（细胞生物学专业论文）青岛文昌鱼弹性蛋白酶基因的鉴定、表达分析和功能研究.pdf

中国海洋大学硕士学位论文 青岛文昌鱼弹性蛋白酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 摘要 弹性蛋白酶( e l a s t a s e ，e l a s ) 是丝氨酸蛋白酶家族的一员，以水解不溶性 弹性硬蛋白( e l a s t i n ) 为特征，具有广泛的水解蛋白活性。已在包括无脊椎动物 和脊椎动物的很多物种中被鉴定，但是在文昌鱼中对于此类蛋白功能却了解甚 少。文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物，一直被认为是研 究脊椎动物起源和进化的模式动物。本文从青岛文昌鱼( b r a n o h i o s t o m a b e l c h e r i ) e d n a 文库中，分离出具有完整编码框的e a s = n 因( b b e l a s ) ，并对其 结构、进化、表达和功能进行了研究。 首先，从文昌鱼c d n a 文库中克隆到全长为9 8 7b p 的b b e l a sc d n a ，其最大开 放阅读框编码2 7 7 个氨基酸的蛋白质，理论分子量为2 9k d a ，经分析发现该蛋 白质有一长为1 6 个氨基酸的信号肽。该e d n a 编码的蛋白( b b e l a s ) 同脊椎动物 的e l a s 一样， 在氨基酸序列的3 1 2 6 7 位具有一个完整的t r y ps p c 结构域，具有 高度保守的g d s g g p l 序列和催化三联体结构位点h i s 7 4 a s p l 2 7 _ s e r 2 2 2 ，并且在氨 基酸序列的5 9 位、7 5 位、1 6 1 位、1 9 1 位、2 0 7 位、2 1 8 位、2 2 8 位和2 4 8 位具 有8 个相当保守的半胱氨酸。将b b e j a s 同其他物种e l a s 蛋白构建进化树进行系 统进化分析发现，b b e l a s 与无脊椎动物的e l a s 聚为一支，且位于脊椎动物e l a s 的根部，迸一步表明了文昌鱼在进化上的地位。 其次，我们还研究了e l a s 基因在文昌鱼中的表达情况。n o r t h e r nb l o t t i n g 和切片原位杂交表明，b b e l a s 在成体组织中肠中的表达量较高，具有组织特异 性。 为了研究b b e i a s 的功能，我们构建原核表达载体，导入ec o l i 诱导表达。 b b e l a s 在包涵体中大量表达；经透析复性后，纯化出重组蛋白b b e l a s 。用重组 蛋白作用于弹性蛋白酶特异性底物n - s u c c i n y l a l a a l a a l a - p n i t r o a n i l i d e ，发现它能够降解该底物，用该底物对酶活进行了测定，得到复性后的重组蛋 白活性为0 2 2 0 0 2u m g 。此外，我们用不同的蛋白酶抑制剂对重组蛋白 b b e l a s 对n s u c c i n y l a 1 a a 1 a a 1 a p n i t r o a n i l - i d e 的酶活抑制性进行了测 定，发现专一性抑制丝氨酸蛋白酶的p m s f 和专一性抑制弹性蛋白酶的 i v 中国海洋大学硕士学位论文 e 1 a s t i t a n a l 对该酶有强抑制性。进一步说明重组蛋白为丝氨酸蛋白酶家族的 弹性蛋白酶。 关键词：文昌鱼；弹性蛋白酶；胰脏；表达；功能分析 中国海洋大学硕士学位论文 c h a r a c t e riz a tio n ，e x pre s sio na n df u n c tio n aia n aiy siso f ela s t a s eg e n eina m p l lio x u s 厂a n c t 7 i o s t o m ad e i c ，7 e f ， ri o ， ， ， t si n e t a u e n s e a b s t r a c t e l a s t a s e ( e l a s ) b e l o n g st ot h ef a m i l yo fs e r i n ep r o t e i n a s e ，a n di ti su n i q u ea m o n g p r o t e i n a s e si nh a v i n gt h ea b i l i t yt or a p i d l yh y d r o l y s ee l a s t i n i ti sa l s oa b l et oh y d r o l y - s ev a r i o u so t h e rp r o t e i n sl i k eh a e m o g l o b i n ，c a s e i na n df i b r i n e l a si sw i d e l y d i s t r i b u t e di no r g a n i s m sr a n g i n gf r o mi n v e r t e b r a t e st ov e r t e b r a t e s l i t t l ei sk n o w nt o d a t ea b o u te l a si nt h ea m p h i o x u sb r a n c h i o s t o m ab e l c h e r la m p h i o x u so rl a n c e l e t ，a c e p h a l o c h o r d a t e ，h a sl o n gb e e nr e g a r d e da st h el i v i n gi n v e r t e b r a t em o s tc l o s e l y r e l a s t e dt ot h ep r o x i m a t ei n v e r t e b r a t ea n c e s t o ro fv e r t e b r a t e s i nt h i sp a p e r , w er e p o r t e x p r e s s i o na n df u n c t i o n a la n a l y s i so fe l a sg e n ei na m p h i o x u sb b e l c h e r i t s i n g t a u e n s e t h ec d n ae n c o d i n gb b e l c h e r ie l a s , b b e l a s , o b t a i n e df r o mt h eg u tc d n a l i b r a r yo fb r a n c h i o s t o m ab e l c h e r ii s9 8 7b pl o n g i t sl o n g e s to r fe n c o d sa2 7 7 a m i n oa c i d sl o n gp r o t e i nw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so fa p p r o x i m a t e l y2 9k d a ， a n di th a sa16a m i n oa c i d sl o n gn t e r m i n a ls i g n a lp e p t i d e l i k eo t h e re l a s ，b l a s t p s e a r c h i n ga tn c b is h o w e dt h a tt h ed e d u c e dp r o t e i nb b e l a sh a dat r y p _ s p cd o m a i na t r e s i d u a lp o s i t i o n s31 - 2 6 7 ，w i t hah i g h l yc o n s e r v e ds e q u e n c eg d s g g p la n da 1 一1 1 c a t a l y t i ct r i a dh i s7 q a s p i z i s e r z z z ，a n de i g h tc y s t e i n er e s i d u e sa tp o s i t i o n s5 9 ，7 5 ，161 ， 191 ，2 0 7 ，218 ，2 2 8a n d2 4 8 ，t h a ta r et y p i c a lo fe l a s t a s e s a l i g n m e n to fw i t he l a so f o t h e rs p e c i e sr e v e a l e dt h a tt h eb b e l a sc l u s t e r e dw i t ht h ee l a so fi n v e r t a b r a t e sa n da t t h er o o to fv e r t a b r a t e s ，c o n f o r m i n gt h ei m p o r t a n tp o s i t i o no f a m p h i o x u si ne v o l u t i o n n o r t h e r nb l o t t i n g ，i n s i t uh y b r i d i z a t i o nh i s t o c h e m i s t r yd e m o n s t r a t e dt h a tb b e l a s t r a n s c r i p tw a sa b u n d a n ti nt h em i d g u t f o ri n v e s t i g a t i n gt h e f u n c t i o no fb b e l a s , t h e r e c o m b i n a m tb b e l n sh a sb e e nc o n s t r u c t e d ，t r a n s f e r e dt oe c o l ia n di n d u c e dt o e x p r e s s e d b b e l 口se x p r e s s e di ni n s o l u b l eb o d yw i t haa b u n d a n ta m o u n t w ed e n a t u r e d t h ei n s o l u b l eb o d yo fb b e l n sa m dp u r i f i e di tu s i n gt h ee l a s t a s es p e c i f i cs u b s t r a t e 中国海洋大学硕士学位论文 n - s u c c i n y l - a l a - a i a - a l a - p n i t r o a n i l i d e w ed e t e c t e dt h e e n z y m ea c t i v i t y o f r e c o m b i n a m tb b e l a s ，a n dg o ta ne n z y m ea c t i v i t yo f0 2 2 - - l0 0 2u m g ；a f t e rt h a t ， t h ee f f e c to fs o m e p r o t e i n i n h i b i t o r so nt h er e c o m b i n a r n tb b e l a st o n - s u c c i n y l 一舢a 一砧a - a l a p n i t r o a n i l i d ew a ss t u d i e d ，a n di ts h o w st h a tp m s fa n d e l a s t i n i t a l ，t h ei n h i b i t o rs p e c i a lt ot h es e r i n ep r o t e i n a s ea n de l a s t a s e ，h a v eas t r o n g i n h i b i t i o nt ot h er e n a t u r e dp r o t e i n , a n dt h a tf u r t h e ri n d i c a t e st h er e c o m b i n a m tb b e l a s i sab n do fe l a s t a s e sb e l o n g e dt ot h es e r i n ep r o t e i n a s es u p e r f a m i l y k e y w o r d s ：a m p h i o x u s ；e l a s t a s e ；p a n e r e a s ；e x p r e s s i o n ；f u n t i o n a la n a l y s i s 中国海洋大学硕士学位论文 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 洼! 垫逡直基丝壶墨挂剔直明的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： l l l 导师签字：掀 l 一， 一飙矽p 邮编 电话： 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基冈的鉴定、表达分析和功能研究 1 前言 第一章文献综述 自上世纪9 0 年代以来，对脊椎动物起源与进化问题的研究成为分子发 育生物学和进化生物学研究的热点。而原索动物文昌鱼在这方面发挥极其重 要而又独特的作用n 2 3 ，正如达尔文在他的著名著作物种起源中所指出 的：文昌鱼的发现使人们看到了五亿年前脊椎动物的模样。 文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a ) 作为头索动物的代表，被认为是当今研究脊椎 动物发育、起源和进化的模式生物口1 ，文昌鱼的形体结构( b o d yp l a n ) 和胚胎发 生与无脊椎动物有许多相似之处，同时，又与脊椎动物有许多重要的共同特征。 这些共同特征证明脊椎动物和文昌鱼在早期形态发生的过程中有共同的发育模 式h 1 。文昌鱼被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物之一，从形态学和 解剖学研究上看，文昌鱼可能是脊椎动物始祖的现存代表璐1 ，分子进化研究的 证据也揭示出头索动物是脊椎动物的姊妹类群嘲。 在脊椎动物中，胰脏是一个具有内分泌和外分泌双重功能的重要器官，对该 器官进化起源的研究发现，在原索动物肠道中散乱地分布着具有类似于胰脏分泌 细胞的外分泌细胞和内分泌细胞，但尚未形成有功能的组织结构。弹性蛋白酶在 脊椎动物中主要是由胰脏的腺细胞分泌的一种肽链内切酶，属于丝氨酸蛋白酶 家族，以水解不溶性弹性硬蛋白为特征，能专一性裂解丙氨酸、甘氨酸、丝氨 酸等小的中性氨基酸形成的肽键。作为一个主要由胰腺细胞分泌的丝氨酸蛋白 酶，对弹性蛋白酶的研究将对探讨胰脏进化起源有十分重要的科研价值。 综上所述，文昌鱼代表着从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要 的过渡阶段。弹性蛋白酶是一个由胰脏腺细胞合成分泌的具有一定组织特异性 的蛋白酶。对文昌鱼的弹性蛋白酶进行进化和功能方面的研究将对探讨胰脏进化 起源有十分重要的科研价值。 1 1 文昌鱼生物学研究进展 1 1 1 文昌鱼概况 青岛文吕鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 文昌鱼最早是由德国动物学家p s p a l l a s 于1 7 7 4 年首次报道的，之后意 大利动物学家0gc o s t a 于1 8 3 4 年将其定名为b r a n c h y o s t o m a 。1 8 3 6 年英国 的w y a r r e l l 给出了它的普通英文名a m p h i o x u s l a n c e o l a t u s “1 。在中国，s f l i q h t 早在1 9 2 3 年就对厦门文昌鱼进行了报道“。其后，金德祥教授对厦门文昌 鱼资源进行了详尽的考察，并将厦门文昌鱼正式定名为b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r ig r a y 。1 。早在1 9 世纪各国的研究人员就对文昌鱼的胚胎发育进行了研究。 2 0 世纪9 0 年代，随着分子生物学技术的出现，对文昌鱼的研究进入分子生物学 水平”“。 文昌鱼身体细长而侧扁，全身粉红，呈半透明状，有背鳍、腹鳍和尾鳝。其 中枢神经系统仅由一根中空的背神经管组成，其前端略微膨大，形成脑泡，并无 明显分区形成脊椎动物的前脑、中脑和后脑，仅是脑的雏形”3 。它没有骨质的 骨骼只有一条纵贯全身的脊索作为支柱。文昌鱼有较为复杂的滤食系统和消化 系统，在水流经鳃裂到围鲤腔，再从围鳃腔排出体外的过程中，就可完成赖以生 存的呼吸和摄食两大基本生理功能( 图卜1 ) ”8 。文昌鱼性成熟时卵巢呈黄色， 精巢呈乳白色( 图i - 2 ) 。卵巢和精巢都没有生殖导管，精、卵释放时是冲破鳃腔 壁通过围鳃腔经腹孔排出体外，在海水中受精发育。经过c o n k l i n 和章第周先生 等的研究，文昌龟的胚胎发育概况基本明确“；。全世界现存头索动物亚门有 2 9 种“9 驯。我国的文昌鱼有二种，分别是；厦门文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a b e j c h e r it r a y ) 和青岛文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s j 坩a u 鲥s 曲”“”1 。 田1 - 1 文昌鱼的解剖图。o r a lc i r r i ，口笠触须；p h a r y n g e a lg i l ls l i t s ，咽鳃裂；h e r v e c o r d ，神经管； n o t o c h o r d ，脊索g o n a d ，生殖腺：b o d y - - w a l lm u s c l e s ，体壁肌肉 i n t e s t i n e ，肠：a t r i a lc a v i t y ，用鳃腔：a t r i o p r e 围鳃腔孔；a n u s ，舡门。 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 f i g1 吨t h es e x u a l l ym a t u r e da m p h i o x u s ( b r a n c h i o s t o m ab e ) c h e r it s i n g t a u e n s 0 图卜2 性成熟的青岛文昌鱼 i1 3 文昌鱼进化发育生物学研究进展 为探明脊椎动物是如何起源于无脊椎动物的，到目前已对文昌鱼这一在进 化上极其重要的物种在形态结构、生殖发育、生理功能以及分子生物学方面进 行了大量研究。 在形态结构方面，文昌鱼的成体结构与脊椎动物有相似之处但又具有不同 的特征o “。在生理功能方面，文昌鱼的哈氏窝被认为与脊椎动物脑垂体同源， 内柱与脊椎动物甲状腺同源，肝盲囊与脊椎动物肝脏同源，并针对这些课题从解 剖学、生理学、组织化学以及分子生物学等方面开展了相关的研究2 3 删。在分 子发育生物学方面，w 1 1 1 i a m s 等对文昌鱼a m p h i o t x 基因与脊椎动物的o t x 基 因表达图式进行了比较研究，认为文昌鱼单个的眼点和脊椎动物成对的眼在进化 上是同源的。h o l l a n d 等对文昌鱼a m p h i d l 基因的研究发现其主要在文昌鱼脑 泡的前3 4 表达，提示我们文昌鱼神经营的这一表达部分与有头类的前脑是同 源的。i a z z a r o 和y e n k a t e s h 等利用与脊椎动物n k x 2 - 1 和p a x 的同源基因 a m p h i n k 21 和砌酌舟j 2 佑席进行了研究，进一步证明了文昌鱼内柱和脊椎动 物甲状腺之间的对应关系”“。此外，p a n o p o u l o u 等对文昌鱼的a m p h i 删翟月 基因进行了研究，发现a m p h i 舶胸的表达可以在除背部神经板之外所有的 外胚层中检测到，这表明建立文昌鱼背腹轴的形态发牛系统是作用在外胚层的。 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 对文昌鱼肋基因的研究表明，文昌鱼肋基因表达与脊椎动物的s h h 相似， 可能代表着肋基因的原始功能口3 嗡1 。 综上所述，从文昌鱼经典形态学、生殖发育生物学、生理生化功能以及分 子发育生物学的比较研究上看，文昌鱼代表着从无脊椎动物到脊椎动物进化过 程中一个重要的过渡阶段，被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物之 一，是脊椎动物始祖的现存代表汹3 。 1 2 弹性蛋白酶的研究进展 1 2 1 弹性蛋白概述 弹性蛋白( e l a s t i n ) 是一种由丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等非极性氨基酸 残基交联而成的网状结构，它可以耐受酸碱处理，并能抵抗一般蛋白酶的消 化。在一些文献中，弹性蛋白与弹性纤维被混淆，严格来说，弹性纤维 ( e l a s t i cf i b e r s ) 是由弹性蛋白( e l a s t i n ) 和微纤维( m i c r o f i b r i l s ) 组成。弹性 蛋白是弹性纤维的主要组成成分，是它使弹性纤维有弹性。它由两种不同的分子 组成，一种是疏水短肽赋予分子以弹性，另一种短肽为富含丙氨酸和赖氨酸残基 的q 螺旋，负责在相邻分子间形成交联( 图1 3 ) 。 f i g1 3t h es t r u c t u r em o d e lo fe l a s t i cf i b e r 图1 - 3 弹性蛋白纤维结构模型 维纤维是一种1 0 2 0 n m 的单纤维，在弹性纤维生成和成熟时起作用。在组成 4 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 上，维纤维富含赖氨酸和一些酸性氨基酸，而弹性蛋白却相反，几乎不含有酸 性氨基酸”1 。到目前为止，仅在斑马鱼和蛙中报道有两个编码弹性蛋白的基因 “，在其它大多数动物中，弹性蛋白仅由一个基因编码。如在哺乳动物中单 一的一个弹性蛋白基因编码一个大小为6 0 7 0k d a 的弹性蛋白原。所有物种的弹 性蛋白原都有一个特征性结构，即含有一系列的富丙氨酸残基的a 螺旋和疏水 序列相间交替排列的的交联基序( 图卜4 ) 。在胞外，8 0 以上的赖氨酸残基在 分子内部或与另外一个分子形成交联，正是由于这种交联使弹性蛋白原形成多 聚体并具有了弹性。弹性蛋白的氨基酸组成类似胶原，也富于甘氨酸及脯氨 酸，但很少含羟脯氨酸，不含羟赖氨酸，没有胶原特有的g l y x - y 序列，故不形 成规则的三股螺旋结构。弹性蛋白分子间的交联比胶原更复杂，其交联反应是由 一类能氧化侧链上的e 一氨基的氧化酶起始的“，之后被氧化的赖氨酸残基就 可以通过s h i f f 碱反应将交联反应进行下去，形成一种网状结构“”( 图卜5 ) 。 2 4 b81 0 住t 41 61 8丝斟鸵舯 k p c r o s s i l n k i n g i k a c r o s s i i n k i n g h y d r o p h 。b i c c - t e r m i n a ld o m a i n a l t e r n a t i v e l ys p l i c e de x o n f i g 1 4s c h e m a t i cd i a g r a mo fe x o na n dd o m a i ns t l n j c 扎r eo fh u m a nt r o p o e l a s t i n c o l o r e ds q u a r e sr e p r e s e n tl y s i n e c r o s s l i n k i n gd o m a ir st h a tc o n t a i np r o l i n e s ( k p ) o ra r ee n r i c h e di na l a n i n e s ( k a ) w h l t es q u a r e sa r eh y d r o p h o b ics e q u s n c e s 圈卜4 人类弹性蛋白原的外显子与结构域示意闰。红色的方框表示富含脯氩酸或丙氩酸的 赖氨酸交联域。白色方框表示疏水序列。 p 占r 上j 上 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 图1 - 5 弹性蛋白中赖氨酸侧链的交联反应 弹性蛋白在所有的脊椎动物中都有发现，而在无脊椎动物少见报道。通常认 为，弹性蛋白是脊椎动物所特有的，无脊椎动物体内不存在该蛋白h ，而王嫣 ( 2 0 0 2 ) 等利用组织化学的方法在青岛文昌鱼体内检测到有类似弹性蛋白的成分 存在h 8 l ，这提示我们弹性蛋白有可能在最接近脊椎动物的头索动物中存在。 1 2 2 脊椎动物胰脏进化及弹性蛋白酶研究进展 1 2 2 1 脊椎动物胰脏进化 在高等脊椎动物中，胰脏由具有不同功能的两部分组成：分泌消化酶到消化 道中消化食物的外分泌部和分泌激素到血液循环系统对机体生理起调节作用的 内分泌部。在构成上，外分泌部占胰脏体积的大部分，只含有两种类型的细胞， 腺细胞和导管细胞。内分泌部只占胰脏的1 - 2 ，含有5 种不同类型的细胞，分 别产生不同种类的激素：q 细胞分泌胰高血糖素；b 细胞分泌胰岛素； p p ( p a n c r e a t i cp o l y p e p t i d e ) 细胞分泌胰多肽；6 细胞分泌生长激素抑制素； e 细胞是近年来刚发现的一种细胞，主要生成一种蛋白激素g h r e l i n ，它能够对 食欲、进食进行调节n 引，与当今社会所关注的肥胖症有一定联系。 基于胰脏如此重要的功能，在上世纪8 0 年代就对胰脏的进化，在形态学和 免疫组织化学等方面进行了较深入的研究h 卜5 2 3 。胰脏在脊椎动物中是作为一个具 有外分泌和内分泌双重功能的器官存在的。在对不同脊椎动物的胰脏组织结构 进行比较分析发现，两栖类，爬行类，鸟类以及哺乳类拥有相同的胰脏解剖学结 构璐p 制。但不同种类的鱼在胰脏的组成及结构上差别较大，表现出了胰脏的进 化趋势m 4 1 。如在大西洋八目鳗( m y x i n eg l u t i n o s a ) 中，最原始形式的胰脏已经出 现，它由胆管和胰岛素生成细胞组成小叶状的细胞囊，并与一些生长激素抑制素 生成细胞相结合，在肠管已经检测不到它的存在田5 删。这种胰腺只有内分泌功 能，没有外分泌功能，没有具有分泌消化酶的腺细胞。另一方面，最近的研究表 明，虽然胰岛素生成细胞已经在肠管中消失，但在八目鳗的胆管中有大量的胰岛 素生成细胞存在。最原始的具有外分泌功能的胰脏是在软骨鱼类( h o l o c e p h a l a n c a r t i l a g i n o u sf i s h ) 中出现的，一种由外分泌细胞所组成的腺体状结构已经在该类 6 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 鱼体内存在，并且有一条胰腺导管通向肠道。其中细胞岛细胞可以分泌三种不同 类型激素：胰岛素，生长激素抑制素和胰高血糖素“”。最能代表高等脊椎动物 胰脏结构和功能的胰脏是高等软骨鱼类( s h a r k sa n dr a y s ) ，在这些物种的胰腺中， 已能发现内分泌细胞岛有四种产生激素的细胞，包括p p 细胞。在结构上其内腔 的细胞开始弯曲折叠形成胰腺的管状结构1 。在真骨鱼类中，四种类型的内分泌 细胞在结构上存在于不连续的细胞岛中，这些细胞岛被称作b r o c k m a r m b o d i e s 。 能产生g h r e l i n 的e 细胞出现及进化目前尚未见报道，仍需进行研究分析。在 硬骨鱼类中，除了胰岛素，其它具有胰脏特征的胰脏分泌的激素多肽也能在整个 肠道中被检测到。而对于胰高血糖素基因，对激素原不同的酶切方式会产生两种 不同的胰高血糖素多肽，g l p _ 1 和g l p2 ，其中前一种与胰高血糖素一样，与 生物抗性有关，能在摄食时刺激胰岛素的分泌”9 训。然而，在鱼类之前的原索动 物中，如文昌鱼，仅在肠道中具有类似于胰脏功能的内分泌细胞，这些细胞散乱 地分布于文昌鱼肠管中，尚未形成有功能的组织结构”“( 图卜6 ) 。由此可见，脊 椎动物的胰脏起源于原索动物的肠道，此后逐步在鱼类中形成了有结构的组织器 官，并进而进化成为具有内分泌和外分泌双重功能的高等脊椎动物胰脏。 ab c 陵目；缝 产8 。瓣皿 f i g u r e 卜6e v o l u t i o no fp a n c r e a t i ci s l e t s ( t o m a sp i e l e ra n dy o n g l o n gc h e n 2 0 0 6 ) ( ) a “p h l o x u s ( p r o t o c h o r d a t e ) ( b ) a t l a n t l ch a g f ls h ( c ) s h a r k s ( p l a g i o s t o m i a n c a r d l a g i n o u sf i s h ) 图卜6 胰脏的进化( a ) 文昌鱼( 原索动物) 。( b ) 人西洋八目鳗。( c ) 鲨鱼( 软骨鱼类) 另一方面，在组成及功能上胰脏的外分泌部占胰脏的大部分，且胰脏外分 泌部只含有两种类型的细胞，腺细胞和导管细胞。其巾腺细胞能分泌不同种类的 目w目蠢秣髂薹 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基冈的鉴定、表达分析和功能研究 消化酶，其中包括三种消化蛋白质的肽链内切酶，它们是三种重要的丝氨酸蛋白 酶，分别是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。这三种酶在进化上具有一定 同源性，具有共同的祖先基因。生物进化分析显示，日本比目鱼胰蛋白酶基因、 胰凝乳蛋白酶基因和弹性蛋白酶基因的首次倍增与硬骨鱼、哺乳动物丝氨酸蛋白 酶基因构成的簇的首次倍增发生在同时期。硬骨鱼弹性蛋白酶基因与哺乳动物弹 性蛋白酶基因的分歧时间要晚于首次倍增，由此可见，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 和弹性蛋白酶的首次倍增早于硬骨鱼类的分化。在功能上，这三种酶在食物蛋白 质的消化过程中承担着重要的生理功能。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶主要负责一般 蛋白质的消化作用，而弹性蛋白酶以水解不溶性弹性硬蛋白( e l a s t i n ) 为特征， 并且能水解酪蛋白、纤维蛋白、白蛋白、胶原蛋白等多种蛋白质，具有广泛的蛋 白质水解活性。弹性蛋白酶作为一种主要在胰脏中合成的消化酶，对其进行分子 进化方面的研究将对深入了解胰脏进化有一定的科研意义。 1 2 2 2 弹性蛋白酶的生物学功能及研究历史 弹性蛋白酶( e l a s t a s e ，e l a s ，e c 3 4 2 1 1 1 ) 是一种肽链内切酶，属于丝 氨酸蛋白酶家族n 2 7 引，以水解不溶性弹性硬蛋白( e l a s t i n ) 为特征，能专一性裂 解丙氨基酸、甘氨基酸、丝氨基酸等小的中性氨基酸形成的肽键。该酶具有广 泛的水解蛋白活性，除能降解弹性蛋白外，还对酪蛋白、纤维蛋白、白蛋白、 胶原蛋白等多种蛋白质。弹性蛋白酶在动物体内主要由胰脏的腺细胞以酶原的形 式分泌到消化道中，在二指肠中由胰蛋白酶或自身在氨基端切去- d , 段肽，使 其分子构象发生改变转变成为有活性的酶。 在动物体内，弹性蛋白酶能影响脂质代谢、降低胆固醇、抑制动脉硬化发 展。由于弹性蛋白酶在医疗上具有较大的用途，对其的研究也进行的比较早。 早在1 8 9 0 年w a l d 就发现动物胰脏提取液具有溶解结缔组织弹性蛋白的功能。 1 9 4 9 年b a l o 等发现胰脏提取物中含有一种能溶解主动脉壁上弹性纤维蛋白的新 酶，命名为弹力纤维溶解酶( e l a s t o l y t i ce n z y m e ) 或弹性酶，其后d a v i s 首先 从猪胰中分出弹性蛋白酶，这是首次从动物体内分离出该酶。1 9 5 2 年b a n g a 得 到牛胰弹性蛋白酶结晶，1 9 6 9 年n a r a g u n a n 等用层析法制得电泳均一的弹性蛋 白酶，s h o t t o n 于1 9 7 0 报告了它的一级结构 4 1 。 1 2 2 3 弹性蛋白酶的分离纯化研究 8 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 目前，已经从许多动物体内分离纯化出了该酶。包括在哺乳动物，如人类 t s , 7 0 、鼠咖1 、猪口钆叫等物种；在低等的脊椎动物，如鱼类中也有一些研究，如已 从大西洋鲑鱼1 、鲤鱼啪1 、大西洋鳕鱼。8 6 1 、非洲肺鱼m 1 、鲶鱼旧& 册3 、金枪鱼 呻0 。、虹鳟鱼9 1 1 、角鲨鱼阳2 3 等体内分离纯化出了该酶。此外，也有一些从细菌、放 线菌中发酵生产该酶的报道3 ，叫。 弹性蛋白酶的分离纯化大体分为以下几步：样品的预处理、粗分离和细分 离。目前常用的分离纯化方法有：沉淀法、离心法、透析法、层析法等。粗分 离主要是用盐析和离心等简单的分离方式获得粗品，后期细分级分离则常用层 析法进行分离。如g u n n a ri b e r l u n d 等从大西洋鲑鱼体内纯化弹性蛋白酶的过 程为：用p a m i n o b e n z a m i d i n e s e p h a r o s e - 6 b 层析柱去除粗提取液中的胰蛋白 酶，超滤膜浓缩后过p h e n y l s e p h a r o s e 一6 f f 层析柱、再过q - s e p h a r o s ef f 离子 交换柱、然后过s p - s e p h a r o s ef f 离子交换柱、过铜离子柱去除胰凝乳蛋白酶、 最后过s u p e r d e x 7 5 凝胶过滤层析柱，得到弹性蛋白酶纯品呻5 1 。 1 2 2 4 弹性蛋白酶的理化性质研究 对弹性蛋白酶理化性质的研究表明，由猪胰脏提取的弹性蛋白酶分子量约 为2 5 9 k d a ，由2 4 0 个氨基酸残基组成，有四个二硫键啡1 。b i e t h 和w e r m u t h ( 1 9 7 3 ) 研究表明，弹性蛋白酶的活性中心由几个能特异性结合中性氨基酸的肽键的亚单 位组成，并且有酯酶和酰胺酶活性1 9 。 g i l d b e r ga 等从大西洋鳕鱼中分离纯化出了胰弹性蛋白酶，并就底物特异 性、催化效率和稳定性与猪的胰弹性蛋白酶进行了比较研究阳引。s m i n ea 从角鲨 胰提取物中纯化鉴定了e 1 和e 2 两种亚型的胰弹性蛋白酶的，经研究表明该两种 亚型酶在3 7 。c 均对弹性蛋白酶特异性底物s u c a a a p n a 有较高的璀化活性，但 它们的催化参数却不同阳引。b e r g l u n dg 1 于1 9 9 8 从北大西洋鲑鱼中鉴定了胰弹 性蛋白酶，对该酶的生物学特性和动力学特性做了深入的研究，并且将得到的 的鲑鱼胰弹性蛋白酶与猪的胰弹性蛋白酶的性质做了比较阳5 j 吣1 0 1 。2 0 0 5 年 u l i t i n an n 从欧洲鲇鱼中分离纯化了两种胰弹性蛋白酶亚型n 0 2 3 。s a k h a r o vl i u 从中国鲎的肝胰腺中纯化出了一种弹性蛋白酶，该酶对特异性底物 b o c - ( a l a ) 3 - p n a 有高度的催化活性n 0 3 3 。利用人工合成的弹性蛋白酶特异性底物 s u e - ( a l a ) 3 - p n a ，对来自不同物种( 猪、鼠、鲑鱼) 的弹性蛋白酶进行研究表 9 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 明，鱼类的弹性蛋白酶针对p 1 位置是亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸等氨基酸表现出 偏好性。结几种鱼( 鲑鱼、鳕鱼、虹鳟鱼、多枪鱼、猪、鼠) 的弹性蛋白酶进行 比较研究发现这几种鱼的胰弹性蛋白酶的l ( i i l 值相近，且猪胰弹性蛋白蛋白酶 比鱼类的l ( 1 i l 值大近一倍。说明鱼类胰弹性蛋白酶比猪的胰弹性蛋白酶对特异性 底物的亲和力要小。作为一种适应了低温环境的大西洋鲑鱼的弹性蛋白酶，其 催化效率比猪胰弹性蛋白酶的高近2 5 倍随5 l 。 1 2 2 5 抑制剂对弹性蛋白酶活力的影响 弹性蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，是一种能够降低胰弹性 蛋白酶活力的物质。以大西洋鲑鱼、鳕鱼和角鲨为例，其弹性蛋白酶活性能被苯 甲磺酰氯( p m s f ) 、抑弹性蛋白酶醛( e l a s t a t i a n l ) 和m p c m k 强烈抑制，表现出丝 氨酸蛋白酶家族成员的共有特征阳5 1 。但是苯甲脒、牛胰蛋白酶抑制剂和亮肽素 等胰弹性蛋白酶抑制剂对大西洋鲑鱼胰弹性蛋白酶活力却无明显影响，这又表 现出弹性蛋白酶与其他丝氨酸蛋白酶家族成员的性质差异。研究发现，鱼类的 弹性蛋白酶比哺乳动物胰弹性蛋白酶对p m s f 更敏感。碘乙酰胺，对鱼类胰弹性 蛋白酶无影响，却对哺乳动物胰弹性蛋白酶有轻微抑制效应。大豆胰蛋白酶抑 制剂能抑制鳕鱼胰弹性蛋白酶活力，对猪胰弹性蛋白酶活力却无影响。可见， 不同种属来源的胰弹性蛋白酶对抑制剂和敏感程度不同，存在一定的差异和种 属特异性n 0 4 1 。 1 2 2 6 弹性蛋白酶类型及其分布 弹性蛋白酶有四种同功酶形式：胰弹性蛋白酶i ( e l a si ) 、胰弹性蛋白 酶i i ( e l a si i ) n 0 5 10 6 1 、胰弹性蛋白酶i i i ( e l a si i i ) 和噬中粒细胞弹性蛋白 酶n 0 7 1 。胰弹性蛋白酶i 主要由动物胰脏合成，能专一性对p 1 位置丙氨酸残基进 行酶n 0 8 1 1 ；胰弹性蛋白酶i i 也是由动物胰脏合成的，对p 1 位置的氨基酸无特 殊限制睛。胰弹性蛋白酶i i i 是近年来利用核酸探针对人的胰脏e d n a 文库搜寻 时发现的一种新的弹性蛋白酶形式0 。，目前对其进行的研究仍不够深入，推测 其功能与胰弹性蛋白酶i i 相似，可能与机体免疫有一定关系。噬中性粒细胞弹 性蛋白酶是由中性粒细胞分泌产生的，位于粒细胞嗜天青颗粒中，分子量约为 3 0 k d ，无前体酶，此类酶在机体免疫方面有重要作用，与人类许多疾病的发生 l o 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基罔的鉴定、表达分析和功能研究 发展相关，如肺气肿、急性肺损伤、慢性肠道疾病、心肌炎、关节炎等。 弹性蛋白酶在自然界中分布很j 一。广泛分布在哺乳动物及人的各种组织 ( 胰、脾、肺、主动脉管及皮肤等) 和体液( 血液、血小板) 中。在自细胞及巨 噬细胞中也有分布。此外在微生物类群中也有分布，多年研究发现不仅在细 菌、放线苗中广泛存在”。”3 而且在真菌中也有分泌胞外弹性蛋白酶菌株的报 道。 】227 弹性蛋白酶的结构研究进展 目前，在哺乳动物人、猪、鼠的弹性蛋白酶氨基酸序列已经测定完成，其编 码区分别由2 6 9 、2 6 6 、2 6 6 个氨基酸残基组成，具有较高的同源性。鱼类与哺乳 动物的胰弹性蛋白酶组成上存在相似性，但无论是残基数还是组成上都存在差 异。例如，大西洋鳕鱼的弹性蛋白酶编码区由1 8 1 个氨基酸残基组成，日本比 目鱼的两种亚型分别为2 6 6 和2 6 8 个氨基酸残基。 s i d e f i gl _ 7t h e3 9s t r u c t u r eo fp i gp a n c r e a t i ch l a s t a s e 圉卜7 猪胰弹性蚩白酶结构图 弹性蛋白酶在结构卜全为b 蛋白，核心结构由两个非常相似的结构域( n 结 构域和c 结构域) 构成( 图卜7 ) 。弹性蛋白酶催化中心有三个重要的氨基酸残 基，分别是a s p1 0 2 、h i s5 7 、s e r1 9 5 。其中，a s p1 0 2 、h i s5 7 位于n 端结 构域，而作为丝氨基酸蛋白酶最重要的s e t1 9 5 位于c 端。此外，其它一些重 要的功能位点也位于c 端结构域，如稳定催化中间产物的氧离子孔( g l y1 9 3 s e t 1 9 5 ) ，底物特异性口袋( s e r1 8 9 、g l y2 1 6 g i y2 2 6 ) ，主链底物结合位点 ( s e r2 1 4 、t r p2 1 5 g 】y2 1 6 ) 。此外，在c 端结构域上还有两个十分重要的 青岛文昌鱼弹性蛋白酶酶基因的鉴定、表达分析和功能研究 保守二硫键。总上，在结构上，c 端结构域包含了大部分的功能位点，执行弹性 蛋白酶的主要催化功能。而n 端的主要功能可能是同c 端结构域相配合，从而保 证催化中心三联体的结构稳定和功能活性。 1 2 2 8 弹性蛋白酶的应用 目前，弹性蛋白酶主要用于医疗，食品工业，日用化工等方面。在医疗 上，弹性蛋白酶作为一种生化药物，对治疗高血脂、外周动脉疾病儿1 ，防止动 脉粥样硬化疗效甚佳，此外还能抑制脂肪肝的发展，治疗慢性气管炎及其它结 缔组织纤维增生性疾病以及用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等 症。此外它还具有调节人体的脂代谢，降解血清中胆固醇、甘油三脂的作用。 在食品工业上，由于弹性蛋白酶水解特性较广，许多难处理的结缔组织如韧 带、大动脉管、筋腱也能被该酶降解，因此可以作为理想的肉类嫩化剂n 1 2 ，n 3 1 。 在日用化工方面，弹性蛋白酶主要作用一种化妆品添加物n 1 制，能起到增进和改 善皮肤的血