（材料物理与化学专业论文）免疫检测荧光微球的制备和性能研究.pdf

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 i 摘要摘要 荧光微球是指直径在纳米级至微米级范围内，负载有荧光物质，受外界能量 刺激能激发出荧光的固体微粒。其外形可为任意形状，典型的外形为球形。荧光微 球的载体多为有机或无机聚合物材料。它具有相对稳定的形态结构和发光行为，受 外界条件如溶剂、热、电、磁等的影响比纯粹的荧光化合物要小，其作为一种新型 的载体材料已广泛应用于生物医学领域。 本文分别用种子聚合法和分散聚合法制备了荧光微球，并对制备荧光微球的实 验工艺，微球形貌和实验后期处理进行了对比，我们选择分散聚合法制备荧光微球。 并在此基础上进行了双荧光峰的荧光微球的制备和性能研究。通过光学显微镜和场 发射扫描电镜对荧光微球进行了形貌表征，用激光粒度分析仪对荧光微球的粒径进 行了表征，用紫外可见分光光度计，荧光分光光度计和荧光显微镜对微球的荧光性 质进行了分析，用红外光谱分析和电导滴定，对微球表面的官能团进行了测定。光 学显微镜和场发射扫描电镜的照片表明了高分子荧光微球呈现很好的球形，表面光 滑，且分散均匀。激光粒度分析图表明离心过的高分子荧光微球的粒径比较均匀， 大致呈正态分布。紫外吸收光谱图和荧光光谱图表明荧光素已经被包覆到球内，我 们可以通过改变两种荧光素的比例制备不同强度的荧光微球，荧光显微镜照片表明 我们制备的荧光微球具有很好的荧光性质。红外光谱分析和电导滴定的测定表明， 我们制备高分子荧光微球表面带有-cooh 官能团。容易和生物分子相连，适合做免疫 检测的载体。 关键词：关键词：荧光微球； 种子聚合法；分散聚合法；荧光 ；表面cooh 官能化 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ii abstract fluorescent microspheres refer to the solid particles which diameter is between nano to micron range, loading the fluorescent material. when they are stimulated by the outside energy, they show fluorescence. its shape can be many shapes, typically the spherical, fluorescent microspheres carrier are organic or inorganic polymer materials. it displays stable structure and luminescent behaviour. by the external conditions such as solvents, heat, electricity, magnetism, the effects of fluorescent compounds are smaller than purely fluorescent compound. they have been used in biomedicine filed widely as a new kind of carrier material. fluorescent microspheres are prepared by seed polymerization and dispersion polymerization separatly in this paper. we compare the two methods in the experimental process, microspheres morphology and post-processing. dispersion polymerization are chosen to make fluorescent microspheres with two fluorescent peaks.the fluorescent polymer microspheres morphology are studied by optical microscopy and field emission scan electron microscopy, and use.laser particle size analyzer to measure size.distribution of fluorescent microspheres . the fluorescence properties of microspheres is characterized by uv-vis spectroscopy, fluorescence spectroscopy and fluorescence microscopy. the microsphere surface functional groups are analyzed by infrared spectroscopy and conductivity titration. optical microscopy and field emission scan electron microscopy images of fluorescent microspheres illuminates that polymer microspheres with uniform particle size have good dispersibility and morphology, without noticeable defects .size distribution of fluorescent microspheres shows that the fluorescent polymer microspheres with uniform particle size are roughly normal. uv-vis absorption spectra and fluorescence spectra illuminates that the dye has been coated into the microspheres, we can change the ratio of two types of dyes to make different fluorescence spectra of the 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 iii fluorescence microspheres. from the photos of fluorescence microscopy we can see that fluorescent microspheres shows good fluoresce. infrared spectroscopy and conductivity titration determined that fluorescent microspheres surface are covered with carboxyl groups, these carboxyl groups can be easily linked to biological molecules, which shows these fluorescent microspheres are suitable for immunoassay carrier. key words: fluorescent microspheres; seed polymerization; dispersion polymerization;fluorescent; functioned with cooh 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 1 绪论绪论 1.1 荧光微球的研究进展 1.1 荧光微球的研究进展 荧光微球是指直径在纳米级至微米级范围内，负载有荧光物质，受外界能量刺 激能激发出荧光的固体微粒。其外形可为任意形状，典型外形为球形。荧光微球的 载体多为有机或无机聚合物材料，具有相对稳定的形态结构以及发光行为。受外界 条件如溶剂、热、电、磁等的影响比纯粹的荧光化合物小。荧光微球的制备技术是 建立在普通微球的制备方法之上的，所以我们先介绍一下大粒径微球的研究进展。 1.1.1 大粒径聚合物微球制备方法的研究进展 1.1.1 大粒径聚合物微球制备方法的研究进展 1.1.1.1 聚合物微球的特征及其应用前景 所谓微球，是指直径在0.01-l0um范围内具有球形外观的微小粒子 1。一般来说， 聚合物微球具有如下一些特征 2: 1. 体积小，因而可以迅速的响应刺激，可以用做标记物和标准物； 2. 比表面积大，因此可以提供足够的场所供吸附、解吸附、化学反应、以及对光进 行散射等等； 3. 高扩散性和运动性，其分散体系具有较低的粘度，从宏观上其可以通过重力场、 电场等产生运动，微观上可以通过布朗运动产生运动，从而不断更新分散介质的 相互作用界面； 4. 在一定条件下具有相对的分散稳定性； 5. 相对均匀的粒径及形态分布； 6. 多样化的制备方法及用途； 由于具有以上的特征，使功能性聚合物微球在标准计量、分析化学、医学免疫及 生物化学方面具有广阔的应用前景 3。因此，多功能、高性能聚合物微球的合成及应 用己经成为国内外学者致力的一个研究热点，并取得了长足的进步。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 1.1.1.2 聚合物微球的基本制备方法 聚合物微球的制备包括两条基本路线，如图fig1.1 2 所示。路线1是单体经非均 相聚合直接制备得到聚合物微球。路线2是单体聚合成高聚物后，或者天然的高分子 材料经过一些加工方法(大部分是物理方法)而得到聚合物微球，主要包括乳液固化 成型法、凝聚成型、溶剂蒸发成型法、或溶剂抽提成型法等 4，5。 对于制备具有均 匀粒径及表面形态的功能聚合物微球，路线1具有相当大的优势。而对于用于药物释 放的载体微球的制备，路线2具有天然的好处，因为大部分药物释放载体材料均选用 天然高分子材料。本论文所注目的焦点是乙烯基单体经非均相聚合得到聚合物微球 以及其表面改性引进功能基团的方法，即路线1所示的方法。fig1.2 2是乙烯基单体 fig 1.1 制备聚合物微球的两条基本路线 经非均相聚合得到聚合物或对其进一步处理得到新微球的方法。大致上分为两类， 一类是非均相聚合直接得到聚合物微球，包括乳液聚合法、无皂乳液聚合法、沉淀 聚合法、悬浮聚合法以及分散聚合法。另一类是在已有微球的基础上，进行进一步 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 的处理，得到新的聚合物微球，主要有种子溶胀聚合法等，此类方法的最大的优点 是可以形成明显的核一壳结构，或者是得到单分散的大粒径微球。但是，由于制备 方法繁琐耗时，产率低，影响了其应用前景。fig1.2 2还展示了不同制备方法所得到 的聚合物微球的粒径范围。从图中可以看到，乳液聚合的适用范围是亚微米级范围， 无皂乳液聚合适用于亚微米级接近微米级的范围，分散聚合则可制备从亚微米到微 米级范围内的聚合物微球，悬浮聚合制备的微球其粒径最大，从几微米到几百微米， 而沉淀聚合得到的微球，其粒径范围最广，可以从纳米级到几十微米。种子聚合则 适用于制备几微米到几十微米范围内具有单一分布的功能化聚合物微球。尽管沉淀 合、悬浮聚合所制备的聚合物微球具有粒径较大的优点，但是因为其产物粒径分布 不均匀，所以一般不用来做制备聚合物微球。 figure 1.2 不同制备方法所得到的聚合物微球的粒径范围 1.1.1.3 单分散大粒径聚合物微球制备研究进展 自1955年美国里海大学乳液聚合物研究所vanderhof和brodford教授成功合成单 分散聚合物微球以来 6，单分散、大粒径聚合物微球的制备方法至今己经取得了很大 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 的进展，所谓大粒径一般在亚微米级到几十微米。目前，制备单分散大粒径微球的 方法主要包括分散聚合法和种子聚合法。 分散聚合法是70年代初发展起来的一种聚合方法，此种方法的提出，为聚合物 微球的合成开辟了一个全新的领域。因为具有简便易行、产物性能好的优点，30年 来，分散聚合法得到了充分的发展。初期分散聚合法的研究，主要集中在单一品种 单体的聚合方面，着重探讨聚合反应的条件，如单体、引发剂、稳定剂和分散介质， 然后逐渐过渡到用多种单体的共聚制备功能聚合物微球。在研究聚合条件时，同步 进行分散聚合机理的研究，并取得了巨大的成就，tseng，lok，lu ，pr ochazka以 及paine等人 7-12做出了开创性的贡献。在聚合物成核方面，目前所公认的成核机理有 两种，即由tseng等人提出的齐聚物沉淀机理，和由lok等人提出的接枝共聚物聚结 机理 7.8 ，随着分散聚合方法的逐渐成熟和聚合机理的逐步完善，分散聚合已不仅仅 局限于单一品种聚合物微球的制备，而是向多功能、多形态、多品种发展。如今， 以该方法为基础，已经成功地开发出交联结构功能微球 13，中空多孔微球14，核一 壳结构功能微球 15，16，磁性微球17，18， 热敏微球17等新型品种并应用于许多领域， 特别是生物医学领域。 除了分散聚合外，还有一类制备单分散大粒径聚合物微球的有效方法，可统称 为种子溶胀法。所谓种子溶胀法，首先用无皂乳液聚合、分散聚合或雾化法等方法 制成小粒径单分散聚合物微球，然后以此为种子进行单体溶胀，使颗粒长大，再引 发聚合的方法。到目前为止，己经发展出常规溶胀法，逐步溶胀法，活性溶胀法以 及动力学溶胀法等。常规种子溶胀法即将聚合物种子在分散体系中直接用一定量的 单体溶胀一定时间，然后进行聚合，得到聚合物微球。如kubo等人 19，20 在0下用 st-氯甲基苯乙烯或st-dvb单体混合物，溶胀用分散聚合制备的2微米单分散聚苯乙 烯微球，24小时后进行聚合反应，得到3微米的单分散微球。逐步溶胀法 21是指把种 子颗粒进行多次溶胀，多次聚合最终制备聚合物微球的方法。根据morton 22 分散颗 粒热力学方程，可以计算出种子颗粒被单体溶胀后体积将增大2倍，粒径将增大1.4 倍。反复溶胀，反复聚合即可得到大粒径微球。从理论上讲，小粒子增长速率大于 大粒子，经过一连串溶胀聚合步骤后，粒径分布应当变窄。实际上若控制不当，每 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 一步都有可能产生新的小颗粒，很难得到单分散微球。另外，所需时间较长，造成 颗粒聚并，使体系稳定性变差，粒径分布变宽 23。 70 年代末 ，ugelstad等人 23-25发明了一种制备大粒径、单分散聚合物微球的新 方法，即活性溶胀法(或二次溶胀法)。用这种方法可以制备粒径为1-100um，分散系 数小于2%的聚合物微球。这种方法主要采取两个步骤，首先向种子分散体中引入一 种齐聚物或一种低分子化合物，这样可以使颗粒溶胀度提高1000倍。接着，把经第 一步溶胀的种子分散体系用单体和油溶性引发剂进行溶胀，待达到溶胀平衡后，升 温进行聚合反应，即可得到大粒径单分散聚合物微球。 90 年代，日本的okubo教授 26-29又提出一种新的溶胀聚合法，即动力学溶胀法。 这种方法不需要加入溶胀剂，而是直接用单体和引发剂对种子一步溶胀即可完成， 可显著提高效率。其操作方法是，先用分散聚合法制备出单分散种子分散体系，再 向该分散体系中加入单体、引发剂、稳定剂及某种溶剂，然后慢慢加入水，使单体 在介质中的溶解度降低，以改变单体在颗粒和介质间的分配系数，使更多的单体进 入聚合物颗粒，溶胀成约4倍直径的单分散颗粒，进行聚合，最后可以得到约3倍直 径的单分散、大粒径聚合物微球。 1.1.2 荧光的基本知识介绍 1.1.2 荧光的基本知识介绍 stocks 1902年发现有些物质在短光波的照射下，物质本身能放射出一种比激发 光较长的光波，他把这种光称为荧光。某些物质在光的照射下吸收光能进入激发态， 从激发态回到原来的基态时，以电磁辐射的形式放射出所吸收的光能.这种现象叫 “光致发光”。在光致发光现象中，如果用一定波长的光(如紫外光)照射某种物质 时，这种物质在极短的时间内，能发射出波长较照射光的波长长的光(如可见光)， 这种光就称为“荧光”。停止供能时(即停止光照射)，荧光现象立即停止。如果停 止供能后，物质在较长时间内发出波长较荧光波长更长的光，即为“磷光”。引起 荧光的最有效的光波，是光谱上波长较短的区域、即紫外光或蓝紫光。显然，这部 分短波长的光，光能大。当荧光物质吸收这部分光能成为激发态，再重新回到它原 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 来的基态之前时，它的一部分能量作为热能被丢失，所以它释放出的光较激发光的 波长长(能量较低)，即释放出的光向光谱的红光端偏移。 1.1.3 常见的有机荧光染料 1.1.3 常见的有机荧光染料 有机荧光染料一般具有共轭双键体系，当收到紫外线激发时，激发态保持相对 稳定而发射荧光，一般地，荧光类物质都含有多个苯环或杂环的并带有共轭双键的 刚性平面的结构，以下列举了几类常见的有机荧光燃料。 （1）荧光素类染料 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 （3）二苯乙烯荧光染料 （4）萘酰胺类荧光染料 （2）罗丹明类荧光染料 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 另外还有以香豆素为母体的荧光染料也是生物技术常用的染料之一，藻红蛋白， 藻青蛋白也是常用的生物染料。 1.1.4 荧光微球的制备方法和研究进展 1.1.4 荧光微球的制备方法和研究进展 1.1.4.1 荧光微球的分类 根据载体及荧光物质的不同，荧光微球可分为两类:(1)无机/有机荧光微球;(2) 有机/有机荧光微球。 (1)无机/有机荧光微球 此类荧光微球可分为两种，一是以无机材料为载体，而荧光物质为有机化合物。 典型的无机载体为硅胶。如makarova 30等以中空的硅胶“纳米微泡”包覆荧光素异 硫氰酸酯(fitc)，获得了纳米荧光探针。trau与batersby 31则报道了以硅胶为载体的 荧光微球在药物及基因的高通量筛选中的应用。二是以有机高分子为载体，荧光物 质为无机物。barbera-guillem 32将带有活性基团的聚合物微球与带有活性基团(如氨 基酸、羧酸等)的无机荧光纳米晶体(半导体微晶或金属氧化物掺杂微晶)结合，制备 了聚合物荧光微球，直径从零点几微米到几百微米不等，可用于多对象的混合检测。 (2)有机/有机荧光微球 此类荧光微球的载体是人工合成或天然高分子材料，其负载的荧光物质是有机 物。rembaum 33以带可自由基聚合官能团的荧光物质(结构为f-ab-o，其中f为发色 基，o为双键，a， b为可相互缩合的官能团)与带活性官能团(如一0h、-cooh、-nhz、 -cn)的丙烯酸类单体进行水相悬浮聚合，并用交联剂交联得到高光量子、高稳定性 且与生物相容的聚合物荧光微球，其平均直径为1.7微米。将其标记细胞膜，可探测 膜上受体的性质、数量及分布情况。haugland 35.35等在其专利中报道了一类有机/有 机荧光微球的制备及应用。此类荧光微球用未标记的大分子微球在荧光物质的有机 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 9 溶液中染色而得，而荧光物质是多种荧光染料的混合物，其发射峰和激发峰可依次 叠加，造成染料系列中的能量转移，从而增大整个荧光微球的stokes转移，使检测 更加准确灵敏。在所得到的荧光微球外部敷涂功能基，可与生物活性基团结合，从 而能与被检测物结合并对其进行检测。其优点是可对目标物进行多个或单个标记与 检测。 1.1.4.2荧光微球的制备方法和研究进展 (1)吸附法(染色法) 吸附法多用于有机/有机荧光微球的制备。有机荧光材料一般为非水溶性的物 质，将其溶解在丙酮、酒精等水溶性的有机溶剂中，再与载体的水分散体系混合， 荧光材料即会析出并被吸附到载体上（如图fig1.3所示）。许多文献 34-37，50报道了 用此种方法制备荧光微球的详细过程。此方法实验操作简单，但是吸附的荧光物质 容易流失，毒性大。 fig1.3 用吸附法制备荧光微球的过程示意图 (2)包覆法 包覆法可以制备无机/有机荧光微球及有机/有机荧光微球。其基本原理是将荧 光材料均匀分散在介质中，利用各种聚合反应，制备出的荧光微球几乎都具有明显 的核/壳结构。包覆法有两种形式（如图 fig1.4 所示）。 +fluo polymerspherefluorescent microsphere 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 fig1.4 用包覆法制备荧光微球的过程示意图 86年c.k.ober等人将预先制得的苯乙烯微球在溶有荧光物质的有机溶剂中溶 胀，使荧光物质扩散到微球内部从而获得荧光微球。kumacheval 38，39 等用多步种子 乳液聚合合成了核/壳型荧光微球，其核层为含有荧光物质的丙烯酸酷聚合物，壳层 为丙烯酸酯聚合物连续相，cheung 40先制备出带羧基、羟乙基、甲氧基粒径在 200-400nm的丙烯酸乳胶粒，然后透析除去乳化剂及游离离子，接着与荧光胺及二胺 反应，制备出粒径为300nm的荧光微球，经过测试与计算，每平方微米上有5000000 分子的荧光物质，其数量大大超过荧光显微测试所需最低限度的1000分子，也远远 超过以前所制备的荧光微球。可以通过在微球表面接上抗体或抗生素，对细胞表面 抗原及dna序列进行测定。实验证明，他们所制备的生物荧光微球具有很高的稳定性 及检测灵敏度。schwartz 41等利用带功能基的可聚合单体，对体积小于细胞的单分散 聚合物微球进行溶胀聚合，得到细胞大小的单分散球体，然后用带功能基的扩链剂 与其反应，再将产物与荧光物质反应得到荧光微球。所得微球被用做流式细胞检测 的标样。另外，利用分子自组装技术，yang 42 等制备了以高聚物为核，荧光薄膜为 中间层，免疫球蛋白为外壳的荧光微球。 这种方法制备的荧光微球单分散性好，但是荧光物质的用量对成球的影响很 大，有时使球变形，甚至不能成球。因此使用这种方法，荧光物质的用量要控制恰 当。 +monomer fluorescent microsphere + fluo polymersphere 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 11 （3)球外悬挂法 45.50 将带有活性基团的荧光材料颗粒与表面带有功能基团的聚合物微球结合，可以 获得在聚合物微球表面悬挂有荧光小球的“大”荧光微球。此法所制备的荧光微球， 其发光物质是以“点”状态结合在聚合物微球上的（如图fig1.5所示）。chandler 43. 等在一个微米级的聚合物大球上结合2-3个纳米级的荧光小球(用染色法获得，并外 带功能基)制备了球外悬挂型的荧光微球，可用来对核酸及酶进行检测。 fig1.5 用球外悬挂法制备荧光微球的过程示意图 (4)共聚法 共聚法是特指带有可聚合官能团的荧光物质与可聚合官能团的有机单体进行聚 合制备均一结构的荧光微球， 荧光物质在微球中的分布基本上是均匀的 （如图fig1.6 所示）。此方法多用于有机荧光微球的制备，这是目前关于荧光微球制备方法研究 比较多的技术。87年f.m.winnik 48等人在蒽醌类荧光物质上引入双键（甲基丙烯酰 氯）制得荧光单体，和其他乙烯类单体共聚制备荧光微球，由于采取分散聚合的方 法，要求所有单体反应前都溶于反应介质，前述rembaum 33所制备荧光微球的方法 即为共聚法的典型例子。 fig1.6 用共聚法制备荧光微球的过程示意图 + fluo polymersphere monomer + fluo fluorescent microsphere 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 12 （5）微球表面聚电解质自组装 香港科技大学的 wenjun yang 49等人把九十年代初 decher 提出的聚电解质多层 自组装方法引入到荧光微球的制备领域，将 fitc 和免疫蛋白组装到微球表面，成 功制得可用于免疫检测的荧光微球。这种方法以纳米微球为模板，带有相反电荷的 聚电解质连续沉淀到微球表面带电层上，自组装成功能微球，我们可以先将各种功 能集团或荧光物质制成聚电解质组装试剂，然后在微球上自组装沉淀制的各种功能 复合结构的微球。这种方法的最大优点是可以把各种不同功能的大分子结合到组装 层，制得的微球应用广泛，在生物传感器，分离载体，光学传感器，免疫测试等方 面都有很好的应用前景。 fig1.7 分子自组装示意图 上述几种方法皆为单一性制备方法，实际上，很多情况下可将上述诸方法结合 用以制备荧光微球。zhan 44等将染色法和共聚法共用制备一类颇具特色的荧光微 球。其中至少含有一个球形(球壳形)荧光物质区域，其截面表现为与球同心的环形 或圆盘，如果含有两种以上的荧光物质，两光环边界不产生弥散，通过光谱特征或 光强很容易进行甄别与测定。其方法是先用染色法获得核层浅层染色的微球，然后 利用种子聚合法与可聚合荧光单体或非荧光单体共聚获得多层荧光微球，最后将微 球进行浅表染色获得多荧光区域的荧光微球。 1.2 荧光微球的应用 1.2 荧光微球的应用 随着对功能高分子研究的深入,荧光微球(fluorescent microspheres)以其稳 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 13 定的形态结构及稳定而高效的发光效率, 在许多领域有很重要的应用，尤其在生物 免疫检测上着很广泛的应用，在这部分我们介绍了早期的经典乳液凝集定性测试到 最新的流式荧光免疫微球分析技术，并对各自的测试原理做简要的介绍，将流式荧 光免疫微球分析技术和传统的免疫检测技术的优缺点做一个简单的对比并对将来 可能出现的新技术进行展望。 1.2.1 微球的免疫检测技术的基本原理 1.2.1 微球的免疫检测技术的基本原理 微球免疫检测技术最早可以追溯到 1956 年 singer 和 plotz 发明的乳液凝集测 试（latex agglutination tests，lat） 51用于类风湿因子的检测，从此之后，lat 应用 于超过 100 种传染病毒的检测，出现了一系列从简单到比较复杂的测试方法。 微球的定量或定性检测一般都是建立在抗原（ag）和抗体（ab）的特异性反 应的基础上的，抗原或抗体被吸附到微球载体上，然后把它与含有对应反应物的样 （血清，尿样等）混合，这些“敏感”的微球就起着放大抗原抗体之间特异性反应 的作用。下面（fig.1.8）是一个简单的乳液凝集免疫检测模型，用抗体标记过的 微球和含有带检测抗原的样品（如血清，尿样等）混合后，抗原抗体之间将发生 fig1.8 乳液凝集检测原理 特异性反应从而发生凝集，然后通过一系列特别的方法检测微球凝集的发生，从而 确定抗原的存在。 1.2.2 微球免疫检测发展情况 1.2.2 微球免疫检测发展情况 1.2.2.1 乳液凝集检测（latex agglutination tests，lat） 顾名思义，乳液凝集检测就是通过检测微球的凝结情况来检测抗原或抗体，基 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14 本原理里面有介绍，根据检测粒子凝集的方法可以将凝集检测分为好几类。 （1）普通染色 (2) 光散射 （3）粒子计数 （4）过滤凝集 (5)荧光凝集猝灭 1.2.2.2 粒子捕获酶联免疫检测 这种方法主要利用了酶的显色反应，应用很广泛。一个典型的粒子捕获酶联免 疫测试的例子描述如下： fig1.9 粒子捕获酶连免疫检测原理 开始粒子俘获测试之前，一个抗体（ab1）键联在微球上，微球置于一过滤器 内。测试时先让样品流经过滤器，如果有抗原存在的话 ag 就会被捕获到微球上， 将连接有抗体（ab1）的酶流经过滤器， （ab2 一酶）就会特异地被（微球-ab1-ag） 捕获形成（酶-ab2- ag -ab1-微球）的夹心结构，通过酶显色反应在过滤器表面上 形成不溶的带颜色的产物。 很显然，这种测试方法利用了酶的显色反应，酶的不稳定性及对处理过程要求 的苛刻限制了它的应用。 1.2.2.3 超顺磁性微球测试 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15 磁性微球可以快速而轻易地从固液两相分离，实际上磁性微球并不是指微球本 身具有磁性，而是指它们和磁场有相互作用，去掉磁场后微球没有残留的磁性。 磁性微球已被广泛用于商业的固相放射性免疫测定和酶联免疫测定，最近 amersham，chrion，merck/biotrol 和 beckman 等人将其应用于化学发光测定。也 可以用磁性微球做空间解析荧光免疫测定（space-resolved fias）和免疫辐射测定 （immunoradiometric assays） 54。动植物的细胞也有用磁性微球来分离的。 1.2.2.4 微球用作标记物和染色剂 ciguatera，一种小鱼食用热带盐水藻类，含有一种对人类有效的神经毒素，可 能会通过食物链传到大鱼，再传到人群。用染色粒子作为标记物测试鱼类是否被 ciguatera 污染的新方法出现了，将一根桨从鱼身上的切口插到鱼里，然后拿出来， 桨上将粘付着鱼的肉，然后再将桨浸入连有抗体的染色微球乳液中，如果桨上显现 颜色表示 ciguatera 污染的阳性结果 55。 1.2.2.5 流式荧光免疫微球分析技术（flow fluorenscence lmmunmicrobeads assays ，ffia） 流式细胞计数应用于血液和免疫细胞的多参数分析已经 20 年了，尽管它的应 用都是以细胞为基础的，但是一些微粒比如说高分子微球也能被激光散射探测。用 流式细胞计数技术分析以高分子微球为固相载体的各种分子反应也有一段历史了， 早在 1977 年，流式细胞计数就被应用于探测微球表面键联的抗体捕捉的抗原 6。另 外 pcr（聚合酶链反应）产物已经可以通过低聚核苷酸探针（hybridization）被探 测，酶反应的产物被微球捕捉 57，58。这些基础的分子应用已经扩散到同一样品容器 里同时多重测试，利用光谱区分的多批次微球对应的单一结合反应。 多元免疫测试可以在一系列微球基础上同时实现，在定量夹心免疫测试中，捕 获抗体连接在微球上，探测抗体键联在指示剂上。以微球为基础的免疫测试可以在 不需要洗涤的步骤下进行，如果背景和样品中潜在的妨碍物相对很小，也可以一步 完成 59，60。因为每个微球总体是以尺寸和光谱来区分的，指示剂的密度与捕获的分 析物的量相关，于是可以确定分析物的相对浓度。 研究者们预测将有越来越多的免疫测试在单个细胞或微球的仪器上进行，目 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16 前， 至少有三个公司提供这方面测试仪器， 他们是 luminex()， becton-dickinson()和 diasorin（） 。 这种技术的基本原理是连有抗体的荧光微球与待测样品混合后，如果有待测抗 原存在的话，微球散射的激光（或者是荧光）将会不同，抗原存在与否所影响的光 散射的不同可以测定抗原。 luminex 公司的最新的 flowmetrix 系统现在可以做到同 一试管中进行 100 个测定， 利用 100 种不同荧光微球负载测试试剂。 下面 （fig.1.10） 是 luminex labmap 系统及组件。flowmetrix 系统和其他免疫测试方法相比最突 出的优势就是多参数同步分析能力，可以同时进行各种抗原测试，而且测试灵敏性 高，操作步骤简单，省时及测试成本较低，因此有着极广阔的应用前景。 fig1.10 luminex labmap 系统和组件，组件：生物分子反应器，微球，流动分析仪和信号处 理器。 和上面的其它免疫测试方法比较，流式计数荧光免疫微球分析计数有自己独特 的计数特点，体现了更多的优势。 （1）以单个微球作为独立分析单位 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 17 用于同一目的的微球其大小相同，包被了大致相等的免疫反应物质，能在实验 体系中发生同等的免疫反应，这些特征为单个微球作为独立的定量检测单位提供了 物质基础。因为能以单个微球作为独立的分析单位，所以测试灵敏度很高，可以用 于微球免疫检测。 （2）多拷贝重复测定 同一检测目的所用微球之间的一致性相同，但它们之间的大小，表面结构，包 被物质数量与质量，以及信号显示上仍可存在微小的差别，借助 fcm 敏感接受与快 速处理显示成百上千信号的强大功能，可在极短的时间内处理并形象地显示成百成 千个微球的测试信号及总体均值，这样大样本的重复抽样，可以十分有效的减小测 试过程中的实验误差。 （3）高效率在机选择表面散射参数能够评价测试颗粒的大小，是 fcm 分类不同生 物颗粒的重要指标，用于 ffia 的检测时可将其与 fcm 的在机选择功能相结合，通 过在激光散射点阵图中设立测试窗，选择其光散射信号更为均一的颗粒用于荧光分 析。这种选择功能用于二维荧光点图界面做荧光的定量分析，能排除非反应颗粒对 结果的干扰，而且提供同一试管中检测多种靶物质的可能性。 （4）多参数同步分析 fcm 的信号处理系统通常有两个或者两个以上的信号探测器， 在一系列的光学 选择与滤过元件的支持下，每一个探测器可对几种不同波长的单色光做同步检测。 所检测的信号在电脑的支持下被立即处理，记录下来，并加以显示。即使使用较为 普通的流式细胞仪，也能在同一个（或同一组）免疫微球上同步测定多种信号。采 用更为新型的 fcm(如 bd 公司 vantage fcm)，因双激光的应用还可使探测信号成 倍增加，为在同一测试试管中探测更多的信号提供了广阔的空间，这是开发 ffia 潜在使用价值的重要源泉。 1.3 本文的主要工作 1.3 本文的主要工作 流式荧光免疫微球分析技术是最近发展的新技术，其在免疫检测方面的潜力 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 18 和优势巨大，目前我国已经开始引入该设备，但该技术的载体-荧光功能微球的制 备，国内这方面的研究相对甚少。有关荧光微球的报道仅见于有限的专利和文献综 述。使用时需向国外购买，价格昂贵。本课题组从事微球的制备研究多年，已经成 功制备出磁响应性好， 表面含有功能基团的磁性高分子微球， 在以前工作的基础上， 本课题组开始荧光功能微球的制备研究，根据该技术的原理，对载体微球提出如下 要求： （1）微球上固载有荧光，且荧光稳定，对免疫反应不产生毒性； （2）微球表面共聚有羧基功能团，以作为和免疫生物物质反应的位点； （3）微球的粒径是单分散的； （4）微球的大小是微米级的； 根据文献的阅读，实验室已有的技术和条件，对于荧光微球的制备，我认为应 该根据荧光物质的不同性质，选择不同的制备方法，或者几种方法的结合。通过对 种子聚合和分散聚合在实验工艺，微球形貌和后期处理方面进行对比，我们采用分 散聚合法一步制得荧光微球，操作简单、省时、制备的微球粒径均匀，大小符合我 们的要求。我们采用分散聚合的方法制备荧光微球，通过聚合包覆把荧光染料包在 微球内部，解决了直接用吸附法容易使荧光染料流失的缺点，另外对荧光染料本身 要求不高，避免了所用的荧光染料价格过高；通过直接包覆法，不改变荧光分子本 身的结构，从而避免荧光性质改变；采用两种荧光染料，通过改变两种染料的比例 来制备多种双荧光峰微球；在反应 8 个小时后，向反应体系中加入功能单体，在微 球表面引进官能团，避免了官能团聚合在微球内部的缺点。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 19 2 荧光微球的制备荧光微球的制备 根据流式荧光免疫微球分析技术对微球大小和单分散性提出的要求，对比悬 浮，乳液，分散，种子聚合等几种制备微球的方法，可以看出种子聚合和分散聚合 有可能制备出符合要求的微球，我们尝试用这两种方法制备需要的荧光微球。利用 这两种方法制备荧光微球和以前最大的不同在于，我们在体系中加入了两种荧光染 料，调节不同的比例，吸附共聚到微球上，并且在微球表面连接羧基官能团，这也 是我们实验关键的地方。首先我们尝试用种子聚合方法制备联有官能团的不同荧光 强度的微球。 2.1 种子聚合法制备荧光微球的实验试剂及实验仪器 2.1.1 实验试剂 2.1 种子聚合法制备荧光微球的实验试剂及实验仪器 2.1.1 实验试剂 试剂名 生产单位 规格 无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司 分析纯ar 苯乙烯 国药集团化学试剂有限公司 化学纯cp 聚乙烯吡咯烷酮 天津市远航化学药品有限公司 化学纯cp 偶氮二异丁氰 上海试剂四赫維化工有限公司 化学纯cp a-甲基丙烯酸 天津基准化学试剂有限公司 分析纯ar 罗丹明6g (rhodamine6g) 国外进口 纯度99% 香豆素6(coumarin6) 国外进口 纯度98% 十六烷基苯磺酸钠 湘中地质实验所 分析纯ar 过氧化苯甲酰 湘中精细化学厂 分析纯ar 邻苯二甲酸二丁酯 国药集团化学试剂有限公司 化学纯cp 2.1.2 实验仪器 2.1.2 实验仪器 磁力搅拌器，机械搅拌器，数字天平，超速离心机，超声波清洗器，真空干燥 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 20 箱，uv-2550 型紫外可见分光计，sirion-200 场发射扫描电子显微镜，傅里叶红外 光谱仪，rf-5301 型荧光分光计，电导滴定仪。 2.2 种子聚合法制备荧光微球 2.2.1 种子聚合法简介 2.2 种子聚合法制备荧光微球 2.2.1 种子聚合法简介 种子溶胀法是先用乳液聚合或者是分散聚合等方法制成小粒径的单分散聚合 物颗粒，然后以此为种子用单体进行溶胀，使颗粒长大，再引发聚合，制得颗粒较 大的微球。根据合成工艺可将种子溶胀法分为常规溶胀法、步溶胀法、两步种子溶 胀法和动力学溶胀法四种。 （1）常规溶胀法：okubo 等人 67.68用常规种子溶胀法制 备出大粒径单分散微球。 他们首先通过分散聚合制成直径约 2m 的单分散聚苯乙烯 颗粒，然后在 0 0c 下用苯乙