（食品科学专业论文）冻干乳酸菌菌种的研究.pdf

摘要 发酵裁蹙彩喃发辞巍制品生产的关键也是嚣质量优劣的决定瓣素。曦热链球菌帮 保加利亚乳杆菌是发酵乳制品生产中最常用的菌种。近年来，直接使用的超浓缩冷冻干 燥乳酸聋发黪裁羁其旗力强、妫量少、污染低、黯转多、蠖予运输绦藏等诸多键点蔼镪 爱人们青睐，但国内尚无此类成品，均为国外进口，此方谳科学研究处于零散的实验阶 段，这严重制约了我豳乳品企业的发展。 本谭囊遴过6 个试验，系统磷究了冀空冷冻干燥孳i 酸蘩发酵裁生产静最佳王艺条传， 优选最佳工芑参数，为大规模工业化生产奠定基础。 f 试验 祭罔传统的平叛划线、分离分纯方法从实验室傈藏菌种巾选捧性状优良的藏 株，、用于实验。 试验i i 采用正交实验，在常规培养熬的基础上优化碳源、氮源和酵母粉的添加量。 s t r e p t o c o c c u sl h e r m o p h i l u s 窝l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s 懿交镊基鑫瑶葵基嚣方癸聚戈簇鬟 自胨( o 5 ) 、葡萄糖( 1 ) 、酵母粉( o 、7 ) 和鱼肉蛋自陈( o 5 ) 、乳糖( 1 ) 、酵 母耪( o 3 ) ，培养1 2 h 和1 5 h 后o d 馕分别为o 5 3 3 和o ，4 7 3 ，菌数达2 2 1 0 7 个，m l 和2 5 1 0 6 个m l 。 试验用无菌的乳酸溶液调节培养綦的初始p h 值分别为5 6 、5 , 8 和6 0 ，不同温度、 不瓣氧气条搏下培莠，结论是球蓥戆最毽培养条馋梵秘始嬲毽5 6 ，手普运擞纯培葬辍 中4 1 培养，而杆菌应在p h 值5 8 ，c 0 2 培养箱中3 7 培养。 试验确定两株藏各四种效果较好的增殖因子，在此熬础上应髑正交试验，优选出 懿簸佳增菌培葬基配方分剐为警菇浸泞1 4 、胡箩 汁1 0 、玉米浆0 6 、v c 0 2 皲 啤灏1 0 、褥茄汁1 0 、胡萝h 汁1 5 、平菇浸汁1 6 ，培养9 h 和1 5 h 后荫数分别迭 2 。9 1 0 9 令，嫩0 彝3 5 l 扩个m l 。 试验v 综合采用四种菌体浓缩方法，超滤眉，球菌和杆菌的o d 值和p h 值分别为 o8 5 8 、1 8 2 5 和4 7 8 、4 0 7 ；添加磷酸盐缓冲溶液后，o d 值分别比空白组增加5 0 和 2 0 多；生长过程中流妇2 0 静n a 2 c o s 溶液鞋孛和产生的酸，至裳长益线瓣最高点蘸 数分别为1 0 ”和1 0 个m l ；优选球菌平口杆菌最饿离心条件均为6 0 0 0 r p m 。 试验砭为成晶发酵试验，冻于菠羚铡器酸奶麴总体晶疆与渡转发酵裁无太大差剩， 凝乳时间较长，但基本无乳请析出，组缎状态蘸好。均匀细腻，粘度较小，满当调整荫 粉比例，风昧应该熊眵有所改替。 试验蔫蘩种经多次活纯使爝，性获稳定+ 可矮予冷冻予撩乳酸蘸发酵裁的连续生产。 基础培养基殿增殖因子价格便嶷、来源广泛，制备工艺简单可行，增菌效果较好。培养 条释要求不舞，蕴体浓缩冻予艇裁终的鼗奶组织状态塞野? ， 关键词嗜热链球菌；保加利藏乳杆蔚：增菌培养基；培养条件：_ 浓度细胞悬浮液 奔 r e s e a r c ho i lt h ef r e e z e d r y i n gl a c t i ca c i db a c t e r i a a b s t r a c t t h es t a r t e ri so n eo ft h ek e yf a c t o r si n f l u e n c e dt h ef e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t sa n dq u a l i t y s w e p t o c o c u u s t h e r m o p h i l u s ( s ) a n d l a c t o b a c i l l u s b u l g a r i c v s ( l b ) w e r e t h e t w o i m p o r t a n t b a c t e r i a , u l t r a c o n c e n t r a t i o na n df r e e z e * d r y i n gl a bs t a r t e rh a ss u c ha d v a n t a g e sa sh i g h a c t i v i t y 、l e s sd o s a g ea n d p o l l u t e d 、p l e n t y k i n d s 、e a s y t r a n s p o r t i t i o n a n d p r e s e r v a t i o n h o w e v e r , t h e ya r ea l lc o m m e r c i a l l yi m p o r t e d ，s t u d yo nt h i si sn o tv e r yf a s ta n d t h e r ei sn o ta s y s t e m a t i c r e s e a r c hr e p o r ty e t ，t h i sc e r t a i n l yw i l lb r i n gh e a v i e rf i n a n c i a lb u r d e nt od a i r ye n t e r p r i s eo f o u r c o u n t r y s i xt r i a l sw e r ec o n d u c t e di nt h ee x p e r i m e n t ，t h eo b j e c t i v ei st oe x a mt h eb e s tl a ba n d a s c e r t a i nt h eo p t i m u mi n d u s t r i l i z a t i o nc o n d i t i o n sa n dt h i sw i l lh a v eg r e a te c n o m i c a la n d f a r - r e a c h i n gs o c i a lb e n e f i t s t i l ef i r s te x p e r i m e n ts e l e c tt h ef i n eb a c t e r i a ls t r a i n sf r o mo w nl a bp r e s e r v e da n dg e tt h e s i n g l ec o l o n y a f t e ral o to f a c t i v a t i o n sa n dp u r i f i c a t i o n s ，t h e ni n c u b a t er e p e a t e d l y 1 nt h es e c o n do n e t h r e es o u r c e so fc a r b o n 、n i t r o g e na n dy e a s te x t r a c tp o w d e rw e r e o p t i m i z e dw i t ho t h e r ss a m e ，i ts h o w e dt h a tt h em e d i u mc o m p o n e n t so fs ta n dl 。bw e r e p a n c r e a sp e p t o n e ( o 5 ) 、g l u c o s e ( 1 ) 、y e a s te x t r a c tp o w d e r ( o 7 ) a n dp o l y p e p t d n ( o 5 ) 、 l a c t o s e ( 1 ) 、y e a s t e x t r a c t p o w d e r ( o 3 ) a b s o r b a n c ea t6 0 0 r i mo r s t a n d l b w e r e0 5 3 2 5 a n d 0 4 7 3 2 c o l o n y w e r e2 2 x 1 0 7 m l 一1a n d2 5 1 0 6 m l r e s p e c t i v e l ya f t e r i n c u b a t i o n 。 t h et h i r do n es h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o no fs , ti si nc o m m o ni n c u b a t i o n 。4 l ， p h 5 。6a n d t h el bi si nc 0 2 i n c u b a t i o n ，3 7 ，p h 5 8 ， i n t h e f o u r t h o n e ，s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n tc o n f i r m e d f o u r b e t t e r g r o w i n g f a c t o r s o f e i t h e r , o nt h i sb a s i s ，o r t h o g o n a ld e s i g nw a su s e dt os t u d yt h ei n t e r a c ti n f l u n c e ，s tg r o w sw e l li n m u s h r o o m u i c e ( 1 4 ) 、c a r r o t j u i c e ( 1 0 ) 、m a i z ef l u i d ( 0 6 ) 、v c ( o 2 ) a n dl bi n h a e r b i nb e e r ( 1 0 ) 、t o m a t oi u i c e ( 1 0 ) 、c a r r o tj u i c e ( 1 5 ) 、m u s h r o o mj u i c e ( 1 6 ) ，t h e c o l o n yo f s ta n d l bw e r e2 9 x1 0 o a n d3 5 1 0 s m l i nt h i sm e d i u m t h ef o u rm e t h o d sw e r eu s e da tt h es a m et i m ei nt h ef i f t h e x p e r i m e n t a b s o r b a n c ea t 6 0 0 r i ma n d p h o f s t a n d 乙b w e r e o 。8 5 9 、1 8 2 5a n d 4 7 8 、4 0 7a f t e r u l t r a 虹l t r a t i o n ；o d o w a s i n c r e a s e d5 0 a n d 2 0 r e s p e c t i v e l y a f t e r a d d i n gp h o s p h a t eb u f f e r , 2 0 n a 2 c 0 3w a sa d d e di n t h ei n c u b a t i o n ，t h ec o l o n yw e r e1 0 ”a n d1 0 9 ml * l ，t h eb e s tc c n t r l f u g a t i o nc o n d i t i o nw a s 6 0 0 0 r p m c r y o p r o t e e t i v ea g e n t s ( 1 0 0 0 m 1 ) c o n s i s to fs k i m m e dm i l kp o w d e r l 0 0 9 、m o n o s o d i u m g l u t n a t e l o g 、g l y c e r o l1 0 9 ，o l i g o s a c c h a r i d e2 5 9 、l a c t o s e1 2 5 9 ，s u c r o s e1 2 5 9 、c y s t i n el g 、 v c 3 9 , a f t e rf r e e z ed r y i n g , t h ep r o d u c t sw e r eu s e dt of e r m e n tm i l ki nt h es i x t ht r i a l ，t h eq u a l i t y o f y o u g h u r tw a sn e a r l l yt h es a m ea st h el i q u i ds t a t e ro n e b u t 咖ec o n c r e t i n gt i m ew a sl o n g e r , i 【 至苎查些奎耋三兰矍圭兰堡兰三 t h es t a t ew a sg o o da n dv i s c o s i t yw a sl o w t h en a v o rs h o u l db ei m p r o v e da f t e rr e g u t a t i n gr a t i o o f t h ef r e e z e - d r y i n gl a b p o w d e r m a s t e r a t es t u d e n t ：z h a n g j i a n y o u m a j o r ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o eh u og u i c h e n g k e y w o r d s ：s t r e p t o c o c u u at h e r m o p h i l u s l a c t o b a c i l l u s b u l g a r i c u s e n r i c hm e d i u m i n c u b m ec o n d i t i o n h i g hd e n s i t yc e l ls u s p e n dl i q u i d i i i - 1 引言 蘧蓑露葬学豹发壤彝入锚生话承警戆提离，食魏对予誊葬积越壤麓终黑不辑发生藿 变化，食物的作用不再仅仅是为机体生长和维持提供基本原料，而且如何通过食物对机 体生理或其它方面产生的影响两促进健康日益l 起人们的关注( k a n t h a , 1 9 9 9 ) 。2 0 世纪 扔梅瑟尼拇夫的“黻奶长寿说”对欧溯酸奶的蒋及产生了很大彩响，二次键拜大战蕉开 始使用纯菌种制造发酵乳制品( 史媛英，1 9 9 9 ) 。 酸奶对入律豹薤处舂平撬赫遘夔群稳整肠、清除盘溃中疆强静、撬衰老、延长毒禽、 防止和降低乳糖不耐症、提商人体对钙、磷、铁的吸收锌( 师骏华，1 9 9 9 ) 。发酵剂悬影 响整个酸奶生产和保证发酵乳产品质攫稳定的关缝因素之一。液体发酵剂的方便、价廉 缆得天，j 、生产厂寨均可垂行调割，这投犬逢扩充了酸奶生产领域，但在酸奶生产豹避 步集约化、规模化发展中，传统发酵荆的多次活化和扩培的烦琐工艺越来越不能满足要 袋( h a n s e n ，2 0 0 2 ) 。转琏蕃低温干燥技术鑫巷发壤，疆方巍业发达瓣家己开发出耀量小、 邮寄储藏方便、套援投入生产的多功能商品化发酵帮，即冷冻干燥乳酸菌发酵剂，它的 使甩简化丁乳品企业的生产工艺，提商了企业产品质量，避免了囡微生物技术力量的不 避雨造或的菌耱蓑整不佳饕瀚惹( j o h n s o n ，t 9 9 5 ) ，这经冻干氯酸藿发酵羯兹骚究裁务 近年来乳晶工业中研究的热点。 i 。l 耨型酸娆发酵斜的分类及特煮 新型发酵剂的研究始于十九世纪米至二十世纪初，但真正商鼎化则经历了一个较长 静蹿勰+ 大凌在本篷纪五、六卡年代虢磊，才粪正耀于丈麓搂工鼗铯生产。 新型发酵剂按形态可丈教分为干制发酵剂浓缩发酵荆和冻藏发酵荆三种( 周晓红， 1 9 9 8 ) 。予制发酵剂是指经寞宅低温于燥法、冷冻真空干燥法和喷嚣干燥法铡得呈于粉状 藏颗粒状的发酵剂。浓缩发酵剂的研究，直剜1 9 6 3 年才进入商品亿实用阶鼓，其含菌量 般为l o 1 0r z c f u m l 。我图对浓缩发酵剂的研究起步较晚，向￥l 酸菌培养液中添加缓 跨盐嚣经裹心势离稻冀空子溱翻捧浓缝发酵到，舍萤量达1 0 ”个m t ( 毫投稿，1 9 9 1 ) 。 综合文献资料可将浓缩发酵荆的制备分为物理法、化学中和法、缓冲盐法和渗析法四种。 冻藏发酵荆的应用始于7 0 年代初，是将发酵刘茵神繁殖于制罄培蒋基中，谯稳定生长后 嬲实荦亍冻存，冻藏子- 2 0 。c 袋- 4 0 c ，甚至保存予液氯 。 增荫液配方设计中因营养要求复杂，影响生长的因素多，在密际工作中还应做其它 条件的优他，如增藏渡氧化还原电势、湿瘦等，因工髂曩大丽聍澜有限，只能对醚方终 初步的优化设计( 8 加平，1 9 9 9 ) 。 3 3 培养条体的确定 从保存微生物的角度来看培养的温度很重要，以繁殖速度最快的生长戢适温度进行 2 3 - 东北农业大学工学硕士学位论文 培养是有问题的因为细菌的死亡速率比生长速率对温度变化更为敏感，如以稍低于生 长温度进行培养，效果会更好。以不同的温度培养长双歧杆菌。进行冷冻干燥，结果提 示温度范围在3 4 3 7 之间为好( 吴定，2 0 0 0 ) 。 低温培养可使菌体内不饱和脂肪酸含量增加，从而提高冻干菌的存活率，另一影响 是低温培养产生的不溶性多糖升高。生长培养基的p h 值对菌体的生长是一个限制因素， 培养过程中低p h 对菌体生长有抑制作用，在培养阶段调整培养基的p h 值，不仅可以提 高活菌数，还可以提高冷冻干燥的存活率，培养方式对乳酸菌生长有很大影响( 朱兵， 1 9 9 0 ) 。 在基础培养基中接入5 的菌悬液，选择3 t c 、3 9 c 和4 l 分别培养嗜热链球菌和 保加利亚乳杆菌，用无菌的乳酸溶液调节培养基为5 6 、5 8 、6 0 三个初始p h 点，培养 方式选择普通生化培养箱和二氧化碳培养箱两种，确定其最佳培养条件，试验数据见表 3 1 1 ： 表3 - i i 培养条件的确定 t a b l e 3 1 1l n c u b a t ec o n d i t i o n sd e t e r m i n a t i o n 根据上述测定结果可以看出，球菌的最佳培养条件应为初始p h 值5 6 ，于普通生化 培养箱中4 l 培养，而杆菌应在p h 值5 8 ，c 0 2 培养箱中3 7 培养。 3 4 增殖因子的确定及优化 3 4 1 嗜热链球菌单因素试验 根据国内外资料及s t 的营养需要，确定其增殖因子有乳糖( 1 - 2 ) 、胡萝h 汁 ( 1 0 1 4 ) 、啤酒( 7 - 1 0 ) 、番茄汁( 5 1 0 ) 、玉米浆( o 5 1 5 ) 、平菇浸汁( 1 0 1 4 ) 、 v c ( 0 2 - 0 6 ) ( 李用芳，1 9 9 8 ) 。试验结果见表3 1 2 ( 1 、2 、3 代表不同的浓度) ： 2 4 表3 一1 2 辔热链球蓬单因素试验 t a b l e 3 1 2s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n to fs t 浓塞增建困子# ho d i 5 _ 3 753 75 3 70 1 7 30 1 8 10 1 7 7 2 胡萝h 汁5 3 65 3 75 3 7o 2 1 2 0 2 1 6o 2 1 4 3 5 3 85 3 85 3 8 0 1 5 60 1 5 80 、1 5 7 1 5 4 15 4 35 4 2 0 1 7 20 1 7 90 1 7 6 2 玉米浆5 ，4 45 4 4s 4 40 1 6 7 0 。1 6 00 1 6 4 3 5 4 354 ls 4 20 1 6 9 0 1 5 50 1 6 2 l 5 3 65 3 55 3 6 0 0 9 20 2 4 80 i 7 0 2 啤滔5 4 25 + 3 65 1 3 80 。1 7 9o 1 s 4 o 1 6 6 3 5 3 85 ，3 95 3 9 0 ，1 5 60 1 7 l0 1 6 4 l 5 。3 55 ，3 75 3 6 0 1 7 60 。1 5 40 1 6 5 2 乳糖5 3 85 3 753 80 1 7 9 0 1 6 30 1 7 f 3 5 4 05 4 05 4 00 1 6 9 0 1 6 50 1 6 7 l 5 4 85 4 15 4 i 0 1 7 00 、1 2 201 4 6 2 番茄汁5 4 254 04 4 1 0 1 7 30 ，1 6 20 1 6 8 35 3 7 5 3 95 ，3 8 0 ，i 7 00 。i 3 70 ，j 5 4 l 5 3 95 3 85 3 9 0 1 8 50 1 8 50 1 8 5 2 维生素c5 4 15 4 25 4 20 1 9 7 0 】9 60 1 9 7 3 5 4 45 4 45 4 4 0 8 00 1 8 101 8 l l 5 3 95 3 85 3 9 0 】4 70 】3 30 1 4 0 2 乎菇浸泞5 3 85 3 95 3 90 2 6 6 o 2 6 1o 。2 6 4 3 5 3 65 3 653 6 0 】4 80 1 4 60 】4 7 3 4 + 2 保加剽踅乳抨藏单因素试验 保加利亚乳杆菌采用褥茄汁( 5 * l o ) 、啤酒( 7 1 0 ) 、甲酸( 0 2 0 6 ) 、卵磷脂 ( 0 ，5 - 0 , 7 ) 、胡萝 泞( 1 0 - 1 4 ) 、纛米浆( o 。5 - i 1 5 ) 、平菇援持( 1 0 - 1 4 ) ( 秘e h 8 嬲s 。n 1 9 9 7 ) ，见表3 - 1 3 ( 1 、2 、3 代表不黼的浓度) ： 2 5 东北农业大学工学硕士学位论文 表3 1 3 稼翻霉亚毳移蓬单因素试验 t a b l e 3m 1 3s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n to f l b 浓度域建因子p |o d l 5 2 65 2 65 2 60 2 2 80 2 0 90 2 1 9 2 甲酸5 。2 65 2 75 2 6o 2 2 60 2 2 20 2 2 4 3 5 2 32 ，2 5s 2 4 0 2 0 20 t 8 90 1 9 6 i 5 2 05 1 75 1 90 3 1 9 0 2 9 50 3 0 7 2 雌湮5 0 55 。0 35 0 40 51 3o ，5 3 6 o 5 2 5 3 4 9 95 0 04 9 9 0 4 6 2o 4 7 40 4 6 8 i 4 9 95 0 04 9 90 3 3 6 0 3 3 50 3 3 6 2 鋈菇汴5 0 95 0 s5 嚣 0 4 5 30 4 0 80 4 3 0 3 5 0 85 1 05 0 903 9 3 0 3 6 80 3 8 0 1 5 1 95 。1 95 1 90 0 5 2 0 0 5 20 0 5 2 2 卵磷腊 5 1 25 i o5 1l 0 1 0 20 1 0 20 1 0 2 35 1 l 5 1 45 1 20 0 7 20 0 7 0 0 0 7 l l 5 + 1 35 1 35 + 1 30 t 3 2 40 3 1 70 3 21 2 蕊米浆 5 1 65 1 45 1 5 0 3 4 90 3 6 0o 3 5 4 3 5 1 05 ，1 35 1 20 。3 9 7 0 3 0 10 3 4 9 l 5 。l s51 55 50 3 1 2 0 3 0 80 3 1 4 2 胡萝h 汁5 1 35 1 45 1 40 3 l io 3 7 9o 2 9 5 34 9 7 4 9 74 9 70 。5 1 4 0 5 l l0 5 1 3 l5 0 3 5 0 35 0 30 4 1 0 0 4 1 20 4 il 2 平菇浸汁5 0 35 0 25 0 3o ，4 2 8o ，4 3 3 o 4 3 1 3 5 5 0 15 0 20 4 3 00 4 6 30 4 4 6 上述试验数器撵示球莹玻好戆因孛争增蓬因子获次为平菇浸泞( 1 2 ) 、鹅萝 泞 ( 1 2 ) 、v c ( o 4 ) 、玉米浆( 0 5 ) ，按其测定数值的大小顺序确定其正燮试验的浓 度为：平菇漫汁( 1 0 、1 2 、1 4 ) 、胡萝 汁( 8 、1 0 、1 2 ) 、玉米浆( o 2 、 o 4 、o 6 ) 、v e ( o 2 、o 4 、o 6 ) ；秆麓较好的嘲种增建豳子依次为啤酒( 8 5 ) 、平菇漫汁( 1 6 ) 、番茄汁( 7 5 ) 、胡萝h 汁( 1 5 ) ，正交试验浓度确定为：啤 灏( 7 、8 5 、l o ) 、番菇泞( 5 、7 ，5 、玲) 、麓萝 漳( t 4 、1 5 、1 6 ) 、 平菇浸汁( 1 4 、1 6 、1 8 ) 。有资料髭示，啤酒和乳糖对球菌增殖效果较好，卵磷脂 孝髓甲酸是保加刹亚乳符茁的最佳促生长物质之一，但是本试验未熊得到相关缝论，原因 可能是由予蕴株之闻的性获麓掰；l 超静( c h o a h 。y i n g 1 9 9 0 ) 。 3 4 + 3 增殖因子的优化 本试验考虑各因素之间的燮互作用，采用四因素三水平正交试验设计避彳亍试验，按 - 2 6 最佳条件培养辨菌落总熬、o d 馕和p h 傻为蕊测指标，正交试验设计及结果觅袭3 - 1 4 至3 2 l ： 3 4 。3 + l 臻墓试验数据及壤差分辑结果 表3 1 4 球增殖因子优化的正交试验结果( b ( 3 4 ) t a b l e 3 一1 4t h eo r t h o g o n a ld e s i g nr e s u l t so f s te n r i c hf a c t o r s 因素a因素b因素c因素d 指标值( s t ) 实验号 平菇澄汁胡萝i 汁玉米浆 v c 。耥 州僮藏1 落0 8 数 1 0 1 0 0 , 4 1 0 1 2 1 2 1 2 1 4 1 4 8 l o 1 2 8 1 0 1 2 8 1 0 0 2 0 2 0 1 6 95 3 72 4 o 4 0 4 0 。1 7 95 3 82 9 0 6 0 6 0 1 7 45 3 41 1 5 0 4 0 6 0 1 8 65 4 56 6 0 6 0 2 0 1 4 55 3 3 4 5 0 2 0 4 0 1 7 45 3 62 1 5 0 6 0 ，4 0 1 2 4 5 3 51 4 o 2 0 6 0 1 2 75 3 21 5 91 4 1 2 0 4 0 。2 o 1 1 l5 。3 6 2 1 。5 表3 - 1 5 s t 增菌培养黧优化中指标豹极蒺分析结粜( o d 值) t a b l e 3 1 5s te n r i c hm e d i u mv a r i a n c e a n a l y s i s ( o d ) 指标值 o d abcd k i0 5 2 10 4 7 80 4 7 00 4 2 5 k 2 0 + 5 0 40 4 5 00 ，4 7 5 0 4 7 6 k 30 3 6 20 , 1 5 90 4 4 20 4 8 7 ro 0 5 3 0 , 0 0 90 0 1 10 0 2 1 表3 1 6 s t 增菌培养熬优化中揩标的极簸分析结果( p h 德) t a b l e 3 1 6s 。te r t r i e hm e d i u mv a r i a n c ea n a l y s i s ( 蝴) 指标值 一 2 望堕 abc d l ( 11 6 0 8 6 1 6 1 6 0 51 6 0 5 1 6 1 41 6 0 21 6 ，1 9 1 6 0 8 1 6 + 0 31 6 0 61 6 0 1 6 。ll r 0 0 3 70 0 4 7 0 ，0 5 800 2 0 2 7 - ，2 3 4 - ) ，0 7 8 童! ! 垒些查耋三兰墼圭兰堡丝兰 表3 1 7s t 增菌培养基优化中指标的极差分析结果( 菌落数) t a b l e 3 1 7s te n r i c hm e d i u mv a r i a n c ea n a l y s i s ( n u m b e ro f st ) 指标值 菌落数 abcd k 1 k 2 k 3 6 4 5 9 2 3 7 1 0 4 3 5 5 4 5 4 7 1 1 6 5 3 0 5 0 6 4 5 7 9 r1 8 3 2 32 8 89 7 采用l 9 ( 3 4 ) 正交试验设计表实施试验，以p h 值、吸光值、菌落数为指标，测定 结果见表3 1 4 。以o d 值为指标的球菌极差分析见表3 - 1 5 ；以p h 值为指标的球菌极差 分析见3 - 1 6 ：以菌落数为指标的球菌极差分析结果见表3 1 7 ，综合三个结果分析表可以 看出，指标的极差分析结果相同，最佳组合为a 3 8 2 c 3 d 】，即平菇浸汁1 4 、胡萝p 汁 1 0 、玉米浆o 6 、v c 0 2 。 3 4 3 2 杆菌试验数据及极差分析结果 表3 1 8 杆菌增殖因子优化的正交试验结果( b ( 3 4 ) t a b l e 3 - 1 8t h eo r t h o g o n a ld e s i g nr e s u l t so f l be n d c hf a c t o r s 因素a因素b因素c因素d指标值( l b ) 实验号 啤酒番茄汁胡萝卜汁平菇浸汁。鲫 p h 值 菌1 落0 7 数 7 7 7 8 5 8 5 8 5 1 0 1 0 5 75 1 0 5 7 5 1 0 5 7 5 1 4 1 5 1 6 1 5 1 6 1 4 1 6 1 4 1 4 1 6 1 8 1 8 1 4 1 6 1 6 1 8 03 4 7 0 2 7 9 0 2 4 1 0 3 2 7 0 3 8 5 0 2 7 8 0 2 引 0 2 8 7 5 3 0 5 3 3 5 3 0 5 3 0 5 2 9 5 3 0 5 2 8 5 3 0 3 2 3 5 3 4 3 1 3 0 2 4 2 6 3 2 91 0 1 0 1 5 1 4 0 2 6 35 2 42 4 采用l 9 ( 3 4 ) 正交试验设计表实施试验以d h 值、吸光值、菌落数为指标，测定 结果见表3 - 1 8 。以o d 值为指标的极差分析见表3 - 1 9 ：以p h 值为指标的极差分析见3 2 0 ： 以菌落数为指标的极差分析结果见表3 - 2 】。 2 8 2 3 4，o 7 8 表3 1 9l b 增菌培养基优化中指标的极差分析结果( o d 值) t a b l e 3 1 9l be n r i c hm e d i u mv a r i a n c ea n a l y s i s ( o d ) 指标值 o d 6 0 0 ab cd k 、0 8 6 8 0 9 5 5o 9 1 2 0 9 9 5 k 2 k 3 0 9 9 0 0 8 3 l 0 9 5 1 0 7 8 2 0 8 6 9 0 9 0 8 0 8 3 9 0 8 5 5 r0 0 5 30 0 5 8 0 0 1 40 0 5 2 表3 2 0l b 增菌培养基优化中指标的极差分析结果( p h 值) t a b l e 3 - 2 0l be n r i c hm e d i u mv a r i a n c ea n a l y s i s ( p h ) 晰值a 堕了一d bc k ，1 5 9 21 5 8 71 5 8 91 5 8 5 k 2 k 3 1 5 8 8 1 5 8 1 1 5 9 1 1 5 8 3 1 5 8 6 1 5 8 6 1 5 8 4 1 5 8 9 r0 1 1 50 0 7 50 0 3 00 0 5 5 - _ _ 1 1 1 , 1 1 , i i i i i i _ i 暑 表3 2 1l b 增菌培养基优化中指标的极差分析结果( 菌落数) t a b l e 3 2 1l be n r i c hm e d i u mv a r i a n c ea n a l y s i s ( n u m b e ro f l _ b ) 指标值 堕堡墼 abcd k 1 0 18 99 08 6 k，85 9 78 88 5 k 18 28 2 9 09 7 r6 350 64 综合三个结果分析表可以看出，指标的极差分析结果相同，最佳组合为a 3 b ，c 2 d 2 ， 即啤酒1 0 、番茄汁1 0 、胡萝h 汁1 5 、平菇浸汁j 6 。 3 4 4 生长曲线的测定 为了进一步了解嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在优化的增菌培养基中的生长过程从 而掌握发酵最适收获期，进行生长曲线测定。间隔3 小时测定菌液的菌落总数、吸光度、 p h 值和滴定酸度绘制生长曲线，见图3 - 9 、3 - 1 0 、3 - 1 1 、3 1 2 、3 1 3 、3 1 4 ： 2 9 查! ! 垒些奎兰三童堡圭兰堡兰圣 3 4 4 1 嗜热链球菌生长曲线 0 0 鲴0 。0 o ： 趔- r 5 5 2 q - 48 麓 1 1 蟠 蔷l o 鼎 均 涟9 稠 8 图3 - 9 嗜热链球菌生长曲线( i ) f i g 3 9t h e g r o w t hc u r v eo fs t ( i ) ( h ) 1 0 8 6 蓉 一摧 2 0 03691 21 51 8 2 12 4 时f n q ( h ) 图3 1 0 嗜热链球菌生长曲线( i i ) f i g 3 - 1 0t h eg r o w t hc u r v eo f s t ( i i ) 03691 21 51 82 12 扩间“ 图3 - 1 1 嗜热链球菌生长曲线( i i i ) f i g3 - 1 1t h eg r o w t hc u r v eo f s t ( h i ) 3 0 3 4 4 2 傈加和溉乳释菡生长盏线 | 墓 l 整 o 0 5 o 1 0 8 捌8 - r &4 2 0 1 1 饕1 0 慧 蔫9 8 图3 - 1 2 保加利亚乳杆菌生长曲线( i ) f i g 3 一1 2t h e g r o w t hc u r v eo f l b ( i ) 03691 21 5 1 82 l2 4 对闻( h ) 图3 * 1 3 保加利亚乳杆菌生长曲线( i i ) f i g 3 1 3t h e g r o w t hc u r v eo f l 。b ( 1 1 ) ( h ) 1 0 0 8 0 6 0 錾 4 0 饕 2 0 o 03691 21 5 1 82 12 4 时间“) 图3 一1 4 保加利亚乳杆蒋生长曲线( 1 i i ) f i g 3 - 1 4t h e g r o w t hc u r v eo f l b ( i i i ) _ 东北农业大学工学硕士学位论文 由图可看出，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的0 1 3 值从一开始急增，经过较短的延 迟期后即进入对数生长期，到9 小时和1 5 小时后达到高峰即基本保持不变，表明此后菌 数不再增加。酸度和p h 值在开始时有一个明显的迟缓期，3 小时后变化较大，这说明 菌种进入对数生长期以后，菌数增加非常快。菌数在9 h 和1 5 h 以后下降，表明进入衰亡 期，酸度一直随着时间的延长而升高，p h 值随着时间的延长而降低，证明乳酸菌的浓度 随着菌株的生长一直在升高。最后酸度和p h 值基本维持不变，开始进入生长稳定期， 菌数基本保持不变，滴定酸度曲线、p h 值曲线渐趋平衡( g a u d r e a u ，2 0 0 2 ) 。 这种情况说明9 h 和1 5 h 以后已经明显不利于嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长 繁殖，生长曲线亦呈下降趋势。综上所述，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的最适收获期 应为9 h 和1 5 h 。 3 5 高浓度细胞悬浮液的制备 将菌体与培养基分开可以使菌体与代谢中产生的乳酸盐等有毒物质分开，是浓缩乳 酸菌发酵剂制各中的关键技术。 将前期保存菌种用11 脱脂乳活化培养2 次，划线于m r s 固体培养基中，于培养 箱中培养。单个菌落镜检为纯一菌落后，接种于m r s 液体培养基中培养相同时间。配 制嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的基础培养基，按试验2 的最佳用量添加增殖因子，同 时用乳酸调节其最佳p h 值，1 2 1 灭菌1 5 分钟，灭菌备用。 3 5 1 超滤法浓缩菌体 新的超滤装置在投入使用前应用干净的去离子水清洗，循环清洗不少于1 0 m i n ，清 洗液出口压力维持在7 11 n c m 2 。清洗超滤管内的保护剂时，应检查超滤系统的泄漏情 况，排掉清洗液，完成最初清洗。超滤装置启动时 圭意先关闭超滤装置的进口阀门、清 洗液进口及出口阀门，打开超滤装置的出口阀门、超滤液排泄阀门、通气口阀门及压力 表隔离阀门，启动超滤系统的循环泵，缓慢打开超滤装置的进口阀门，将液体缓慢注入 超滤管内，避免较大压力冲坏超滤管，最后打开时使进口压力不超过4 6 n c m 2 ，结果见 表3 2 2 ： 表3 2 2 超滤法浓缩菌体 t a b l e 3 - 2 2l a c t i ca c i db a c t e r i au l t r a f i l t r a t i o n 超滤法是浓缩菌体的先进方法，本部分试验证实，测定指标比前期增菌培养基中的 指际有明显改善，证明了超滤法用于乳酸菌浓缩制备冻干发酵剂是可行的但是由于此 3 2 种装置是敞开操作，虽然试验中刚无菌水冲洗，尽量在无菌条件下操作，但被杂凶污染 的可能性很人，菌落计数证明了有杂凶污染。但是在实验室条什r 可以将此种方法与其 它凶体浓缩方法配合使川，作为浓缩乳酸凶凶体的 讨删处理手段，这样町以人人增加浓 缩倍数，为规模化l 业生产奠定基础( h a n s e n ，2 0 0 2 ) 。 3 5 2 缓冲盐法浓缩菌体 当p h 值降低至4 0 以f 时，凶体i 阿 j - k 繁殖受到抑制作川，因此要选择一种符合 要求的缓冲物质，在培养阶段调整生艮睹养基的p h 值，不仅可以提高活菌数，还可以 挺r 岛冷冻十燥的存活率，在细曲培养。hj ：m j 的缓冲盐有磷酸盐和碳酸钙。 陔法是根据乳酸的代谢特点改计的，山1 ：乳酸凶在代谢过程中能分解糖类产生人鼙 有机酸类，其中主要是乳酸，随着发酵进程的继续，乳酸含量逐渐增加，致使培养基的 酸度升高，乳酸菌的繁殖便被抑制甚至死亡，所以普通发酵剂的最高菌数仪达 i o7 1 0 s c f u m l 。为了促进乳酸菌的生k 繁殖，可预先在发酵培养液中加入对乳酸菌生长 无影响或有促进作_ l | 的缓冲溶液，以渊雨l 控制发酵液p h 的相对稳定，保证乳酸凶生 k 繁殖必需的条件，使含菌量达1 0 9c f u m l 左右( 史嫒英，1 9 9 9 ) 。美国和意大利在此领 域处丁领先地位。此外还有川高形物脱脂乳，利川其中蛋白质羽i 磷酸盐的缓冲作i 浓 缩凶体的报道，由丁此法对凶的形态有影响，且h i 易离心，敞生产上极少应川，数据及 结果分析见表3 2 3 、表3 2 4 、剀3 15 、剀3 1 6 ： 表3 2 3 缓冲盐法浓缩圆体( s t ) t a b l e 3 2 3c o n c e n t r a t i o no f b u f i e rs a l t ( s f ) 表3 2 4 缓冲盐法浓缩菌体( l b ) t a b l e 3 2 4c o n c e n t r a t i o no fb u f f e rs a l t ( l b ) 东北农监夫学下学鹾| 学位论文 蛰3 1 5 缓冲盐竣浓续球越 f i g 3 - 1 5c o n c e n t r a t i o no f b u f f e rs a l t ( st ) 燃3 一 6 缓跨盐法浓缨耪菌 f i g3 * 1 6 c o n c e n t r a t i o n o f b u f f e r s a l t ( l _ b ) 优