医学免疫学免疫学检测技术ppt课件.ppt

免疫学检测技术,Immunodiagnosis,1,第一节抗原或抗体检测,I.Detectionofantigensorantibodies,2,一、抗原-抗体反应的特点,Specificity（一）高度特异性Cross-reaction:commonantigen交叉反应：共同抗原Antiserumabsorption抗血清吸收1stantibodyavidity互补程度：亲和力；亲合力,4,Visibility,（三）可见性的条件CompatibleconcentrationsofantigenandantibodycombinedinproportionatornearequivalenceAntigen:multivalent;Antibody(IgG):divalent比例适合：抗原多价，抗体2价。交织成网。Phvalue;Temperature;Ionicconcentration条件适宜：酸碱度、温度、离子浓度Adequateconcentration,bindingstrength;reactiontime足够浓度、结合强度和反应时间,5,Prozonephenomenon前带现象,6,二、抗原-抗体反应的应用,Terms术语Serologicalreaction血清学反应Qualitativeanalysis定性Quantitation定量Orientation定位Titration滴定Titer效价/滴度,7,三、常用的抗原-抗体反应技术,经典技术中和反应补体结合反应凝集反应沉淀反应,8,I)Agglutination,（一）凝集反应：颗粒性抗原或包被有可溶性抗原的颗粒+相应抗体肉眼可见的凝集块1.直接凝集颗粒性抗原+相应抗体玻片凝集：抗原定性（ABO血型）试管凝集：抗体定量（肥达反应）2.间接凝集包被有可溶性抗原的颗粒+相应抗体红细胞（间接血凝）；乳胶（间接乳凝）CoombsTest:红细胞（Rh抗原）+不完全抗体+抗人球蛋白3.派生的试验反向间接凝集反应：包被抗体的颗粒+抗原间接凝集抑制反应：（乳胶妊娠试验）抗体+未知抗原+包被有相应可溶性抗原的颗粒凝集？,9,Haemagglutination,10,II)Precipitation（二）沉淀反应,可溶性抗原+相应抗体肉眼可见的沉淀物使用半固体琼脂凝胶为介质琼脂扩散/免疫扩散1.单向免疫扩散：抗原的定量（Ig、C3）2.双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析3.免疫电泳：电泳+双向免疫扩散（抗原分析）4.对流电泳：双向免疫扩散+电泳（抗原/抗体定性）5.火箭电泳：单向免疫扩散+电泳（抗原定量）免疫比浊：抗体+递增量抗原比浊（抗原定量）,11,III)ImmunolabellingTechniques（三）免疫标记技术,标记物：荧光素、酶、放射性核素、电子致密物质、化学发光物质标记对象：抗原或抗体用途：定性、定量、定位免疫荧光法（IFA）荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位（1）直接荧光法（2）间接荧光法：荧光素一抗荧光素二抗对每种抗体作标记不必标记每种抗体特异敏感测Ag测Ag/Ab,12,免疫荧光法,13,2.酶免疫测定（EIA）:ELISA与酶免疫组化,（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原（2）间接法ELISA：查抗体（3）BAS-ELISA：Biotin-Avidin-酶放大系统（4）ELISPOT测定法：_包被物待测物测定结果_抗CK抗体CK分泌细胞单一CK已知抗原B细胞特异B细胞（5）酶免疫组化*酶标抗体+组织/细胞（未知抗原）+形态学检查,*免疫组化技术：可对抗原定性、定量、定位酶免疫组化：HRP免疫金银组化：胶体金颗粒免疫电镜技术：HRP、胶体金、铁蛋白,14,双抗体夹心法、间接法ELISA,15,间接法ELISA,16,ELISA操作图,可调移液器,8孔道可调移液器,17,3.放射免疫测定（RIA）,常用125I，测定微量物质4.化学发光免疫分析常用鲁米诺，测定超微量物质5.免疫印迹法（WesternBlotting）先做凝胶电泳将蛋白质分区再将蛋白质转移至固相载体后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定,18,第二节免疫细胞的测定,一、淋巴细胞的分离与类型鉴定（一）血细胞分离外周血密度梯度离心法外周血单个核细胞（淋巴细胞+单核细胞）吸附培养分离法淋巴细胞尼龙毛，抗CD3单抗，E花结T细胞B细胞,19,（二）淋巴细胞鉴定,免疫荧光法常用间接法测CD3/CD4/CD8、mIgM/mIgD2.磁珠分离法如抗CD4抗体交联微珠可分离CD4与CD83.流式细胞术（FlowCytometry,FCM）可分析细胞大小、核型、表面分子（多种荧光标记）检测各类免疫细胞及其比率白血病、淋巴瘤的免疫学分型细胞分选,20,二、淋巴细胞功能测定,（一）T细胞功能测定1.T细胞增殖试验：丝裂原/抗CD3刺激/特异抗原细胞增殖（1）同位素掺入法（2）MTT法（3）形态观测法2.细胞毒试验CTL、NK细胞杀伤靶细胞（1）51Cr释放法（2）凋亡细胞检查法阶梯状酶切图谱TUNEL法FCM,21,3.细胞因子检测,（1）免疫学检测法夹心法ELISAFCM（2）生物学检测法细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验细胞毒（或细胞毒抑制）试验（3）分子生物学检测法RT-PCR测定mRNA4.皮肤试验：测试IV型超敏反应能力,22,（二）B细胞功能测定,B细胞增殖试验小鼠：LPS人：SPA；抗IgM2.抗体形成细胞检测溶血空斑试验ELISPOT试验,23,（三）吞噬细胞功能的测定,趋化功能测定Boyden小室2.吞噬功能测定,24,第三节补体及循环免疫复合物的测定,25,III.Applicationofimmunologicaltechniques第四节免疫学检测方法的应用,1.Assessmentandselection一、免疫学检测方法的评估与选择Reliability:truevsfalse可靠性(goldstandard*=真阴性率与真阳性率)*Specificity=真阴性/（真阴性+假阳性）x100%*Sensitivity=真阳性/（真阳性+假阴性）x100%Safety安全性Simplicity简易性Savingoftimeandmoney经济性,26,Selectionasperrequirementandavailability依据需要与可能选择,Screening:初筛highsensitivityfirst,toavoidcasemissing避免漏诊Diagnosis:确诊highspecificityfirst,toavoidmisdiagnosis避免误诊,27,2.Clinicalapplication二、免疫学检测方法的临床应用,1)Infectiousdiseases（一）感染性疾病pathogen病原体的特异抗原或抗体检测2)Immunodeficiencydiseases