o n a t e5 - d i s p h o s p h a t ed e c a r b o x y l a s ei n v o l v ei nm v a p a t h w a yi nt e r p e n o i d sb i o s y n t h e s i s c h a l c o n es y n t h a s e ( c h s ) c a t a l y z e sg l ef i r s tc o m m i t t e ds t e pi nf l a v o n o i d s b i o s y n t h e s i s 1 1 1 ef u l l l e n g t he d n ao f 删g e n ef r o mgb i l o b af d e s i g n a t e da s g b c h s ) a n di t sg e n o m i cd n as e q u e n c ew e r eo b t a i n e db yu s i n gr a c ea n dp c r t h ec o m p a r i s o nb e t w e e ne d n aa n dg e n o m i cd n a s e q u e n c e sr e v e a l e dt h a tg b c h s w a sc o m p o s e do ft w oe x o n sa n do n ei n t r o n ，o n eo ft h et y p i c a lf e a t u r e so fc h sg e n e s g b c h sw a sf o u n dt oh a v ee x t e n s i v eh o m o l o g yw i t ho t h e rp l a n tc h sp r o t e i n sv i a m u l t i p l ea l i g n m e n t s t h ea c t i v e s i t e so ft h ec o ab i n d i n g c o u m a r o y lp o c k e ta n d e y c l i z a t i o np o c k e ti np u t a t i v eg b c h sp r o t e i nw e p et h es a m ea si nt h a to fm e d i c a g o s a t i v a ，t h ec r y s t a l l o g r a ma n df u n c t i o no fw h i c hh a sb e e ne l u c i d a t e d h o m o l o g y b a s e d l v 复旦火学博士学位论文银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中重要相关基因的克隆和研究 m o l e c u l a rm o d e l i n gr e v e a l e dt h a tt h e3 dm o d e lo fg b c h ss t r o n g l yr e s e m b l e dt h a to f m s a t i v a ( m s c h s 2 ) p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tg b c h sh a dc l o s e r r e l a t i o n s h i pw i t hc h s sf r o mg y m n o s p e r mp l a n ts p e c i e st h a nf r o mo t h e rp l a n ts p e c i e s s o u t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg b c h s b e l o n g e dt oam u l t i g e n ef a m i l y r t - p c r a n a l y s e sr e v e a l e dt h a tg b c h se x p r e s s e dd i f f e r e n t i a l l yi nt h er o o t ，s t e ma n dl e a f , a n d t h ee x p r e s s i o nw a si n d u c e db yu v - ba n dw o u n d i n gt r e a t m e n t s t h eg b c h sp r o t e i n w a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nec o l iw i t ht h e ：m o l e c u l a rw e i g h tb e i n gs i m i l a rt ot h a t o ft h ep r e d i c t e db yb i o i n f o r m a t i c s w e s t e mb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h er g b c h s c o n t a i n i n gh i s t a gh a ds p e c i f i ci m m u n ea c t i 、_ r i t yw i t ha n t i h i sa n t i b o d i e s t h ep l a n t e x p r e s s i o nv e c t o rp 1 3 0 4 - g b c h sc o n t a l m n gg b c h sw a sa l s oc o n s t r u c t e df o rp l a n t t r a n s f o r m a t i o n f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ( f 3 h ) a c t i v i t ) ri sn e c e s s a r yf u rt h eb i o s y n t h e s i so f f l a v o n o i d s t h ef u l l l e n g t he d n aa n dg e n o m i cd n a s e q u e n c e so ff 3 hg e n ew e r e i s o l a t e df r o mgb i l o b a ( d e s i g n a t e da sg b f 3 h ) u s i n gr a c ea n dp c r t h e c o m p a r i s o nb e t w e e ne d n a a n dg e n o m i cd n a s e q u e n c e sr e v e a l e dt h a tg b f 3 hw a s c o m p o s e do ft h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n s t h ed e d u c e dg b f 3 hp r o t e i ns h o w e dh i g h i d e n t i t i e st oo t h e rp l a n tf 3 h sv i am u l t i p l ea l i g n m e n t s t h ec o n s e r v e da m i n oa c i d s l i g a t i n gf e r r o u si r o na n dr e s i d u e sp a r t i c i p a t i n gi n2 - o x o g l u t a r a t eb i n d i n g ( r x s ) w e r ei d e n t i f i e di ng b f 3 ha tt h es i m i l a rp o s i t i o n sl i k eo t h e rf 3 h s h o m o l o g y b a s e d s t r u c t u r em o d e l i n gs h o w e dt h a tg b f 3 hm o d e lh a dad i s t o r t e dj e l l yr o l li nt h ee n z y m e c o r ew h i c hc o n s i s t e do f d s h e e t ，at y p i c a l s t r u c t u r es h a r e d b y a l l 2 - o x o g l u t a r a t e d e p e n d e n td i o x y g e n a s e si n c l u d i n gf 3 h s p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i s r e v e a l e dt h a tg b f 3 hs h a r e dt h es a m ea n c e s t o ri ne v o l u t i o nw i t ho 山e rf 3 h s s o u t h e r n b l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg b f 3 hb e l o n g e dt oam u l t i g e n ef a m i l y r t - p c ra n a l y s i s r e v e a l e dt h a tg b f 3 h g e n ee x p r e s s e di ns t e ma n dl e a f , w i t ht h eh i g h e s te x p r e s s i o ni n l e a f t h eg b f 3 hp r o t e i nw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nec o l iw i t ht h em o l e c u l a r w e i g h tb e i n gs i m i l a rt ot h a to ft h ep r e d i c t e db yb i o i n f o r m a t i c s t h er o b f 3 hw i l lb e u s e df o ri nv i t r of u n c t i o n a l i d e n t i f i c a t i o ni nt h ef u t u r e f l a v o n o ls y n t h a s e ( f l s ) d i r e c t st h es y n t h e s i so ff l a v o n o l s ，a n df l a v o n o l sa n d t h e i rg l u c o s i d e sa r em a j o ri n g r e d i e n t so fgb i l o b al e a fe x t r a c t t h ef u l l l e n g t he d n a a n dg e n o m i cd n a s e q u e n c e so ff l sg e n ew e r ei s o l a t e df r o mgb i l o b au s i n gr a c e a n dp c r n ec o m p a r i s o nb e t w e e ne d n aa n dg e n o m i cd n a s e q u e n c e sr e v e a l e dt h a t g b f l sw a sc o m p o s e do ft h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n s t h e5 f l a n k i n gr e g i o no f g b f l sw a si s o l a t e db yg e n o m ew a l k i n gt e c h n i q u e ，a n ds o m em a i nc s a c t i n g v 复旦大学博士学位论文银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中重要相关基因的克隆和研究 e l e m e n t si n c l u d i n gt a t ab o xa n ds t r e s s - r e s p o n s i v e n e s se l e m e n t sw e r ep r e d i c t e da n d a n a l y z e d m u l t i p l ea l i g n m e n ta n a l y s i ss h o w e dt h a tg b f l sh a di d e n t i t yt ot h o s eo f o t h e rp l a n ts p e c i e s h o m o l o g y b a s e ds t r u c t u r em o d e l i n gs h o w e dt h a tg b f l s3 d m o d e lh a dad i s t o r t e dj e l l yr o l li nt h ee n z ) 7 m ec o r ew h i c hc o n s i s t e do fp - s h e e t ，a t y p i c a ls t r u c t u r es h a r e db ya l l2 - o x o g l u t a r a t e d e p e n d e n td i o x y g e n a s e si n c l u d i n gf l s s p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tg b f l ss h a r e dt h es a m ea n c e s t o rw i t ho t h e r f l s s s o u t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg b f l sg e n eb e l o n g e dt oam u l t i g e n e f a m i l y r t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tg b f i se x p r e s s e di nr o o t ，s t e ma n dl e a fa t d i f f e r e n tl e v e l sa n dt h ee x p r e s s i o no fg b f l sw e r ei n d u c e db yw o u n d i n g ，c o l da n d u v - bt r e a t m e n t s t h eg b f l sp r o t e i nw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nec o l iw i t ht h e m o l e c u l a rw e i g h tb e i n gs i m i l a rt ot h a to ft h ep r e d i c t e db yb i o i n f o r m a t i c s w e s t e r n b l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h er g b f l sc o n t a i n i n gh i s t a gh a ds p e c i f i ci m m u n e a c t i v i t y w i t ha n t i h i sa n t i b o d i e s t h e p l a n te x p r e s s i o n v e c t o r p 1 3 0 4 g b f l s c o n t a i n i n gg b f l sw a sa l s oc o n s t r u c t e df o rp l a n tt r a n s f o r m a t i o n a n t h o c y a n i d i nr e d u c t a s e ( a n r ) i sa ni m p o r t a n te n z y m ei n v o l v e di nt h e b i o s y n t h e s i so f2 ，3 一t r a l q s - f l a v a n - 3 ，o l t h em o n o m e ro fc o n d e n s e dt a n n i n si np l a n t s t h ef u l l l e n g t he d n aa n di t sg e n o m i cd n a s e q u e n c eo fa n rg e n ef r o mgb i l o b a ( d e s i g n a t e d a sg b a n r ) w e r ei s o l a t e d u s i n gr a c ea n dp c r t h ec o m p a r i s o n b e t w e e nc d n aa n dg e n o m i cd n a s e q u e n c e sr e v e a l e dt h a tg b a n rh a df i v ee x o n s a n df o u ri n t r o n s t h ed e d u c e dg b a n ra m i n oa c i ds e q u e n c eh a d h i g hi d e n t i t yt oo t h e r p l a n ta n r sv i am u l t i p l ea l i g n m e n t s 。p h y l o g e n e t i et r e ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tg b a n r s h a r e dt h es a m ea n c e s t o rw i t ho t h e rk n o w na n rp r o t e i n s s o u t h e r nb l o ta n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tg b a n rb e l o n g e dt oas m a l lm u l t i g e n ef a m i l y r t - p c ra n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tg b a n re x p r e s s e di ns t e ma n dl e a f g b a n rw a sc o n s t r u c t e di n t oec o l i e x p r e s s i o nv e c t o ra n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dh a r b o r i n gg b a n rg e n ew i l lb eu s e d f o rt h ef u r t h e rp r o t e i ne x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n 。 t h e3 - h y d r o x y 一3 一m e t h y l g l u t a r y lc o e n z y m ear e d u c t a s e ( h m g r ) c a t a l y z e st h e f i r s tc o m m i t t e ds t e pi nt h em v ap a t h w a yf o rb i o s y n t h e s i so ft e r p e n o i d s t h e f u l l - l e n g t he d n aa n di t sg e n o m i cd n as e q u e n c eo fh m g rg e n ef r o mgb i l o b a ( d e s i g n a t e da sg b h m g r ) w e r ei s o l a t e du s i n gr a c ea n dp c r t h ec o m p a r i s o n b e t w e e ne d n aa n dg e n o m i cd n a s e q u e n c e sr e v e a l e dt h a tg b h m g rh a df o u rc x o n s a n dt h r e ei n t r o n s t h ed e d u c e dg b h m g ra m i n oa c i ds e q u e n c eh a dh i g hi d e n t i t yt o o t h e rp l a n th m g r sv i am u l t i p l ea l i g n m e n t s p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a t g b h m g rs h a r e dt h es a m ea n c e s t o rw i t ho t h e rk n o w nh m g r p r o t e i n sf r o mp l a n t 复旦大学博士学位论文银杏黄酮和萜类化合物生物台成途径中重要相关基因的克隆和研究 s p e c i e s ，s o u t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg b h m g rb e l o n g e dt oa s m a l lm u l t i g e n e f a m i l y r t - p c ra n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg b h m g re x p r e s s e di nr o o t g b h m g rw a s c o n s t r u c t e di n t oy e a s te x p r e s s i o nv e c t o ra n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dh a r b o r i n g g b h m g rg e n ew i l lb eu s e df o rf u n c t i o ni d e n t i f i c a t i o nb yy e a s tc o m p l e m e n t a t i o n a s s a y m e v a l o n a t ed i p h o s p h a t ed e c a r b o x y l a s e ( m v d ) c a t a l y z e st h ec o n v e r s i o no f i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t e ( i p p ) ，w h i c hi sak e ys k e l e t o nf o rn u m e r o u sf u n c t i o n a l l y i m p o r t a n ts e c o n d a r ym e t a b o l i t e s af u l l l e n g t he d n ao f m v dg e n ew a si s o l a t e df r o m gb i l o b a ( d e s i g n a t e da sg b m v d ) u s i n gr a c e t h ed e d u c e dg b m v dp r o t e i nh a d h i g hs i m i l a r i t yt om v d s f r o mo t h e rp l a n ts p e c i e s t h e3 ds t r u c t u r em o d e l i n gs h o w e d t h a tt h e3 dm o d e lo fg b m v dw a sas y m m e t r i ch o m o d i m e rw i t has i m i l a rpl o o pa s t h ec o u n t e r p a r to fy e a s t p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tg b m v ds h a r e dt h e s a r n ea n c e s t o rw i t hm v d sf r o mo t h e rp l a n ts p e c i e s s o u t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e d t h a tg b m v db e l o n g e dt oas m a l lm u l t i g e n ef a m i l y r t - p c ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a t g b m v d e x p r e s s e dc o n s t i t u t i v e l yi nr o o t ，s t e ma n dl e a f f u n c t i o n a lc o m p l e m e n t a t i o n o fg b m v di na nm v d - d e f i c i e n ts a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a es t r a i nm n l 9 3 4 ( e r g l 9 0 ) c o n f i r m e dt h a tg b m v dc o u l dc o m p l e m e n tt h ef u n c t i o no ft h em v d d e f i c i e n ty e a s t s t r a i n a si n d i c t e di nt h i st e x t ，t h ea b o v e m e n t i o n e dg e n e sa r eq u i t ed i f f