PCR诱变ppt课件.ppt

1,PCR诱变,.,2,PCR诱变,（1）PCR定点诱变（2）几种碱基变化的PCR引入（3）PCR随机诱变（易错PCR）,3,一、PCR定点诱变,应用PCR原理，可以直接进行定点诱变，并且不需要采用噬菌体M13.首先，把需诱变的基因克隆于质粒上，把带有诱变目标基因的质粒，分成两个反应管，每个反应管加入不同的引物，每个反应管的一对引物中，有一个引物需按诱变意图改变碱基，即该碱基是错配的，每对引物的互补位置不同，同一管中每条几乎处于同一起点但放向相反。,4,经PCR后，每个管产生了含有改变了特定碱基的产物，但留有缺口。因此，产物是线状的DNA链，由于引物互补位置不同，两个管的产物的缺口位置也不同，当把两个反应管的产物混合，经变性和退火处理，来自不同反应管的线状DNA链可杂交形成双链环状的DNA分子，但仍有缺口。由于环化分子可以转化大肠埃希菌，在体内可把缺口修复，这样可以获得定点改变了特低碱基的基因。,5,6,1、重叠延伸PCR(over-lapextensionPCR,OE-PCR)2、大引物PCR法（megaprimerPCR)3、环状诱变PCR法4、TAMS定点诱变技术,7,1、重叠延伸PCR（OE-PCR）,首先设计两个PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段，随后将上述两个PCR产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互为引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率,8,9,2、大引物PCR法（megaprimerPCR),先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物PCR法。,10,大引物PCR定点诱变技术路线,（圆点指突变位点）,11,3、环状诱变PCR法,定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用诱变剂进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。方法：两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其5端有l5个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自行环化。,12,环状诱变PCR法,13,环状诱变PCR法,14,4、TAMS定点诱变技术,有目的地扩增突变链定点诱变技术:能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的扩增突变链，从而使突变链效率几乎达到100%1、线性单链DNA模板的制备。（线性PCR）2、突变链的合成:用2个锚锭引物(Anchor5和Anchor3)和多个诱变引物(Mut1和Mut2)，首先在多核苷酸激酶的作用下使每个引物磷酸化，接着在DNA聚合酶的作用下使引物与线性模板退火、延伸，最后在DNA连接酶的作用下。合成突变链。3、有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3)，使其3端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增引物只能退火到突变链而不是亲本链，所以只有突变链才能扩增。,15,TAMS定点诱变技术,16,二几种碱基变化的PCR引入,首先，在诱变引物合成时，按设计使某位置发生4种核苷酸均有出现的可能。例如，要合成一段含三个G的引物，只要在G原料中加入一定比例的A、C、T，那么可以出现在G位置上含G、A、T或C的产物。这段引物是结合于基因上需要诱变的位置的。在PCR之前，需把目标目标基因或序列克隆于质粒，并使目标基因两端的质粒上均有内切酶切点，以方便把克隆片段切出。,17,扩增战略：,18,三、PCR随机诱变,当对目的序列了解很少的情况下，需要引入大量的随机诱变，构建突变库，再逐个筛选和鉴定策略1、利用简并引物2、易错PCR(error-pronePCR),19,1、利用简并引物,简并引物的特点5端有十几个碱基是随机组合的。这一方法除引物特殊外，其余均与定点突变技术完全一样。利用简并引物可以产生大量随机突变，并且这些突变都集中在很窄的一段区域内。,20,2易错PCR（error-pronePCR）,DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种特定基因进行随机诱变的可能方法。利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错PCR。原理：较低的聚合酶（如Taq酶）在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变,21,方法：增加Mg2+的浓度、改变dNTP的比例、调节热循环参数、利用Mn2+替代天然辅助因子Mg2+、加入dITP（三磷酸脱氧核苷酸类似物）此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物，但易错PCR一般只产生点突变，因此其产生的突变体在多样性方面尚有一定缺陷。,22,连续易错PCR（sequentialerror-pronePCR),在通常情况下，经过一次易错PCR很难获得满意结果，由此发展出连续易错PCR将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下