（运动人体科学专业论文）低氧、运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及bcl2、bax表达的影响.pdf

北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 1英文缩略词表英文缩略词表（abbreviation） 英文缩写英文缩写 英文全称英文全称 中文名称中文名称 a/r anoxia/reoxygenation 细胞缺氧复氧 ad apoptotic body 凋亡小体 aif apoptosis-inducing factor 凋亡诱导因子 apaf-1 apoptotic protease activating 细胞凋亡蛋白酶激活因子1 factor-1 bax bcl-assosiated x protein bcl-2 相关 x 蛋白 bcl-2 b-cell lymphoma/leukemia-2 b 细胞淋巴瘤/白血病-2 bfgf basic fibroblast growth factor 成纤维细胞生长因子 ca2+ calcium ionophores 钙离子 cam calmodulin 钙调节蛋白 cat catalase 过氧化氢酶 cytc cytochrome c 细胞色素 c dmd duchennes muscular dystrophy 杜氏型肌营养不良症 dys dystrophin 抗肌萎缩蛋白 edta ethylenediaminetetra-acetic acid 乙二胺四乙酸 egta ethyleneglycoltetra-acetic acid 乙二醇双乙醚四乙酸 fas factor-associated suicide 自杀相关因子 fr free radical 自由基 gsh reduced glutathione 还原型谷胱甘肽 hif-1 hypoxia inducible factor-1 低氧诱导因子1 hilo living high and training low 高住低练 ice il-1-converting enzyme 白细胞介素1转换酶 北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 2mcc mitochondrial calcium concentration 线粒体钙 mda malonic acid 丙二醛 mrna messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸 nadph nicotinamide adenine dinucleotide 还原型尼克嘌呤二核苷酸磷酸phosphate oxidized form no nitric oxide 一氧化氮 parp poly(adp-ribose) polymerase 聚（腺苷二磷酸核糖）多聚酶pcd programmed cell death 程序化细胞死亡 pkb/akt protein kinase b 蛋白激酶 b pkc protein kinase c 蛋白激酶 c pt permeability transition pore 通透性转变孔道 ros reactive oxygen species 活性氧 sod super oxidant 超氧化物歧化酶 tnf tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子 tunel terminal deoxyribonucleotidyl 末端脱氧核糖核苷酸转移酶 tranferase mediated dutp nick 介导的 dutp 缺口末端标记法 end labeling ub ubiquitin 泛素 北京体育大学 学位论文原创性声明 北京体育大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交低氧、运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及 bcl-2、bax 表达的影响低氧、运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及 bcl-2、bax 表达的影响是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 北京体育大学北京体育大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校对本人递交的学位论文低氧、运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及 bcl-2、bax 表达的影响低氧、运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及 bcl-2、bax 表达的影响保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许在校内和与学校有协议的部门公布论文并被查阅和借阅。 本人授权北京体育大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密保密，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 3中中 文文 摘摘 要要 低氧、运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及低氧、运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及 bcl-2、bax 表达的影响表达的影响 本研究使用组织染色、末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的 dutp 缺口末端标记法（tunel） 、 dna 电泳及蛋白免疫组织化学法对低氧、 不同运动强度刺激后骨骼肌的凋亡情况进行了较深入研究；从凋亡的角度探讨了低氧、离心运动诱导的肌肉损伤。 实验中分别选用鼠龄为 7wk 的纯系雄性 sd 大鼠 56 只、雌性大鼠 128 只，实验分为二大组分别进行：即非力竭运动实验组及力竭运动实验组。其中，非力竭实验随机分成 7 组，每组 8 只。 （1）常氧对照组； （2）低氧对照组，分为低氧对照 4 天、7天两组； （3）常氧非力竭运动组，分为常氧训练 4、7 天两组； （4）低氧非力竭运动组，分为低氧训练 4、7 天两组。运动组每天进行常氧下跑台上坡跑训练 1 小时，跑速为 20m/min，坡度10。力竭组实验随机分为 16 组，每组 8 只。采用一次性跑台离心运动至力竭的损伤模型，跑台坡度为16。，速度 16m/min。与非力竭实验一样，低氧动物先在低氧舱中适应 3 天，然后分为低氧安静对照即刻、1、2、4、7 天组和低氧力竭运动后即刻、1、2、4、7 天组。常氧组为安静对照组和常氧力竭运动后即刻、1、2、4、7 天组。低氧和常氧运动组一次性力竭运动均在常氧环境下进行。低氧组动物放置在氧分压为 12.7的低氧舱中（相当于海拔 4000 米高度） ，所有低氧、常氧动物均自由饮食。 非力竭实验研究结果表明； （1）非力竭实验组中低氧对照 4 天、常氧运动、低氧运动后 sod 活性升高，而低氧对照 7 天后 sod 活性下降。随着低氧时间的延长 mda 保持较高水平，常氧运动未造成 mda 升高。总体而言，sod 活性增加与自由基增加的效应相互抵销或自由基增加的效应超出了抗氧化酶的作用。 （2）非力竭实验组中低氧暴露 7 天及低氧运动 7 天组线粒体钙浓度、mda 值升高，同时其 bcl-2 表达下降，骨骼肌细胞凋亡比例增高。低氧和运动的双重作用不会使细胞凋亡加重。 （3）非力竭组实验中常氧运动组运动后未出现明显的骨骼肌细胞凋亡， 说明运动诱导骨骼肌凋亡与运动强度和/或运动量有一定关系。 力竭实验结果表明： （1）力竭实验组中，急性低氧、常氧运动后随着时相的不同，sod、mda 均表现出先升高后下降的趋势，到第 7 天基本恢复正常，总体趋势是至 7天时自由基与抗自由基系统逐渐恢复平衡。 运动后常氧下更有利于自由基的清除。（2）力竭实验组中，急性常氧、低氧力竭运动引起的线粒体钙与 mda 的变化相似，均表现在运动后即刻有显著性增加，运动后 24 小时变化最明显，同时达到最高值，运动后48 小时开始下降，47 天基本恢复正常。 （3）对急性力竭组中常氧、低氧运动组不同时相的观察，发现运动后即刻、1 天及 2 天骨骼肌凋亡较之安静对照组明显增加，最高时相出现在运动后 2 天。 （5）急性低氧、力竭运动后激活了大鼠骨骼肌细胞的自杀程序，可能是由于运动后钙离子内环境紊乱和/或活性氧生成增加而造成的。 （6）从本研究结果可以推测细胞凋亡可能是造成低氧、力竭运动后骨骼肌损伤机制之一；北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 4低氧、常氧力竭运动后大鼠骨骼肌细胞凋亡进程相似，说明常氧运动后低氧恢复没有降低或加深骨骼肌细胞凋亡。 关键词：关键词：骨骼肌；低氧；力竭运动；细胞凋亡 北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 5abstract hypoxia、exercise effect on apoptosis and the expression of bcl-2 and bax in skeletal muscle of sd rats specialty: human sports science postgraduate: yang haiping tutor: prof. wang ruiyuan the purpose of this study was to investigate skeletal muscle apoptosis under hypoxia and different exercises by he stain, by the terminal deoxynucleotidyl transferase assay, by electrophoretic detection of fragmented dna and by immunohistochemistry. at the same time, the study researched hypoxia and eccentric exercise-induced damage in skeletal muscle of the rats from the angle of apoptosis. 128 female sprague-dawley rats (7-week old) were divided into two groups as the objects of this study: unexhausted training groups and exhausting eccentric exercise groups. furthermore, unexhausted training group were randomly divided into 7 groups (n=8): (1)unexhausted control(uc); (2)hypoxic unexhausted control(huc), were divided into 4-day and 7-day two groups; (3)normal oxygen training group(ot), were divided into 4-day and 7-day two groups; (4)hypoxic unexhausted training group(ht), included 4-day and 7-day two groups. the groups of ot and ht were trained for 1h/day on the treadmill (20meter/min, +10。uphill running). as the unexhauted training groups, all rats under hypoxia were laid in hypoxic chamber. they were accommodated to this condition for 3 days first, and then they were divided into the hypoxic sedentary control groups (killed on 0, 1, 2, 4, 7 days after exercise, hc) and hypoxic exhausting exercise groups (killed immediately and on 1, 2, 4, 7 days after a bout of exhausting exercise, he). as for the normoxic groups, they included one sedentary control group(ec) and five exhausting exercise groups (killed immediately and on 1, 2, 4, 7 days after a bout of exhausting exercise, oe). all the rats in the exercise groups performed exhausting exercises under normoxic condition. all the rats in hypoxic groups were placed in the hypoxic chamber in po2 12.7% (corresponding to the altitude of 4000m), and all rats fed food and water ad libitum. the main results of unexhausted training groups are as follows: (1)the sod activities of huc4、ot and ht groups were higher significantly than that 北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 6of uc group, but the sod activity of huc7 declined significantly than that of uc group. when the rats that were exposed to hypoxia was prolonged, their mda levels maitained higher, but the mda levels of ot4 and ot7 group were not different than that of uc group. in conclusion, a rise of the sod activities could counteract the effects of increased free radical generation, or the effects of the latter exceeded the effects of increased antioxidant enzymes. (2)huc7 and ht7 groupsmcc、mda concentration ascended, simultaneously their expression of bcl-2 descended, and their apoptotic percentages of the skeletal muscle cells of rats significantly were increased. the double effection of hypoxia and exercise was unable to obviously accelerate the skeletal muscle apoptosis. (3)huc7 and ht7 groupsapoptosis of the skeletal muscle cells were more than the control group, but these two groups were not different statistically, the results showed the apoptosis were ont increased significantly after hypoxic training, and showed there was a definite relationship between exercise-induced skeletal muscle apoptosis and training load and/or training intensity. the main results of exhausting eccentric exercise groups are as follows: (1)after he and oe groups had exercised, their sod and mda entirely showed that they firstly increased, and then decreased in the subsequently different time. in the seven day, their sod and mda basically recovered to the normal value, and their total tendency showed that the system of free radical and anti-free radical gradually recovered balance in the seven day. but oe groupsfree radical was more easily cleared away. (2)oe and he groupsthe changes of mcc were similar to those of mda, they all significantly increased immediately after eccentric exercise, and reached maximum at 24 hour after eccentric exercise, and began to descrease at 48h after eccentric exercise, basically recovered from 4d to 7d. (3)by observing oe and he groupsdifferent time after eccentric exercise, we found that apoptosis of the skeletal muscle were more than ec significantly at immediately、1d and 2d after eccentric exercise, and reached maximum at 2d after eccentric exercise.(4)he and oe groups activated pcd of the rats skeletal muscle following eccentric exercise, they perhaps were induced by dysfunction of the calcium ions homeostasis, and/or by an increase of ros at post-exercise. (5)the results showed that exercise-induced muscle damage might be initiated by the skeletal muscle apoptosis. it was found that the trends of he and oe groupschanges of the skeletal muscle apoptosis were basically consistent, showing that the process of the skeletal muscle injuries of the rats under hypoxia was consistent with 北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 7those under the normoxic condition and that hypoxia was unable to obviously accelerate or deepen the skeletal muscle apoptosis following a single bout of high-intensity exercise. key words:key words: skeletal muscle； hypoxia； exhausting exercise； cell apoptosis 北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 81 前言前言 人体各种形式的运动，主要是靠肌细胞的收缩活动来完成的1。骨骼肌是体内最多的组织，约占体重的 40，并在体育运动中起着极其重要的作用，因此成为运动人体科学研究的重点。 运动生理学起源于骨骼肌运动能力及代谢特征的研究， 20 世纪后期的研究更进一步证明骨骼肌在提高运动成绩中起着举足轻重的作用。 细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程， 是目前世界范围内生物学和医学领域研究的热点2。 细胞凋亡是多细胞生物生命活动中不可缺少的组成内容,是一个正常的生理过程，是动物、人借以存活的需要，因而贯穿于生物全部生命活动中。细胞增殖和细胞死亡的平衡维持对多细胞有机体的发育与生命的维持至关重要。 一旦调控细胞凋亡的信号途径遭遇破坏， 无论这种损伤来自于细胞外的触发剂、 获得性原因、遗传性突变或是病毒所致，都可引起一系列人类疾病包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病、多种神经退化性疾病等2。凋亡细胞在形态上和生物化学方面均有别于坏死细胞2345。细胞凋亡代表一种清除损伤、感染或不需要细胞的机制，它具有特殊形态改变，是一种不引起周围组织的炎性反应的单个细胞的死亡。凋亡出现时伴有细胞核、胞浆致密、细胞器互相靠近；染色质浓缩，沿着核膜排列，形成不同形状和大小的块状，然后染色质逐步分裂为碎片；与此同时细胞器也发生浓缩失去水分，而后细胞膜下陷，包裹核碎片和细胞器，形成凋亡小体234。而细胞坏死表现为胞体、细胞器肿胀，细胞膜破裂，形成小泡；染色质聚集成块，不均一，染色质 dna 被随机降解，有严重的炎症反应45。机体通过凋亡将携带不可修复 dna 损伤的细胞处死，从而避免 dna 损伤遗传给后代细胞。 这对维持机体的正常运转和防止肿瘤的产生具有十分重要的意义。 不仅如此， 生理情况下的正常细胞也可发生凋亡， 以适应机体的需要。细胞增殖和凋亡组成控制细胞群体大小的“阴阳”调节环2，这在生理上对于机体的生长和发育具有重要的意义。 目前，国内外研究人员对多种组织细胞的凋亡现象进行了全面研究，取得一定进展。但对运动刺激引起细胞凋亡现象的研究还比较滞后，特别是对骨骼肌细胞凋亡的研究更是少见，我们联机检索了美国国家图书馆，关于运动训练和骨骼肌细胞凋亡的研究论文仅有二十几篇。尽管目前细胞凋亡仍是医学、生物学研究的热点，但在运动人体科学中尚未引起足够的重视，国内这方面的研究更是寥若星辰456789。近几年医学、运动人体科学界对肌肉细胞的凋亡也进行了研究，已探明肌肉在一定条件下可发生细胞凋亡，其凋亡的形态学、生物化学特点与一般的凋亡细胞特点一致，与坏死细胞的形态学、生物化学特点大相径庭31011。相对而言，骨骼肌细胞因运动训练而诱发细胞凋亡的研究尚属起步探索阶段，因此，细胞凋亡在运动性肌肉损伤与修复机制中占何地位，起何作用；就目前国内外关注的低氧刺激而言，细胞凋亡又占何地位、起何作用，这些急需更多的实验研究来探索、阐明。对骨骼肌细胞凋亡进行细胞、基因水平的研究，将会使运动人体科学的研究向更深的领域发展，将使人们从一个全新的角度去认识运动对骨骼肌的影响，有利于探索运动对骨骼肌的影响机制，为运动北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 9训练、运动康复、运动治疗、基因治疗提供一定的理论依据。 高原训练作为提高运动能力的一种训练方法，已有半个世纪的历史。从一些已经取得良好效果的事例分析，体育界认为高原训练还是一种有效的训练方法12。hilo训练法是高住低练（living high and training low）的简称，是在传统的高原训练基础上发展起来的一种有效的提高运动耐力的科学方法。 这种训练方法是美国学者莱文（levine）首先提出的，它能克服传统高原训练的不足之处，有逐渐取代传统高原训练的趋势121314。 目前， 有关高原训练对骨骼肌影响的研究主要包括以下几个方面：骨骼肌的毛细血管变化、骨骼肌酶、骨骼肌的肌红蛋白浓度、肌肉缓冲能力、肌肉中的蛋白氧化、 骨骼肌 肌动蛋白基因表达的影响12。 而外来的损伤， 如果程度轻微，例如不太剧烈的温度改变，轻度的放射，抗癌药，甚至低氧，也可引起凋亡2；近来的证据指出缺氧通过凋亡的方式诱导细胞死亡，而非坏死，缺氧期间的凋亡信号是通过细胞色素 c （cytc） 释放和细胞凋亡蛋白酶激活因子1 （apaf-1） 介导的 caspase-9激活而引起的15；catherine 等的研究证明 bax（bcl-associated x protein, bcl-2相关 x 蛋白：与 bcl-2 促细胞存活的作用相反，bax 促细胞凋亡）及 bcl-2（bcl-2及其家族是调节细胞凋亡的主要基因，目前已经发现 15 个成员，按功能可分为抗凋亡，如 bcl-2、bcl-xl 等，和促凋亡，如 bax、bad、bid 等两大家族，其编码的蛋白质作用于线粒体，双向调节细胞凋亡）蛋白常氧下在骨骼肌中存在基本的表达，在缺氧条件下，肌肉适应需要 bcl-2 过度表达，以避免由于线粒体机能障碍而导致的细胞死亡16； 凋亡前体及抗凋亡蛋白的蛋白印记分析表明运动后即刻 bcl-2 相对 bax 水平下降，而运动后 96 小时比值出现倒转，从本质上而言，这促进了运动后即刻细胞的死亡，而 4 天后将有助于细胞存活17。如此看来，有关低氧训练对骨骼肌细胞凋亡的影响就值得研究，何种运动强度使细胞凋亡明显增多，低氧运动是否可引起更加严重的细胞凋亡，以及细胞凋亡与基因表达的时相是何关系1718，都不十分清楚，因此，无论从填补国内外空白的角度，还是为高原训练的运动实践服务，进行此项研究，无疑都有着重要的理论意义和实践意义。 另外，有关骨骼肌损伤的机制，学者们从多方面、多角度进行了阐述，并提出许多有关肌肉损伤机制的假说，但目前肌肉损伤的确切机制尚不十分清楚，对于运动性骨骼肌结构、机能变化机制的解释并不令人十分满意。目前，国内外有关骨骼肌损伤与细胞凋亡这方面的实验研究极其少见19， 国内马建等观察到大强度离心训练后兔骨骼肌凋亡细胞明显增多,但不够深入。 但这为探索肌肉损伤机制提供了新的研究思路。本研究拟从细胞凋亡的角度入手， 对骨骼肌细胞凋亡与骨骼肌损伤的发生有何内在关系进行初步研究。 综上所述,低氧刺激和不同运动强度刺激对骨骼肌细胞凋亡的影响值得深入研究。近年来,大量研究表明，活性氧（ros）与细胞调亡的关系密切20212223。随着剧烈运动会产生很高水平的活性氧,活性氧可能来自于： （1）从线粒体电子传递链中溢出； （2）由于 atp 消耗的增加而导致黄嘌呤氧化酶反应； （3）中性粒细胞激活。活性氧有和其它分子相互作用的强烈趋势， 因此， 会损害多种细胞的组成成分。 一般而言，北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 10在运动期间，肌肉代谢增加，线粒体等位点产生的活性氧也随之增多。氧自由基可使dna 受损，改变抑制或触发细胞凋亡的蛋白表达，直接导致细胞凋亡；氧自由基也可攻击细胞膜结构生成脂质过氧化物，一方面这种膜损伤可以直接诱发细胞凋亡，另一方面，脂质过氧化物可以刺激细胞外 ca2+进入胞内，也可导致线粒体和内质网或肌浆网内存储的 ca2+释放，胞内 ca2+增加激活细胞凋亡的信号传导途径。单独低氧或疲劳刺激可以增加活性氧的形成24。但是，疲劳刺激与低氧的结合可引起更复杂的环境变化，将产生更多的有害自由基，钙离子释放受到抑制25。大量的数据提示发生在肌肉收缩后的初期损伤，起因是机械性损伤，随后触发级联式反应，导致特征性的力量产生下降、 延迟性肌肉酸痛及细胞溶质蛋白的释放。 许多潜在的途径将影响继发的过程，包括自由基活性增强、肌肉钙离子内环境稳定性失调及局部肌肉缺血，但是所涉及的确切机制还不清楚26。凋亡研究最近经历了一场变革，将过去核决定凋亡过程的范例转变为线粒体构成死亡控制中心的范例27。线粒体是骨骼肌重要的代谢器官，同时也是肌细胞重要的 ca2+储存库，在调节运动过程中细胞 ca2+稳态中发挥重要作用28，而ca2+本身是一种诱导细胞凋亡的信号，在细胞凋亡中的作用受到普遍关注2，因此，研究骨骼肌细胞凋亡时，有必要同时观察自由基、线粒体钙离子的变化情况，以便更好地解释骨骼肌细胞凋亡的机理。 北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 112 文献综述 2 文献综述 国内外的有关研究表明：运动诱导骨骼肌细胞发生凋亡；运动所致骨骼肌细胞损伤的过程中除了细胞坏死外， 存在细胞凋亡。 本文试图从低氧、 常氧运动两种状态下，对骨骼肌细胞的凋亡情况及发生机理进行综述，以期为低氧训练、运动损伤的预防及治疗的措施提供理论依据。 2.1 关于细胞凋亡 2.1.1 细胞凋亡的概念 细胞凋亡（apoptosis）的概念由病理学家 kerr 等于 1972 年首先提出29，之后引起人们对这一生物现象的兴趣。凋亡通过生物化学方法能够很好地确定，尤其是wyllie 等 1980 年揭示了细胞凋亡独特的生物学特征， 即 180200bp 单体或寡聚核小体 dna 片段，其电泳谱为典型的“梯形带” （ladder pattern）30，使细胞凋亡倍受世人关注。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬。目前很多情况下，细胞凋亡也称为程序化细胞死亡（programmed cell death，pcd） ，但是，细胞凋亡与 pcd 既有区别，又有联系。一般而言，细胞凋亡是一个形态学的概念，是对细胞凋亡时所见到的固定形式的形态学描述，而 pcd 是功能上的概念。pcd 是发生于生长发育过程中的生理性细胞死亡，而细胞凋亡则是 pcd 的最常见、研究最多的方式2。 各种细胞发生凋亡的形态改变是相似的，表现为正常细胞群体中单个细胞的死亡。凋亡或程序性死亡（pcd）是一个主动的多步骤过程，以形态学、生物化学及需要相关的特殊基因调节的分子过程为特征。细胞自杀的程序在发育、细胞高度更替的组织中起到重要的作用，并且对几种疾病的发病机制起作用。早期的凋亡以核染色质浓缩及分离为特征，粒状物质着边在核膜周边，细胞质凝聚、核和细胞的轮廓卷绕。在后阶段，核断裂成不连续的片段，其被双层膜包被（凋亡小体） ，很快会被附近的细胞吞噬，并且在他们的溶酶体内降解3132。许多介质包括细胞因子、原致癌基因、bcl-2 家族成员、fas（fas/fasl 作为可直接启动细胞凋亡的信号途径,是介导细胞凋亡最为重要的膜蛋白分子）配体受体系统、ice 样蛋白酶以及其他参与调节凋亡细胞死亡的级联反应。凋亡的起始由许多基因控制，其表达由不同的细胞内外信号精确地调节。一些基因产物是凋亡的激活剂（如：bax, p53, ice-family, fas） ，而另外一些则是抑制剂（如：bcl-2, bcl-x） 。当诱导细胞凋亡的因素存在时，生物体内基因将启动凋亡（即：bax、fas 及 p53 等）的蛋白和抑制凋亡（bcl-2、bcl-xl）的蛋白表达，并且结果决定于这两类基因表达的比值，bcl-2 高于 bax 促进生存，而比值北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 12相反则促进凋亡21。 这些基因表达的特殊蛋白质存在于核内 （p53） ,线粒体内 （bcl-2，bcl-xl）和其它细胞器内。 细胞凋亡和坏死之间存在明显的不同，在形态学、生化代谢、分子机制、结局和意义方面都有本质的区别。当细胞遭受致命性损伤时，坏死发生，且以肿胀、细胞破裂及炎症为特征。这类损伤在离心运动后表现的非常典型，且以延迟性肌肉酸痛为特征26。但是，凋亡是一个正常的、受遗传控制的过程，其以细胞皱缩、胞膜出疱及染色质浓缩为特征。细胞凋亡时，内源性核酸内切酶和 caspases 酶（半胱天冬酶，细胞凋亡的感受器和执行者）的激活导致不可逆的 dna 碎片产生，其随着细胞碎片进入膜周缘的凋亡小体内。这些凋亡小体随后被周围细胞或巨噬细胞所吞噬2729。坏死的细胞常常是成群的细胞一起丢失，而细胞凋亡是细胞内有规律的机制引起的，它可由某些因素诱导但不是坏死性的改变。细胞凋亡往往需要新的基因转录和蛋白质合成，因而需要能量；而细胞坏死时没有新的基因表达和蛋白质合成，不需要能量，dna 被随机降解为任意长度的片段2。理解凋亡与坏死的不同可以找到可能的干预治疗，以降低过度的凋亡死亡。 尽管凋亡产生的确切机制至今尚未完全弄清楚， 并且依赖于不同的细胞类型或刺激，但是最近的证据表明线粒体对调节脊椎动物的凋亡有重要的作用。急性运动期间肌肉线粒体氧化剂产物的增加已被证明损伤 dna 和蛋白质3334。dna 损伤数目重大能改变抗凋亡及促凋亡蛋白的表达，并启动凋亡过程。另外，其他因素如氧化剂产物增加和还原型谷胱甘肽（gsh）水平下降能触发线粒体释放激活 caspases 的蛋白质，如细胞色素 c 和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，aif） 。细胞色素 c 从线粒体释放入细胞溶质是早期的凋亡活动。 细胞溶质中的细胞色素 c 与细胞凋亡蛋白酶激活因子（apaf-1）及 atp 结合组成复合物，这个复杂的过程能激活 caspase-9，其具有启动蛋白水解级联活动而导致凋亡的作用35。 动力学数据显示在凋亡典型信号开始表现之前，线粒体在细胞膜的完整性方面执行主要的改变。这些改变牵涉到线粒体内膜及外膜，导致内跨膜电位中断及膜内蛋白通过外膜而释放。凋亡的细胞游离系统证明线粒体产物成比例地限制细胞提取物内的 caspases 和核酸内切酶的激活。功能研究指出给予药物打开或关闭线粒体大的通道（也叫通透性转变孔道，即 perme -ability transition pore，pt 孔道）可以诱导或阻止凋亡。抗凋亡肿瘤蛋白 bcl-2对线粒体起到稳定膜完整性及阻止巨大通道的开放作用。 这些观察结果和凋亡的三步模型是一致的：1）线粒体前阶段，在此期间信号转导级联或损伤途径被激活；2）线粒体阶段，在此期间线粒体的膜功能丧失；3）线粒体后阶段，在此期间从线粒体释放的蛋白引起分解代谢蛋白酶和核酸酶的激活。 线粒体在凋亡中的重要作用对理解凋亡的正常生理功能、对癌症的调节、变性疾病及新的细胞毒素、细胞保护药物的开发具有重要的影响27。 对于凋亡机制的研究仍有许多尚待深入的区域， 根据现有的资料来看， 细胞凋亡是依次序发生的，可以分成四个阶段。第一阶段是细胞凋亡刺激信号，包括能引起细胞凋亡的物理刺激、化学刺激生理性刺激等；第二阶段是信号感应和传递，这一阶段北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 13信号可以通过多种途径进行传递；第三阶段是中心控制和效应阶段，是各种凋亡信号汇集之处，在这里对信号进行处理并启动细胞凋亡；第四阶段是细胞死亡阶段，在此阶段细胞结构发生变化，胞质和染色体浓缩、dna 断裂，凋亡小体形成并被邻近细胞吞噬。大量证据表明，不同诱导细胞凋亡的因素可以通过相同的信号传导系统诱发细胞凋亡；在一种体系中促进细胞凋亡的信号可在另一个体系中抑制细胞凋亡。同时，不同信号传导系统也不是各自独立的，而是相互联系和相互作用的整体，呈复杂的调控网状结构。 2.1.2 细胞凋亡的检测 随着研究技术的提高和对细胞凋亡的认识不断深入， 检测细胞凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的特点可以鉴定出来，目前研究细胞凋亡常用的方法有：（1）细胞凋亡的形态学检测：通过光镜、电镜及荧光显微镜观察细胞形态学的变化。形态学观察简便、直观，并可保存标本。（2）生物化学方法：琼脂糖凝胶电泳检测细胞核 dna 片段化， 凋亡细胞的生化特征是基因组 dna 发生有规律的不可逆性降解， dna 链被 ca2+-mg2+ 依赖的内源性核酸内切酶从核小体间切断，形成大约 180200bp 的多倍寡核小体片段或它的倍数关系，这一分子生物学机制目前已作为鉴定凋亡细胞的主要证据之一；细胞凋亡钙离子浓度的检测等。（3）分子生物学方法：细胞凋亡相关基因表达；细胞膜成份外露检测，如用 annexin v（连接素 v）检测磷脂酰丝氨酸；细胞膜通透性改变检测，如测标记蛋白、标记核酸及染料进入细胞等；流式细胞仪检测，可进行 dna、rna 含量及细胞周期分析、细胞表面标志分析及细胞受体分析等，具有快速、准确、灵敏和能同时进行多种因素分析等特点，已广泛用于细胞凋亡研究，如亚g1期凋亡细胞、 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法 （tunel法） 、缺口平移法等36。（4）其他细胞凋亡检测方法：通过检测细胞体积大小分布的变化，也可以简便、快速地鉴定细胞凋亡；激光共聚焦显微镜：在细胞凋亡研究方面，借助激光共聚焦显微镜可以更清楚地观察到细胞内部的结构， 对凋亡细胞固缩染色质和核碎片进行定位，借助荧光标记还可以了解凋亡细胞内部的信号传导，实时检测细胞内环境的各种动态变化37。应当指出的是，迄今为止，各种检测细胞凋亡的方法，没有哪一种方法是绝对特异的，每种方法都有自身的优缺点，应该避免使用单一的方法，最终的方法选择依赖于具体的研究体系、目的和要求，应结合各方面因素综合考虑，因此，多种方法的结合是必要的，也是必须的38。 2.2 骨骼肌细胞凋亡现象的研究 凋亡，已知在正常的发育中广泛存在，也是在肌发生期间肌肉细胞数目、形状的主要调节者。在蝌蚪和昆虫的变形方面，条纹肌纤维的缺失由凋亡来完成，尽管形态北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 14学上不像典型的凋亡特征（胞质的改变远先于核的改变） ，但死亡还是很明显地程序化且在正常生理调控下进行313239。 fidzianska401980 年报道了哺乳动物， 包括人类，在胎儿肌肉发育的早期，高于 40的肌细胞要通过凋亡来清除。另外，fidzianska等41 对婴儿期的棘肌萎缩肌肉凋亡也进行了描述。 donatella 等42的结果证明凋亡并不限于病理性肌肉，也可以发生在正常成熟的骨骼肌纤维。肌纤维片段的迁移或个别肌核的迁移表现出适应骨骼肌结构、大小的生理性机制，是应对功能改变的需要。此外，他们的研究数据证明网络结构的相关改变，如 dystrophin 及一些相关蛋白下降，表示具备足够开启凋亡过程的信号。另外，与 dystrophin 复合物有关的蛋白信号的紊乱也对激活凋亡起到一定作用。凋亡可能是一个被骨骼肌所利用的生理性机制，以适应其被改变的结构和形态的功能需要42。 alvar等43使用tunel及western blot两种互补的技术对骨骼肌细胞凋亡的数量进行了测定，发现用两种技术来测定凋亡水平的结果呈线性相关，并且正常健康成人用 tunel 法测定凋亡百分比为：3.81.8%。而 sandri 等44报道正常肌肉显示很少的tunel 阳性核（不足 0.1%） 。临床前，新生儿病人的肌肉表现出类似的凋亡核数目（0.3%） ，而来自 47 年 dmd（duchenne 型肌营养不良症）病人样本的肌肉表现出明显的凋亡阳性核，达到 2.1。凋亡核的统计分析肯定了正常样本与 dmd 样本之间有差异。tunel 阳性核，主要是带有 dna 碎片的细胞核，存在于间质组织。另一方面，这些核的很小百分比在肌纤维内，并且它们中的大多数聚集在中央。同时 sandri 等用免疫细胞化学技术分析了与程序性死亡有关蛋白在肌肉内的含量，即：在正常及缺乏肌增强因子肌肉内的 bcl-2、bax 的表达。正常肌肉中 bcl-2 及 bax 阳性肌纤维以几乎是阴性的方式为特征，在一些肌纤维内仅能观察到微弱的信号，而凋亡的肌核却不是这样。在 dmd 肌肉内，在一些肌纤维中 bcl-2 的基本表达表现为完全阴性，而在另外一些则增加。相反，bax 蛋白表达与 bcl-2 的表达截然不同，表达非常明显。在bax 表达增加而 bcl-2 低水平表达的样品中，凋亡肌核增高。bax 及 bcl-2 阳性肌纤维的水平与凋亡肌核的百分比相关，即：很少凋亡肌核的肌肉表现出高水平的 bcl-2阳性肌纤维；相反，最高及最明显凋亡的样品也同时表现出显著性高水平的 bax 阳性肌纤维。正如期待的那样，凋亡肌核可以在 bcl-2 及 bax 共同表达的很少数或特别是高水平表达 bax 的肌纤维中观察到。因此，肌纤维的亚成分中 bcl-2 下调同时 bax 上调将出现凋亡肌核。相反，fas/fasl 系统在肌肉凋亡中的作用并不明显，因为有两项研究已经揭示出在骨骼肌组织中存在 fas 及 fasl， 但没有凋亡发生4546。 然而， french等47在肌肉发现了 fasl 和 fas 的 mrna，并且 fas 产物在肌纤维中有表达48。对正常骨骼肌细胞凋亡数目、基因调控的研究结果并非完全一致，这可能与取样时间、测试方法及骨骼肌的机能状态等有关， 确切的数目、 调控方式仍需经过大量的实验去求证。 成肌细胞和卫星细胞是肌肉生长和再生的来源， 对维持肌肉细胞数目具有重要意义，因此也有学者研究了成肌细胞及卫星细胞的凋亡现象。胚胎骨骼肌的凋亡是一个众所周知的活动过程4950。如同在许多其他组织，其由发育程序来支配，是一个清除过多未分化细胞的过程。 由不同的非生理性试剂诱导的婴儿肌肉细胞变性的超微结构北京体育大学博士研究生学位（毕业）论文 15研究， 如丁哌卡因、 蛇毒和寒冷， 证明所有这些有害的刺激可引起不足 5 天鼠的凋亡，而超过 7 天龄的鼠产生坏死， 因此提示作为对损伤反应的肌肉细胞死亡的机制取决于细胞成熟分化状况51。如果细胞死亡的凋亡、坏死形式通过形态学标准非常清楚地加以定义，那么凋亡似乎是一种例行的细胞对未分化肌肉细胞损伤的反应，而成熟肌纤维对同样蛇毒刺激发生坏死反应。 人类胚胎的观察指出肌肉凋亡可发生在不同的发育阶段，最初在肌管阶段，许多不需要的细胞通过凋亡加以清除，因此减少了肌肉细胞的最终数目。在 2024 周发展的后阶段，多个单个细胞从似乎决定最终肌肉细胞大小及形状的细胞群中被清除26。 一些学者研究了某些神经源或骨骼肌疾病与细胞凋亡有关。vescovo 等52研究证实，在心力衰竭实验模型和人类，心力衰竭越严重者，骨骼肌凋亡的重要程度越大。以往人们认为 dys（dystrophin,抗肌萎缩蛋白）的缺