（微生物学专业论文）印度洋深海多环芳烃降解菌的多样性分析及降解菌新种的分类鉴定与降解机理初步研究.pdf

摘要 摘要 多环芳烃( p o l y a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 是指分子中含有两个或两个以上苯 环的烃类，在环境中持久存在，具有广泛的毒性、致突变性、致癌性。探索p a i l s 在 环境中的归宿问题，已发展成为当今环境科学研究的前沿课题之一。生物，尤其细菌 是去除环境中p a h s 的主力军。而深海环境中与p a h s 等有机污染物降解有关的细菌 还很大程度上不为人知。寻找高效的p a h s 降解细菌，研究其降解基因，探索其代谢 途径，能更加有效的将降解菌应用于生物修复。 本论文主要对印度洋西南洋中脊深海环境中p a h s 降解菌的多样性和重要的 p a h s 降解菌进行了研究。采集了西南印度洋中脊热液区附近1 个水柱( d y l 0 51 7 a i r - c t d 5 ) 的9 个深海水层海水样品用混合p a h s ( 菲、芘、荧葸、蒽) 和单一p a h 为 碳源进行富集筛选，得到了9 个混合p a h s 降解菌群和9 个菲降解菌群。采用d g g e 和单菌分离培养相结合的方法对菌群多样性及菌群富集过程的动态变化进行了分析。 同时对2 株重要的p a h s 降解新菌进行了分类鉴定、基因组学和代谢组学方面较为系 统的研究，探讨其降解特性，分析了相关功能基因，推测出了可能的代谢途径。获得 的主要结果如下： 1 用混合p a h s 和单一菲作为碳源，富集印度洋深海海水样品，获得了高效的 p a h s 降解菌群和菲降解菌群。采用平板分离法，在9 个混合p a h s 降解菌群中分离 到2 9 个不同的属的1 6 8 株可培养细菌。可培养细菌的系统发育分析表明，它们分别 属于6 个大类，其中主要是变形菌纲a 亚群( 6 2 哟和丫亚群( 2 3 ) 细菌，其它4 类分别 为变形菌纲p 亚群( 3 ) 、高g + c 革兰氏阳性菌类群( 3 ) 、c f b 类群( 6 ) 和低 g + c 革兰氏阳性菌类群( 3 ) 。其中a 亚群包含2 9 个属中的1 8 个属，种属多样性 十分的丰富。单菌降解实验表明，分离获得的大多数菌株都能利用p a h s 进行生长。 其中a l t e r i e r y t h r o b a c t e r ，b a c i l l u s 、c i t r i c e l l a ，l d i o m a r i n a 、l u t i b a c t e r i u m 、m a r i c a u l i s 、 t h a l a s s o s p i r a ，m a r t e l e l l a ，p s e u d i d i o m a r i n a ，r o s e o v a r i u s 、s a t j p g e r 等菌属未有过 p a h s 降解的相关报道。 2 采用p c r d g g e 法对p a h s 降解菌群和菲降解菌群跟踪分析了p a h s 降解菌 群和菲降解菌群中优势菌的形成过程和菌群的结构动态变化。分析结果表明，虽然不 同水层和不同时期的菌群有所不同。但与新鞘氨醇杆菌、食烷菌、节杆菌、巴尔通氏 摘要 体菌、a z o s p i r i l l u m 和r h o d o v u l u m 等菌属近缘的菌株是菌群中最常见的优势菌或较优 势的菌。其中巴尔通氏体菌、a z o s p i r i l l u m 和r h o d o v u l u m 等菌属还没有降解p a h s 的 相关报道，可能是潜在的海洋p a h s 降解菌。动态分析发现，第8 d 是混合p a h s 降解 菌群富集过程中的关键时期，此时菌群结构变化较明显。此时菌群中对p a h s 的代谢 可能已经由菲转到对其他p a h s 的降解。相比之下，菲的降解菌群在4 d 时趋近稳定， 此后菌群结构没有非常明显的变化。 3 从d y l 0 51 7 ai r c t d 5 站位的深海水样中分离了一株高效的p a h s 降解菌 h 2 5 ，其1 6 sr r n a 基因与新鞘氨醇杆菌属的n o v o s p h i n g o b i u mp e n t a r o m a t i v o r a n s u s 6 11 有最高同源性为9 6 0 。通过生理生化特性、脂肪酸成分的分析，g + c m 0 1 的测定和d n a d n a 杂交结果表明菌株h 2 5 为新鞘氨醇杆菌属的一个新种，命名为 ( n o v o s p h i n g o b i u mi n d i c u m ) 。芳环羟基化双加氧酶( r i n g h y d r o x y l a t i n gd i o x y g e n a s e ， r h d s ) 是p a h s 降解过程中控制苯环的起始加氧，是微生物降解反应的限速步骤。 我们通过引物设计，从该菌株中扩增出了两条含有p a h s 降解起始双加氧酶大小亚基 及其上下游序列的基因片段。比对发现，h 2 5 菌株含有至少两套与芳烃降解有关的双 加氧酶系统，能较好的利用多种p a h s 。这说明在研究不多的未受污染的深海区域蕴 藏着许多具有清除有机污染潜力的菌种，是值得进一步探索和研究的新领域。 4 对本实验室从西南印度洋中脊沉积物样品( d y l 0 51 7 ai r t v g 4 站点) 分离到 的p s e u d o r u e g e r i a 属新菌株p t g 4 1 进行了鉴定。通过1 6 sr r n a 基因序列的系统发 育分析，生理生化特性的比较，脂肪酸成分的分析及g + c m 0 1 的测定，确定该菌株 为p s e u d o r u e g e r i a 属的一个新种( p s e u d o r u e g e r i ai n d i c u m ) 。对该菌株的p a h s 降解范 围和降解率进行了测定发现，该菌株是一株广谱、高效的p a h s 降解菌，在环境生物 修复中具有较大的应用前景。为了解菌株p t g 4 1 的代谢机理，就其对菲、二苯并噻 吩、荧蒽的代谢中间产物进行了检测和分析，并初步推测出了其主要的代谢途径。从 检测结果来看，菌株p t g 4 1 的代谢途径与以往发现的其他菌属菌株对菲、二苯并噻 吩和荧葸的代谢途径有相似之处，但不完全相同。其具体的代谢相关酶系还在进一步 实验中。 关键词：印度洋深海；多环芳烃；降解菌；多样性；代谢途径 i i a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y c y e l i ea r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( e a h s ) w e l ea r eu b i q u i t o u sc o m p o u n d sc o n t a i n i n gt w oo rm o r e b e n z e n er i n g s t h ep r e s e n c eo fp a h si nt h ee n v i r o n m e n ti sac o n s i d e r a b l ep u b l i ch e a l t h h a z a r db e c a u s e o ft h e i ri n t r i n s i cc h e m i c a ls t a b i l i t y , h i g hr e c a l c i t r a n c et od i f f e r e n tt y p e so f d e g r a d a t i o n a n dh i g ht o x i c i t yt o l i v i n go r g a n i s m s t h ep r i n c i p l ep r o c e s s e s f o rt h e i r s u c c e s s f u lr e m o v a la r ec u r r e n t l yb e l i e v e dt ob em i c r o b i a l t r a n s f o r m a t i o na n dd e g r a d a t i o n b u tb a c t e r i ai n v o l v e di no r g a n i cp o l l u t a n td e g r a d a t i o ni nd e e ps e ae n v i r o n m e n t sa r el a r g e l y u n k n o w n t h i ss t u d ya i m e da tf i n d i n gb a c t e r i ac a nu t i l i z ep a h s ，i d e n t i f y i n gt h ef u n c t i o n a lg e n e s i n v o l v e di nt h eb i o d e g r a d a t i o n ，a n de l u c i d a t i n gp a h sm e t a b o l i s mp a t h w a y t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： i i nt h i sr e p o r t ，t h ed i v e r s i t yo fp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n ( p a h ) 一d e g r a d i n g b a c t e r i ai nt h ed e e ps e aw a t e rc o l u m no f4 7 6 6 mw a t e rd e p t hw a sa n a l y z e d t h es a m p l i n g s i t ew a so nt h es o u t h w e s ti n d i a nr i d g e ( i r ) ，n e a r b yw h e r es e v e r a lh y d r o t h e r m a lv e n t s l o c a t e a f t e re n r i c h m e n tw i t hap a hm i x t u r e ( p h e n a n t h r e n e ，a n t h r a c e n e ，f l u o r a n t h e n ea n d p y r e n e ) a n ds i n g l ep a h ，9p a h a n d9p h e n a n t h r e n e d e g r a d i n gb a c t e r i a lc o n s o r t i aw e r e o b t a i n e d ，o n ea te a c hs a m p l i n gd e p t hr a n g i n gf r o m2 0 m t o8 2 0 ma b o v et h eb o t t o m b o t h c u l t u r e d e p e n d e n ta n di n d e p e n d e n tm e t h o d sr e v e a l e dm a n y n e wb a c t e r i ai n v o l v e di np a h d e g r a d a t i o n ，w h i c hs i g n i f i c a n t l yd i f f e r e dw i t ht h o s ep r e v i o u s l yr e p o r t e d s t a t i s t i c a l l y , a l p h a a n dg a m m as u b c l a s s e so fp r o t e o b a c t e r i aw e r ec o n f i r m e da s t h em a j o rg r o u pi nt h e c o m m u n i t i e s ；a c t i n o b a c t e r i a ，t h ec f bg r o u pa n dt h ef i r m i c u t e sb a c t e r i aw e r ea d d i t i o n a l l y d e t e c t e d a j t h o u g hc o m m u n i t ys t r u c t u r e sd y n a m i c a l l yc h a n g e ds p a t i a l l ya n dt e m p o r a l l y ， b a c t e r i ac l o s e l ya f f i l i a t e dt oa l c a n i v o r a x ，n o v o s p h i n g o b i u m ，r h o d o v u l u m ，b a r t o n e l l a ， a r t h r o b a c t e ra n da z o s p i r i l l u mm o s tf r e q u e n t l yo c c u r r e d i na d d i t i o n ，m a n yb a c t e r i ah a dt h e h i g h e s ts i m i l a r i t i e sr a n g i n gf r o m8 8 t o9 7 w i t h16 sr r n ag e n es e q u e n c e sr e t r i e v e d f r o mg e n b a n kd a t a b a s e h o w e v e r , o n l yp a r to ft h ed e t e c t e db a c t e r i ah a sn o tb e e ni s o l a t e d a m o n gt h o s ep u r i f i e di s o l a t e s ，m o r et h a nh a l fw e r ec o n f i r m e dt og r o ww i t ht h ep a h s m i x t u r e 2 an o v e lg r a m - n e g a t i v e ，p a h d e g r a d i n gb a c t e r i u mi s o l a t e df r o md e e ps e aw a t e ro f m a b s t r a c t i n d i a no c e a nw a ss t u d i e dp h e n o t y p i c a l l y ，g e n o t y p i c a l l ya n d p h y l o g e n e t i c a l l y t h ei s o l a t e c a nu t i l i z es e v e r a lp o l y c y c l i ca r o m a t i c h y d r o c a r b o n s a n a l y s e so f 16 sr r n ag e n e s e q u e n c e ，d n ab a s ec o m p o s i t i o na n dw h o l e c e l lf a t t ya c i dp r o f i l er e v e a l e dt h a tt h ei s o l a t e i sam e m b e ro ft h eg e n u sn o v o s p h i n g o b i u m h o w e v e r , t h es e q u e n c es i m i l a r i t yo fi t s16 s r r n ag e n et ot h o s eo fk n o w nm e m b e r so ft h i sg e n u sn o v o s p h i n g o b i u mr a n g e do n l yf r o m 9 2 1 t o9 6 0 ，i m p l y i n gt h a tt h ei s o l a t ei sd i s t i n c t i v e t h er e s u l t so fd n a d n a h y b r i d i z a t i o ne x p e r i m e n t sa n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o na l s oi n d i c a t et h a tt h ei s o l a t e r e p r e s e n t san o v e ln o v o s p h i n g o b i u ms p e c i e s ，f o rw h i c ht h en a m en o v o s p h i n g o b i u m i n d i c u ms p n o v w a sp r o p o s e d t h et y p es t r a i ni sh 2 5 i na d d i t i o n ，t w of r a g m e n t sw h i c h c o n m i n e dt h eaa n dps u b u n i to fd i o x y g e n a s eg e n ea n di t su p s t r e a ma n dd o w n s t r e a m s e q u e n c e sw e r eo b t a i n e db yp c r 3 ab a c t e r i u mn a m e dp t g 4 1w a si s o l a t e df r o md e e p s e as e d i m e n ta tt h es i t ed y l0 5 17 ai r t v g 4o fi n d i a no c e a n a c c o r d i n gt oi t s m o r p h o l o g y ，p h y s i o l o g y ，f a t t ya c i d c o m p o s i t i o na n d16 sr r n ag e n es e q u e n c e ，t h en o v e ls t r a i nf i t t e dw e l li n t ot h eg e n u s p s e u d o r u e g e r i a ，b u tc o u l db ee a s i l yd i s t i n g u i s h e df r o ma l lo t h e rk n o w np s e u d o r u e g e r i a s p e c i e sd e s c r i b e dt od a t e t h en a m ep s e u d o r u e g e r i ai n d i c u ms p n o v i sp r o p o s e d ，w i t ht h e t y p es t r a i np t g 4 1 i ti sa b l et od e g r a d eaw i d er a n g eo fp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) t og e ti n s i g h ti n t ot h em e c h a n i s mo fb i o d e g r a d a t i o n ，t h ei n t e r m e d i a t e so f f l u o r a n t h e n e ，p h e n a n t h r e n ea n dd i b e n z o t h i o p h e n ed e g r a d a t i o nw e r ee x a m i n e dw i t h g c m s a n dt h e i rb i o d e g r a d a t i o np a t h w a y sw e r ea l s os u g g e s t e d f o ri t sb r o a du t i l i z a t i o no fp a h sa n da d a p t a b i l i t yi nm a r i n ee n v i r o n m e n t ，s u c has t r a i n m a yb eu s e f u lf o rb i o r e m e d i a t i o na p p l i c a t i o n si np o l l u t e do c e a n s f u r t h e ra n a l y s i si so nt h e p r o g r e s s i ns u m m a r y , t h i sr e p o r tr e v e a l e df o rt h ef i r s tt i m et h a tp a hd e g r a d i n gb a c t e r i aa r e w i d e s p r e a di nt h ed e e p s e aw a t e rc o l u m n e v i d e n t l y , t h e yt a k ep a r ti nt h ec a r b o nr e c y c l i n g o fm a d n ee c o s y s t e mb ym i n e r a l i z i n gt h ep e r s i s t e n to r g a n i cc o m p o u n d s ，w i t hm i n u t eb o d y s i z eb u th u g ee f f e c t s ，c o n s i d e d n gt h eo l i g o t r o p h i ca n db o u n d l e s sd e e ps e ae n v i r o n m e n t s k e y w o r d s ：i n d i a no c e a n ；p a h s ；d e g r a d e r ；d i v e r s i t y ；m e t a b o l i s mp a t h w a y s i v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成果。本 人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适 当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范( 试 行) 。 另外，该学位论文为( 厦门大学生命科学学院郑天凌课题组和国家海 洋局第三海洋研究所邵宗泽课题组) 的研究成果，获得( 国家“9 7 3 ”重 点基础研究发展规划项目( 2 0 0 4 c b 7 1 9 6 0 1 ) ；国家自然科学基金( 3 6 1 0 0 5 0 1 ； 4 0 3 7 6 0 4 1 ) ；国家自然科技资源共享平台建设项目( 2 0 0 5 d k a 2 1 2 0 9 ) ) 课题 经费或实验室的资助，在( 海洋三所海洋生物遗传资源重点实验室) 完成。 声明人( 签名) ： 毒罾 洲g 年占月 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等 规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文 ( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库 被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论 文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影 印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () i 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于 年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文应是 已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审 定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论 文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：去参 谜年? 月乙日 前言 l 刖置 伴随着近年来各国沿海地区经济的迅速发展，海岸带资源开发规模不断扩大， 越来越多的有机污染物通过各种途径进入海洋环境，使得沿海海域的水质、底质 和生态环境日益恶化，海洋污染日趋严重。其中，对海洋环境影响最大的污染物 除了石油、有机营养盐以及重金属等外，还包括在海洋环境中含量极少、但危害 性极大的难降解有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t i o n s ，p o p s ) 。p o p s 主要包括 有机氯农药、二嗯英、多氯联苯和多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ， p a h s ) 等。多环芳烃是一类广泛分布于环境中的含有两个以上苯环的有毒有害污 染物，作为海洋环境有机污染物黑名单之首，广泛分布于海洋环境中，由于其潜 在毒性、致癌性及致畸诱变作用【1 捌，通过生物累积及食物链的传递作用，给海洋 生物体、生态环境和人体健康造成了极大危害，已引起了各国环境科学家的高度 重视。美国环保局早在8 0 年代就已把1 6 种未带分支的p a h s ( 图1 1 ) 确定为环 境中的优先污染物f 3 1 ，我国也把p a h s 列入环境污染的黑名单中。 海洋环境尤其是深海环境蕴藏着众多不为人类所知的微生物，它们具有数量 巨大，代谢类型多样和适应突变能力强等特点，是海洋污染环境生物修复的主体， 任何存在污染物的地方都会出现相应的降解微生物，并存在着或强或弱的生物降 解作用【4 1 。了解海洋环境中多环芳烃降解微生物组成，并从中分离筛选具有高效 p a h s 降解能力的菌株，研究其p a h s 降解的遗传控制方式，解析相关酶及其基因 功能，探索其代谢途径，探索如何更加有效地促进p a h s 污染的生物修复进程， 已成为当今环境科学研究领域的前沿课题。 前言 c h r y s e n e 屈 b n e z o ( b ) f l u o r a t h e n e 苯并【b 】荧蒽 f l u o r e n e 芴 b e n z o ( k ) f l u o r a n t h e n e 苯并【k 】荧蒽 b e n z o ( a ) i ，r e n ed i b e n z ( a ，h ) a n t h r a n c e n eb e n z o ( g h i ) p e r y l e n e i n d e n o ( 1 , 2 ，3 一c d ) p y r e n e 苯并【a 】芘 二苯并【讪】葸苯并睡h ，i 】花 i 孽i 1 2 3 c ，d 】并芘 图1 - 1u se p a 优先管制1 6 种多环芳烃的结构图 f i g 1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so fs i x t e e ni n d i v i d u a lp a hc o m p o u n d sw h i c h h a v eb e e ni d e n t i f i e da sp r i o r i t yp o l l u t a n t sb yu se p a 2 拿) 瓣 麟塑菲弼等黟 前言 1 1 多环芳烃简介 1 1 1 多环芳烃的结构及特性 多环芳烃是指两个以上苯环连在一起的化合物。两个以上的苯环连在一起有 两种方式：一种是非稠环型，即苯环与苯环之间各由一个碳原相连，如联苯、联 三苯等；另一种是稠环型，即两个邻位碳原子为两个苯环所共有，如萘、葸等。 多环芳烃是以苯环作为主要结构的碳氢化合物，其同分异构物种类多，且是仅相 差两个氢原子的同环异构物，其极性通常很低，当其连接的苯环越多时，在水中 的溶解度就越低。p a h s 在纯水中的溶解度极小，但在自然海水中，有大量的溶解 性有机物质存在，p a h s 与其中某些表面活性剂可以产生溶剂化作用，从而形成胶 束，使p a h s 在海水中的溶解度增大。p a h s 很容易被吸附在土壤或累积在生物体 中，特别是较高分子量( 四环以上) 的可以保持其固有的毒性而持续存在，其物理和 化学特征随分子量的不同而不同。纯的p a h s 大部分是无色、白色或黄绿色的固 体，略有些刺激味道，p a h s 在常温下通常系以固体型态存在，随着环数之增加， 熔点及沸点也随之增加。 1 1 2 多环芳烃的来源 存在于环境中的多环芳烃有天然和人为的两种来源。前者包括：某些细菌、 藻类和植物的生物合成产物；森林、草原燃起的野火及火山喷发物；从化石燃料、 木质素、底泥等散发出多环芳烃是长期地质年代间由生物降解物再合成的产物。 人为来源主要有：工业工艺过程。工业生产过程中所产生p a h 的量占其总量的 绝大部，这其中绝大部分作为有目的的应用而加以收集，极少量则所排废水、废 气及废渣进入环境，尽管相对量很少，但进入境后所占有的浓度却相当大。焦化 煤气、有机化工、石油工业、炼钢炼铁等三废所排放的废弃物中即有相当量的p a h 无三废处理措施，排入大气、水及土壤环境中即可对人和其动物产生持续危害， 监测数据表明，焦化煤气工业所排放的水中含有多种p a h ，其中b a p 可达 2 5 钆4 6 0 p g l ，大于0 0 3 p g l 的国家排放标准；而有机合成工业排放废水中p a h s 也在1 8 i t g l 左右；炼焦工艺中高温干馏所产生的2 0 0 度以上馏份的主要成分约含 4 8 0 种芳烃，如果在生产工艺过中不严格进行控制，就会有p a h 外溢。欠氧燃 3 前言 烧。燃煤燃烧的情况在生产与生活活动中最为普遍，且生产使用的煤量最大，是 工业企业获取能源的主要途径。燃煤除生二氧化碳、氮氧化物、部分硫氧化物外， 在供氧不足时，例如鼓风、引风量不足时均会产生大量p a h 。据测定，1 k g 标准 可产生4 0 - - 6 8 m g p a h 。利用燃油获取能量的场合也很多如燃油锅炉、窑炉、汽车、 轮船、内燃机车等均要使用各种燃油，欲充分发挥其应有的作用，就必须在燃油 的前处理和燃烧程中下大力气，如预加热，加压，雾化，燃烧室升温等，当这工 作做得不妥时，燃烧效率将大打折扣，不但不能获取应有能量，还会产生大量烟 尘、一氧化碳和p a h 。欠氧燃烧在生活饮食的活动中表现得十分突出，生活饮食 灶不管是使用煤炭、燃油和燃气，由于无动力鼓风引风设备或这类设备不完善， 故燃料得不到与氧气充分混合而形成欠氧燃烧产生大量的有害气体。有人作过试 验，居室厨房内做饭时有害气体如b a p 的含量可达5 5 9 n g 1 0 0 m 2 ，超过国家卫生 标准成百倍。食品制作。在食品制作的过程中，有许多制作方法是不可取的， 例如油煎、油炸、烟熏、烧烤等，因为脂肪高温状态下可裂解产生p a h s 及其它 衍生物。通过研究，产生p a h 途径还很多，但产生数量相对较少1 5 1 。 1 1 3 多环芳烃的毒性及危害 p a h s 具有致癌、致畸、致突变的作用。由于p a h s 的稳定性和疏水性，造成 其能持久地存在于环境中，特别是造成高分子量的p a h s 大量的积累。由于p a h s 的高脂溶性而很容易被动物的肠胃吸收或在人体富脂肪器官和乳液中累积，并能 经食物链级联放大而富集并迅速地、广泛地分散到不同的组织( 定位身体的脂肪 中) 发挥作用【6 1 。研究表明，很多p a h s 类物质具有类似激素样的效应，导致生物 的内分泌紊乱，因此它们又被称为环境激素。 p a h s 的毒性主要是从两方面发挥作用。一方面是由于p a h s 的化学结构特性， 即其能稳定地吸收可见光( 4 0 0 一7 6 0 n m ) 和紫外光( 2 8 0 - - 4 0 0 n m ) ，因而对紫外线 辐射的光化学效应特别敏感。细胞水平的研究表明，同时暴露在p a h s 和紫外线 的照射下，会加速损伤细胞组织的自由基的形成。即机体内的p a h s 在氧分子的 参与下，产生氧自由基，如羟基自由基o h ，超氧阴离子0 3 ，单线态氧1 0 2 等， 通过脂质过氧作用破坏细胞膜，可能还会进一步损伤d n a 、蛋白等生物大分子和 线粒体、核糖体等细胞器等( p a h s 光致毒性主要是光促机理) 。另一方面是p a h s 4 刖茜 进入生物体后，首先被其细胞色素p 4 5 0 依赖的混合氧化酶系氧化或羟基化，然后 一些内源性的分子如谷胱甘肽、葡萄糖醛酸等在第二阶段酶的催化下被氧化后的 p a h s 代谢产物结合形成低毒而且容易排放的产物【刀。但是有些p a h s 经过细胞色 素p 4 5 0 依赖的混合氧化酶系氧化或羟基化后转化成致癌物。芳香烃类致癌物的结 构与活性相关的研究表明，p a h s 及其产物是通过蛋白质的酮一稀醇互变异构过程 中起一种催化作用，从而导致蛋白的不可逆转变，进而使细胞癌变。此外，在p a h s 的代谢过程中伴随着大量的自由基的产生，由于自由基具有亲电性，极易与各种 生物大分子结合，导致酶失活、蛋白结构变异、d n a 断链等一系列的损伤，并进 一步引起细胞组织器官的病理变化。 绝大多数p a h s 及其中间代谢产物具有致突变的特性，其机理主要有以下三 个方面【8 】：1 ) 直接与靶细胞d n a 形成加合物，造成d n a 损伤和染色体畸变；2 ) 在原癌基l 因( r a s ) 的易感位点产生突变或激活r a s 基因，诱导其过量表达并最终导致 细胞癌变；3 ) 中间代谢产物参与机体的氧化还原系统产生活性氧，导致蛋白质和 脂类等生物大分子的过氧化，造成生物膜的损伤。近年的毒理学研究表明，绝大 多数p a h s 衍生物是直接致突变物或潜在致癌物，其致突变性和致癌性较之母体 强数十至数千倍。 1 1 4 多环芳烃在环境中的归宿 多环芳烃在环境中的归宿包括挥发、光氧化、化学氧化、生物积累、土壤吸 附及微生物降解等。多环芳烃在自然界中发生的化学反应可分为取代反应和加成 反应，即分子中的不饱和化学键被破坏，生成较稳定的化合物 9 1 。此外，多环芳 烃在自然环境中的反应大多是光氧化反应，在自然光或人造紫外线的照射下，多 环芳烃会与氧气、臭氧或其它氧化剂反应生成内环过氧化物。另一方面，葸的光 化学氧化会生成二聚体，如双葸。菲( p h e n a n t h r e n e ，p h e ) 是葸的角状同分异构 体，它不能发生二聚合反应，但是会氧化生成9 ，1 0 醌。臭氧也可与这类化合物发 生剧烈反应，生成含有醌基化合物和奎宁类化合物【1 0 】。多环芳烃还可以与氧化氮 或稀硝酸反应。如苯并芘在室温下与硝酸的稀乙酸苯溶液迅速发生硝化反应，生 成单硝基衍生物【1 1 1 。多环芳烃还非常容易与大气特别是气溶胶中的s 0 2 、s 0 3 、或 硫酸反应，生成水溶性的磺酸、亚磺酸和双磺酸。但诸多研究表明，微生物降解 前言 在p a h s 的迁移转化乃至最终从环境中消失的过程中占有重要的地位，是环境中多 环芳烃去除最主要的途径【1 2 1 。 1 2p a l - i s 降解菌多样性及群落结构分析方法 1 2 1 微生物多样性研究的传统方法 2 0 世纪4 0 年代以来，人们一直采用分离培养的方法来研究海洋微生物的多样 性，即将海洋微生物从环境中分离纯化，然后通过一般的生物化学性状或者特定 的表现型来分析其多样性。然而，随着人们对海洋微生物研究的不断深入，发现 这种方法并不能全面地反映海洋微生物多样性的现状，因为海洋中微生物往往集 结在一起，一些微生物经常处于“活的非可培养状态”( v i a b l eb u t n o n c u l t u r a b l e s t a t e ，v b n c ) ，而且用于分离培养的培养基具有很强的选择作用【1 3 】，这些都导致 了建立在微生物纯培养技术上的传统方法只能反映极少数微生物的信息，不能充 分全面反映海洋微生物的生态功能，也使大量的具有极大应用价值的海洋微生物 资源被埋没了。a m a n n 等【1 4 】根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育 学的研究结果认为：通过实验室人工培养方法已经分离和描述的海洋微生物物种 数量仅占估计数量的l 5 ，而其余9 5 9 9 的微生物类群仍然未被分离和认识。 1 2 2 微生物多样性研究的现代方法 由于认识到了传统研究方法的不足，研究人员开始尝试其他的方法，从而避 开对纯培养技术的依赖。这几种方法虽然在一些方面具有传统方法无可比拟的优 越性，但也存在着很大的局限性【4 】：( 1 ) 荧光显微镜直接计数法，此方法通过荧 光染色和滤膜浓缩相结合，以研究环境中微生物的丰度，但由于不能提供关于微 生物形态的准确信息，所以无法在微生物分类上提供足够信息。( 2 ) 扫描电镜法， 只能揭示微生物外部形态，并不能提供进行微生物分类的足够信息。( 3 ) 透射电 镜法，此法的限制性类似于扫描电镜法，且十分昂贵。( 4 ) 微生物醌指纹法，通 过分析微生物醌的组成，可以定量评价海洋环境中微生物的群体组成和微生物多 样性。该方法简单方便，灵敏度高，其局限性是不能反映具体哪个属或哪个种的 变化。( 5 ) 微生物微量板鉴定分析技术，主要是通过微生物对微量板上各类碳源 的代谢能力进行检测而建立起来的一系列微生物数值分类鉴定系统，如美国的 6 前言 b i o l o g 、b b lc r y s t a l 、英国的s e n s i t i t r e 、法国的b i o m e r i e u x 等微生物鉴定系统。此 外还有美国m i d i 微生物鉴定系统，通过菌体脂肪酸气相色谱分析，利用菌体膜脂 肪酸构成差异来进行微生物鉴定。这些分类鉴定技术可以应用于海洋微生物多样 性的分析研究，但由于种种限制，应用得并不广泛。 1 2 2 1 分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用 自1 9 8 5 年p a c e 等利用核酸序列的测序来研究微生物的进化问题以来，对微生 物多样性的研究便进入了一个崭新的阶段【1 5 】。采用聚合酶链式反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 、1 6 sr r n a 基因序列分析以及a r d r a ( a m p l i f i e dr d n a r e s t r i c t i o na n a l y s i s ) 等现代分子生物学技术在基因水平上研究海洋微生物多样性， 可以克服微生物培养技术的限制，能够对样品进行比较客观的分析，较精确地揭 示海洋微生物的多样性。目前，分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应 用主要集中于以下几个方面。 分子杂交法( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) 包括膜杂交和原位杂交方法等。其原理是：人工合成能与某类群微生物特征 基因序列互补的寡聚d n a 或r n a 探针，并以荧光或放射性标记该探针，然后利用 探针与微生物基因杂交，通过荧光显微镜技术或放射自显影技术对微生物的群落 结构进行研究。与后面将要介绍的其它方法相比，特点是不需要对目标基因进行 p c r 扩增，因此可以避免p c r 过程中产生的误差；但是同样由于未对目标基因进 行扩增，目标基因浓度较低，有时会给检测带来困难；且有时目标类群的目标基 因序列并非完全同一，而是有亚类群之间的差异，结果所设计的探针d n a 序列与 某些亚类群的目标基因互补性较差，从而导致对该类群的估计过低【1 6 j ；而更重要 的不足之处是，只能用来检测事先估计到其存在、已知其目标基因序列、并为之 设计好引物的类群。 聚合酶链式反应法( p c r ) 实际上除上面的分子杂交法之外，下面将要介绍的几类分子生物学方法都需 要对目标基因进行p c r 扩增，然而仅依靠在p c r 试验中使用具有类群特异性的 引物，不进行酶切、变性、克隆和电泳等后续手段，也能够用来鉴别特定微生物 类群的存在1 7 1 。p c r 法与后面几种方法是紧密联系的，它的优缺点也影响着后面 将要介绍的几种方法的质量。其原理是利用人工合成的引物介导的d n a 聚合酶链 7 刖舌 式反应，根据不同水平的特异性，仅需知道两段已知序列，就可以扩增出未知的 d n a 区段。微生物多样性研究中对p c r 法的应用包括定性和定量研究，定量的 p c r 分析方法较为复杂，可分为：稀释p c r ( l i m i t i n gd i l u t i o np c r ) t 1 8 , 1 9 、动力学 p c r ( k i n e t i ep c r ) 和竞争性p c r ( c o m p e t i t i v ep c r ) 。p c r 法实验操作简单快捷，灵 敏度高，对样品的要求低，只要有完整的靶序列即可，失活的样品也同样适用。 但p c r 也具有其显著的局限性：首先，t a q 酶缺乏3 _ 5 端的外切酶活性，因而 不能纠正反应中发生的错误的核苷酸掺入，发生“错配”使p c r 产物有一定比例 的错误序列，而且随着反应循环数的增加，错配将不断积累；其次