（环境科学专业论文）光合细菌降解废水中二氯苯酚和三氯酚的研究.pdf

k i n = 3 8 3 3 3m g l ，k i = 2 6 0 8 7m g l 。 关键词：光合细菌；二氯苯酚；三氯苯酚；生物降解；静息细胞 s t u d yo nb i o d e g r a d a t i o no f d i c h l o r o p h e n o la n dt r i c h l o r o p h e n o l b yp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a a b s t r a c t i nt h i s p a p e r , t h em u l t i p l i c a t i o no fm i x e d c u l t u r e sp h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i ap s b d ra n dt h ed e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so f2 ，6 一d i c h l o r o p h e n o l ( 2 , 6 d c p ) a n d2 , 4 ，6 - t r i c h l o r o p h e n o l ( 2 ，4 ，6 一t c p ) b y p s b d rw e r e i n v e s t i g a t e d i tc o n s i s t so f t h ef o l l o w i n gt h r e ea s p e c t s ： i nt h ef i r s tp l a c e ，t h ed o m i n a n tb a c t e r i ao fp s b d ra rei d e n t i f i e d a c c o r d i n g t ot h e i r c e l l s m o r p h o l o g i c a lp r o p e r t i e s a n dp h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s t h e nt h ec u l t u r em e d i u mf o rp s b - d rw e r e o p t i m i z e dt ob ei n c u b a t i o nw i t h2 4 3 2g l s o d i u ma c e t a t ea sc a r b o n s o u r c e ，1 2g la m m o n i u mc h l o r i d ea sn i t r o g e ns o u r c ea n d2r n l lg r o w t h f a c t o rs o l u t i o nu n d e rl i g h t ( 3 0 c ，4 8 0 0l x ) i nt h en e x tp l a c e ，t h ed e g r a d a t i o no f2 , 6 一d c pb yp s b d ra td i f f e r e n t c a r b o ns o u r c ec o n c e n t r a t i o n s ，i l l u m i n a t i o n , o x y g e ns u p p l yc o n d i t i o n s ， i n i t i a l p h ,i n o c u l u md e n s i t ya n dn i t r o g e ns o u r c e c o n c e n t r a t i o n sw e r e i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ed e g r a d a t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d t ob ei n c u b a t i o nw i t ha ni n i t i a lp h6 0 ，i n o c u l u md e n s i t yo f3 0 ， s o d i u ma c e t a t ea n da m m o n i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o n so f0g lu n d e rl i g h t i nu n s e a l e df l a s k s u n d e rs u c ho p t i m u mc o n d i t i o n s ，a b o u tm o r et h a n8 0 o f2 ，6 d c pw i t hi n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f5 0m g lw a sr e m o v e da f t e r7d i n c u b a t i o n m o r e o v e r , t h ed e g r a d a t i o np a t h w a y o f2 , 6 - d c pw a s p r e l i m i n a r i l ys t u d e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ed e g r a d a t i o no f2 , 6 - d c p m i g h tp r o c e e d v i at h eh y d r o q u i n o n ep a t h w a y 。： i nt h ee n d , t h ed e g r a d a t i o no f2 , 4 ，6 一t c pb yp s b - d ra td i f f e r e n t c a r b o ns o u r c ec o n c e n t r a t i o n s ，i l l u m i n a t i o n , i n o c u l u md e n s i t y , i n i t i a lp h , n i t r o g e ns o u r c ec o n c e n t r a t i o n sa n dr e a c t i o nt i m e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t ob e i n c u b a t i o nw i t ha n i n o c u l u md e n s i t yo f3 0 ，i n i t i a lp h7 0 ，s o d i u ma c e t a t e a n da m m o n i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o n so f0g lu n d e rl i g h t u n d e rs u c h o p t i m u mc o n d i t i o n s ，a b o u t8 2 3 o f2 ，4 ，6 - t c pw i t hi n i t i a lc o n c e n t r a t i o n o f 5 0 m g lw a sr e m o v e da f t e r5di n c u b a t i o n i na d d i t i o n , t h e b i o d e g r a d a t i o no f2 ，4 ，6 一t c p c a nb ew e l ld e s c r i b e d b yt h ee n z y m a t i c r e a c t i o no fh i g hc o n c e n t r a t i o n i n h i b i t i o n ，w i t ht h em a x i m u ms u b s t r a t e u t i l i z a t i o nr a t e1 7 4 6h ，m i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t3 8 3 3 3m g la n d i n h i b i t o r yc o n s t a n t2 6 0 8 7m g l ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ；d i c h l o r o p h e n o l ；l r i c h l o r o p h e n o l ； b i o d e g r a d a t i o n ；r e s t i n gc e l l s 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 符号说明 p s 卜光合细菌； d c 卜二氯苯酚； t c p l 一三氯苯酚； p c 卜五氯苯酚； h p l c 一高效液相色谱仪： o d 5 l r 51 0 眦处光密度值； l x - 勒克斯，光照强度的单位； 瓦米氏常数； k 抑制常数； k 不存在抑制剂时的最大酶促反应速率常数。 浙江工业大学硕士学位论文 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 第一章绪论 1 1 引言 近几十年，随着人们生活水平的快速提高和工业生产的飞速发展，大量的城 市生活污水以及各种生产废水未经处理直接排入水体，造成了湖泊、河流等水体 ：的严重污染，水质急剧下降，严重地威胁着生态环境与人类健康。含酚废水是这 t 其中常见且数量众多的废水之一，而酚类物质中的氯酚属于生物难降解有机污染 物，具有很高的毒性并容易在生物体内积累，同时能够在环境介质中长期稳定存 在。因此，如何处理这些物质，减少其对环境的污染，已引起了环境工作者的广 泛关注。 1 2 氯酚类有机物的来源及污染现状 氯酚类化合物( c h l o r o p h e n o l s ，c p s ) 是芳香族化合物中用途广、毒性大、污染 较为严重的一类化合物。目前，世界上将近有1 5 0 0 0 种c p s 被用作药物、杀虫剂和有 机溶剂，并普遍存在于炼焦、炼油、石化、塑料、煤气和纸浆等工业废水和生活污水 中【。另外，在某些有机物存在时，传统的饮用水加氯处理可产生氯酚及其衍生物【2 1 。 目前，氯酚类化合物对环境的污染主要来源于工业废水、有机物的燃烧释放物及事故 性泄漏等【3 1 。 氯酚进入环境后，因其水溶性在芳香类化合物中相对较大，在2 0 下，2 4 - 二氯 酚的溶解度为4 5 x 1 0 3 删扎，2 , 4 。6 - - - 氯酚的溶解度也达到约8 0 0m g l 4 。同时由于土 壤等固体物质对它的吸附和固定作用较弱【5 ，6 1 ，故能够以水为载体广泛地扩散。表1 1 列出了国内外部分区域受氯酚类有机物污染的现状。由于氯酚具有较高的毒性和较强 的“致癌、致畸、致突变 作用，并具有良好的化学稳定性和热稳定性，不易被分解 或生物降解，且容易通过食物链在生物体内富集等特点，严重地威胁着全人类的生命 健康【7 1 。基于上述原因，国内外均严格控制该类物质的生产和使用，比如美国环保局 将2 , 4 二氯苯酚和2 。4 ，6 - - - - 氯苯酚列入了6 5 类1 2 9 种优先控制污染物( p r i o r i t y p o f l u t a n t ) 中【8 】；我国也将2 ，4 二氯苯酚和2 , 4 ，6 三氯苯酚列入了6 8 种优先污染物的 “黑名单”【9 1 。此外，我国的污水综合排放标准( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) 中对氯酚的排放 作了相应的规定，要求1 9 9 8 年1 月1 日后建设的一切排污单位，氯酚的排放必须遵 浙江工业大学硕士学位论文1 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 循相关标准( 表1 2 ) 。 表卜i 全球部分区域受氯酚类有机物污染现状1 1 0 l t a b l e 1 - 1 c h l o r o p h e n o l sc o n t a m i n a t e da r e a sa r o u n dt h ew o r l d 表1 - 2 2 ，4 d c p 、2 ，4 ，6 t c p 和p c p 污水排放标准【1 1 】 t a b l e 1 - 2t h ed i s c h a r g es t a n d a r do f 2 ，4 - d c p ，2 , 4 ，6 一t c pa n dp c p 1 3 氯酚类有机物的危害 由于农药使用，污水排放，泄漏事故等种种原因进入环境中的氯酚会对各种生物 产生毒害作用【1 2 】。一般认为几乎所有的氯酚对生物体都具有一定的毒性，其中很多氯 酚被认为具有较强的“三致效应”。并且研究表明，许多氯酚是内分泌干扰物或是潜 在的内分泌干扰物，当人与动物与其长期低剂量接触时，容易使生物体的内分泌系统 发生紊乱【1 3 1 。 由于氯酚类化合物能够改变细胞蛋白质的结构使其发生变性和沉淀，因此对生物 体的各种细胞都有一定的损伤作用，在水体中若c p s 的浓度达到1 1 0u g l ，便有可 浙江工业大学硕士学位论文2 糊 蝴一珊：一唧 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 能对水生生物造成毒害【1 4 】。陆光华等研究了氯酚对绿藻的4 8h 急性毒性，结果表 明，氯酚对绿藻的生长有抑制作用，2 ，4 ，6 - - - 氯苯酚对绿藻的半数有效浓度值大约为 3 0n a g l ，五氯酚对其的半数有效浓度值仅为3 8m g l 。 有机物的氯化以及饮用水的加氯消毒均能产生氯代酚，人们长期饮用被氯酚污染 的水，可引起头昏、贫血及各种神经系统症状。许多氯酚类化合物降解过程的中间产 物例如氯代邻苯二酚或者是氯代开环产物也具有毒性，会对生物体的生长产生一定的 抑制作用。 1 4 氯酚类有机物的降解方法 1 4 1 二氯苯酚和三氯苯酚的非生物降解 按照处理原理来分，氯酚的非生物降解大致可以概括为物理法和化学法。常见的 物理去除法主要为吸附法、萃取法和蒸馏法等；化学去除法则包括光化学降解法、超 临界水氧化法、声化学氧化法、电f e n t o n 法以及丫射线辐照技术等。但是物理和化 学处理法往往存在降解不彻底，容易引起二次污染等问题，而生物处理法具有相对经 济、基本没有二次污染等特点，正越来越引起重视，并已逐渐成为一种被人们普遍接 受和认可的环境治理技术之一。 1 4 2 二氯苯酚和三氯苯酚的微生物降解 氯酚类化合物的微生物降解一直是国内外研究的一个重要课题，氯酚类化合物通 常被认为是环境外来化合物，环境微生物由于缺乏与之降解相适应的酶系统，因此表 现出难以生物降解，但是经过长期的驯化培养，由于微生物所具有的遗传变异和质粒 传递特性，使很多原本不具备氯酚降解能力的微生物具有了降解氯酚的能力。氯酚类 化合物的生物降解典型微生物如表1 3 所示。其中细菌种类有节杆菌属 ( a r t h r o b a c t e r ) 、脱亚硫酸菌属( d e s u l f i t o b a c t e r i u m ) 、分枝杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 、 假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、红球菌属( r h o d o c o c c u s ) 、沙雷式菌属( s e r r a t i a ) 和氯 酚鞘氨醇单胞菌属( s p h i n g o m o n a sc h l o r o p h e n o l i c a f o r m e r l yf l a v o b a c t e r i u m ) 等；真菌 有齿毛菌属( c e r r e n a ) 、白腐菌( w m t er o t f u n g u s ) 、原毛平革菌属( p h a n e r o c h a e t e ) 、 丝核菌属( r h i z o c t o n i a ) 和根霉属( r h i z o p u s ) 等。 浙江工业大学硕士学位论文3 光合细菌降解废水e p - 氯苯酚和二氯苯酚的研究 表1 3 降解氯酚类化合物微生物的种类f 1 6 】 t a b l e 1 - 3 c h l o r o p h e n o l sd e g r a d a t i o nb yd i f f e r e n tk i n d so fm i c r o o r g a n i s m s 氯酚微生物 2 氯酚 3 氯酚 4 氯酚 5 氯酚 2 ，3 二氯酚 2 ，4 二氯酚 2 ，5 二氯酚 2 , 6 二氯酚 3 4 二氯酚 3 5 二氯酚 2 ，4 ，6 三氯酚 2 ，4 ，5 三氯酚 2 ，3 ，4 三氯酚 c l o s t r i d i u ms p 嗜热梭菌；r a l s t o n i as p 罗尔斯通氏菌；a z o t o b a c t e rs p 固氮 菌；p s e u d o m o n a sp 锄豳bc y s t o b a c t e r is p 恶臭假单胞菌 d e s u l f o m o n i l et i e d j e i 蒂氏脱硫念珠菌 p s e u d o m o n a sp u t i d a 假单胞菌；r u l s t o n i ee u t r o p h a a l c a l i g e n e ss p 罗尔斯通 氏菌；a z o t o b a c t e rs p 固氮菌；r a l s t o n i as p 罗尔斯顿氏菌 r h o d o c o c u u sc h l o r o p h e n l i c 氯酚红球菌；砌妇r o t f u n g u s 白腐菌 d e s u l f o m o n i l ea e d j e i 蒂氏脱硫念珠菌 b u r k h o l d e r i ac e p a c i a 洋葱伯克雷尔德氏菌；p s e u d o m o n a sp i c k e t t i i i 皮氏假 单胞菌；c l o s t r i d i u ms p 嗜热梭菌；p s e u d o m o n a ss p 假单胞菌； s t e n o t r o p h o m o n a ss p 寡养单胞菌 d e s u l f o m o n i l et 抬a j e i 蒂氏脱硫念珠菌 a z o t o b a c t e rs p 固氮菌：p s e u d o m o n a sp i c k e t t i i i 皮氏假单胞菌 p s e u d o m o n a sp i c k e t t i i i 皮氏假单胞菌 d e s u l f o m o n i l e 庇咖f 蒂氏脱硫念珠菌：c l o t r i d i u ms p 梭状芽孢杆菌 c l o t r i d i u ms p 梭状芽孢杆菌；p s e u d o m o n a sp i c k e m i i 皮氏假单胞菌； a z o t o b a c t e rs p 固氮菌；p h a n e r o c h a t ec h r y s o s p o r i u m 嗜碱细菌 c l o t r i d i u ms p 梭状芽孢杆菌；p s e u d o m o n a s p i c k e t t i i i 皮氏假单胞菌 c l o t r i d i u ms p 梭状芽孢杆菌；p s e u d o m o n a s p i c k e t t i i i 皮氏假单胞菌 d e s u l f o m o n i l et i e d j e i 蒂氏脱硫念珠菌；c l o t r i d i u ms p 梭状芽孢杆菌： 五氯酚r h o d o c o c c u sc h l o r o p h e n o l i c u sd e s u l f i t o b a c t e r i u mf r a p p i e r 多食鞘胺醇杆 菌：f l a v o b a c t e r i u ms p 黄杆菌 2 , 6 - - - 氯苯酚( 2 ，6 d c p ) 为2 ，4 二氯苯酚( 2 ，4 d c p ) 的同分异构体，无色针状 结晶，有刺激性苯酚气味，分子量为1 6 3 ，分子式c 6 h 4 c 1 2 0 ，化学结构式见( f 谵1 1 ) 。 熔点6 8 - 6 9 。c ( 9 8 7k p a ) ，沸点2 1 9 - 2 2 0 。c ( 9 8 7k p a ) ，易溶于乙醇和乙醚，溶于苯 和石油醚，水溶性 暑 、一 追 譬 含 量 g 娶 暄 驾 o2 04 06 0 8 01 0 0 2 , 4 , 6 - - - 氯酚标准溶液浓度( n 玛l ) 图4 1 2 , 4 ，6 t c p 标准曲线 f i g 4 - 1 s t a n d a r dc u r v eo f 2 ，4 ，6 - t c p 时间( r a i n ) 图4 22 4 6 t c p 标准物质的液相色谱图 f i g 4 - 2 h p l cc h r o m a t o g r a mo fs t a n d a r d2 ，4 ，6 - t c p 4 3 2p s b d r 静息细胞对2 , 4 6 t c p 的降解 取6 0m l 培养至稳定期的原菌液接种至装有1 4 0m l 降解培养基的锥形烧瓶 中，培养液中2 4 。6 t c p 的浓度为5 0m g l ，在光照培养箱中( 光照度4 8 0 0l x 、 温度为3 0 ) 培养7d ，每隔1d 取样测定溶液中2 4 6 t c p 的残余量并测定菌悬 液浓度，并设置不加细菌的空白对照和灭活细胞的空白对照。 浙江工业大学硕士学位论文4 9 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 ，、 患 邑 型 蠖 8 咛 吾 时l 司( 1 1 ) 一三氯苯酚残留浓度一空白残留浓度一灭活细胞一o d m 图4 3p s b d r 生长曲线和2 ，4 ，6 t c p 降解曲线 f i g 4 - 3 g r o w t hc u r v eo f p s b d ra n db i o d e g r a d a t i o nc u r v eo f 2 ，4 ，6 一t c p p s b d r 静息细胞对2 , 4 6 t c p 的降解结果如图4 3 所示。由图可知，实验过 程中o d 5 1 0 基本无明显变化，表明在整个降解过程中，细胞浓度没有增加，也说明 本实验选择的2 ，4 ，6 t c p 降解培养基体系不适于细胞大量增殖，细胞基本处于静息 状态，但7d 后p s b d r 对2 ，4 6 t c p 的降解率达到8 5 以上，同时，灭活细胞实 验中2 ，4 。6 t c p 浓度变化不大，说明实验中2 ，4 ，6 t c p 的减少并不是由细胞的吸附 作用引起的，这表明p s b d r 降解2 4 6 t c p 是通过现有细胞里的酶起作用。此外， 从图4 3 中还可知，未接种的空白组2 , 4 6 t c p 损耗仅为9 ，对分析2 , 4 6 t c p 降 解效果的干扰并不大，故在后续实验中忽略其损耗，这也说明了2 ，4 ，6 t c p 浓度的 降低是由微生物的降解作用引起的。 4 3 3 醋酸钠的影响 取6 0m l 原菌液分别接种于含2 ，4 ，6 t c p 的基础培养基中，2 。4 ，6 t c p 的浓度 为5 01 1 1 j g l ( 基础培养基中醋酸钠浓度分别设置为o 4g l 、0 8g l 、1 2g l 、1 6g l ) ， 而在降解培养基中不添加醋酸钠作为对照实验，光照培养7d 后( 光照度4 8 0 0l x 、 温度为3 0 ) 取样测定2 4 6 t c p 的浓度。 实验结果见图4 4 。结果显示，2 4 ，6 t c p 的降解率受培养基中醋酸钠浓度的 影响，在醋酸钠浓度为0g l 时，整个降解过程细胞浓度基本维持不变，细胞处于 静息状态，但对2 4 6 t c p 的降解率却最高( 8 6 8 ) ；在醋酸钠浓度为0 4 1 6g l 浙江工业大学硕士学位论文5 0 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 时，细胞处于生长状态( 菌悬液浓度o d s l 0 快速上升，数值未在图中列出) ，2 ，4 ，6 t c p 的降解率却随醋酸钠浓度的升高而降低且明显低于静息细胞的降解率。分析原因， 可能是醋酸钠的加入对底物的酶促反应产生了非竞争性抑制作用，降低了酶的活 性，导致降解率的下降。实验结果表明，对于p s b d r 采用静息细胞法降解 2 ，4 ，6 t c p 是较佳的选择。 摹 槲 琏 逝 凸一 2 寸 n 醋酸钠浓度t g a ) 图4 4 醋酸钠浓度对2 。4 6 - t c p 降解率的影响 f i g 4 - 4 e f f e c to f s o d i u ma c e t a t ec o n c e n t r a t i o no n2 ，4 ，6 t c pd e g r a d a t i o n 4 3 4 光照的影响 将6 0m l 原菌液接种至含2 ，4 ，6 t c p 的降解培养基中，2 ，4 ，6 t c p 最终浓度为 5 0m g l ，分别在黑暗、光照条件下培养7d 并取样测定2 。4 ，6 t c p 的浓度，实验结 果见图4 5 。 由图4 5 可知，p s b d r 在黑暗、光照条件下对2 4 6 t c p 的降解能力存在明 显差异，7d 后对2 ，4 ，6 t c p 的降解率分别为6 2 、8 8 4 ，即在黑暗条件下2 ，4 ，6 t c p 基本没有被降解，光照成为2 4 6 t c p 降解的关键限制因子，这与3 3 4 节中所得 的结论相一致。本实验中2 4 6 t c p 的降解需要在光照条件下进行，说明p s b d r 对2 4 6 t c p 的降解也是一种酶促反应机制，该催化反应的进行需要由光合作用产 生的n a d p h 参与。综上，后续实验均选择在光照条件下进行。 浙江工业大学硕士学位论文5 1 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 摹 瓣 琏 逝 山 譬 口 穹 n 图4 - 5 光照对2 ，4 ，6 t c p 降解率的影响 f i g 4 - 5 e f f e c to fi l l u m i n a t i o no i l2 , 4 ，6 t c pd e g r a d a t i o n 4 3 5 接种量的影响 将p s b d r 原菌液接种至含2 ，4 ，6 t c p 的降解培养基中，2 , 4 ，6 t c p 最终浓度 为5 0m g l ，接种量分别为1 0 、2 0 、3 0 、4 0 和5 0 ，光照培养7d 后取样 测定2 ，4 ，6 t c p 的降解率，实验结果见图4 - 6 。 1 02 03 04 05 0 接种量惭) 图4 - 6 接种量对2 ，4 ，6 t c p 降解率的影响 f i g , 4 - 6 e f f e c to fi n o c u l u md e n s i t yo n2 , 4 ，6 - t c pd e g r a d a t i o n 浙江工业大学硕士学位论文5 2 邑瓣琏篷厶2，9tn 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 结果表明，在相同的培养条件下，p s b d r 的接种量不同，2 ，4 。6 t c p 的降解 也呈现出不同的结果。接种量为1 0 时，由于菌体浓度较低( 降解酶浓度较低) ， 2 , 4 ，6 t c p 的降解率只有3 2 9 ；当接种量小于3 0 时，2 ，4 ，6 - t c p 的降解率与接种 量成正相关关系，继续增加接种量，降解率反而略有下降( 推测传质阻力和代谢 环境恶化成为限制因素) 。可见3 0 的接种量为该条件下的最适投菌量，故后续实 验中p s b d r 的接种量均定为3 0 。 4 3 6 初始p h 的影响 以3 0 的接种量将原菌液接种至1 4 0m l 的降解培养基中，2 4 6 t c p 浓度为 5 0m g l ，用盐酸和氢氧化钠调节初始p h ，使其分别为6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 ， 光照培养7d 后取样测定2 , 4 。6 t c p 的降解率，实验结果见图4 7 。 摹 静 琏 遨 。一 昌 口 气 n p h 图4 - 7 初始p h 对2 ，4 ，6 - t c p 降解率的影响 f i g 4 7 e f f e c to fi n i t i a lp ho n2 , 4 6 一t c pd e g r a d a t i o n 结果表明，体系在p h6 0 1 0 0 之间p s b d r 对2 ，4 ，6 t c p 的降解率均大于5 0 ， 说明p s b d r 有较强的p h 适应性，p s b d r 静息细胞对2 ，4 ，6 t c p 的降解率随初 始p h 的递增先增大后减小，其中以p h = 7 0 时为最佳，过高或过低的p h 值对 2 ，4 ，6 t c p 的降解都有不同程度的抑制作用。故在本实验条件下，选择2 ，4 6 t c p 的较优降解条件为p h = 7 0 的中性条件。胡筱敏等【9 1 】在研究光合细菌p s b 1 d 对2 氯苯酚的降解特性时发现当p h 值为7 0 时，菌株p s b 1 d 对2 氯酚的降解率最大， 7d 后对5 0m g l 的2 氯酚降解率达6 0 9 9 ；王玉芬等【9 2 】在研究光合细菌球形红 浙江工业大学硕士学位论文5 3 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 细菌厌氧降解氯代苯时也得到类似的结论。虽然本实验中所用为完整细胞，细胞 本身会对外界氢离子浓度改变有一定的缓冲作用，但反应体系p h 值的变化仍可能 对细胞内酶的电离情况和酶蛋白的空间构象有所影响【8 6 1 ，从而改变酶的催化活性。 4 3 7 氯化铵的影晌 以3 0 的接种量将原菌液分别接种于1 4 0m l 含2 ，4 ，6 t c p 的降解培养基中， 2 ，4 ，6 t c p 浓度为5 0m g l ，降解培养基中氯化铵浓度分别设置为0g l 、0 6g l 、 1 2g l 、1 8g l 、2 4g l ，培养基初始p h = 7 0 ，光照培养7d 后( 光照度4 8 0 0l x 、 温度为3 0 ) 取样测定2 4 6 t c p 的浓度，实验结果见图4 8 。 装 得 琏 逝 山 2 婚 寸 n 氯化铵浓度( g l ) 图4 8 氯化铵浓度对2 ，4 6 - t c p 降解率的影响 f i g 4 - 8 e f f e c to fa m m o n i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o no n2 ，4 ，6 t c pd e g r a d a t i o n 结果显示，随着氯化铵浓度的增加，2 ，4 。6 t c p 的降解率呈现逐渐降低的趋势， 培养基中不添加氯化铵的实验组7d 后降解率达到9 1 5 ，而氯化铵浓度为2 4g l 的实验组7d 后降解率仅为7 1 2 ，未添加氯化铵实验组的降解率高于其他实验组。 b l a s e o 等【8 3 】在研究r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u se l f l 对硝基酚的降解时曾发现铵的加入 将严重抑制e l f l 对2 4 d n p 的降解，而m a d u k a s i 等 6 0 1 在研究紫色非硫光合细菌 z 0 8 处理制药废水时却得出了相反的结论；本实验的结果表明，p s b d r 对 2 4 6 t c p 的降解是通过酶催化作用完成的，模拟废水中氯化铵的加入对某些关键 酶的活性起到了抑制作用，从而导致了2 ，4 ，6 t c p 降解率的下降。故在本实验中， 确定培养基中不添加氯化铵作为p s b d r 降解2 ，4 ，6 t c p 的较优条件。 浙江工业大学硕士学位论文5 4 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 4 3 8 生化反应时间的影响 图4 9 为生化反应时间对2 ，4 ，6 t c p 降解率的影响( 最佳降解条件下) ，从图 中可以看出，反应1d 后2 ，4 ，6 t c p 的降解率为5 5 5 ，随着反应时间的增加，5d 后的降解率达到了8 2 3 ，虽然7d 后的降解率( 8 8 5 ) 稍高于5d 后的降解率， 但在实际工程应用中考虑到经济性方面的原因，故选择时间相对更短的5d 作为 2 4 6 t c p 降解的最佳反应时间。 摹 瓣 膜 逝 厶 昌 崎 史 n 时间( d ) 图4 9 反应时间对2 ，4 ，6 - t c p 降解率的影响 f i g 4 9 e f f e c to f r e a c t i o nt i m eo n2 ，4 ，6 - t c pd e g r a d a t i o n 4 3 92 , 4 6 t c p 降解动力学分析 通过降解动力学模型的建立，可以预测微生物降解污染物的趋势并对生化反 应的工艺条件进行优化，为工程应用提供指导。本实验设置了不同初始浓度的 2 4 6 t c p 在最佳降解条件下进行底物浓度的酶动力学反应。 实验结果见图4 1 0 。结果显示，2 4 6 t c p 的降解率随着其初始浓度的升高而 降低，当2 4 6 t c p 初始浓度为1 0m g l 时，7d 后2 , 4 6 t c p 能够被完全降解，随 着其浓度升高到1 0 0m g l ，降解率下降为7 0 2 ，当2 , 4 6 t c p 浓度达到1 4 0m g l 时，7d 后降解率已经下降到6 3 ，可见随着浓度的升高2 ，4 ，6 t c p 对菌体的毒性 逐渐增强。图4 1 1 显示了在不同初始浓度下2 4 6 t c p 降解的初始反应速率( 最 初2 4h 内) 。 浙江工业大学硕士学位论文5 5 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 ，、 毫 邑 倒 8 卜 追 蚤 时间m ) 十1 0 m g l + 2 0 m g l 一5 0 m g l + 8 0 m g l + 1 0 0 1 1 1 9 l 一1 4 彻1 9 l 图4 1 0 不同初始浓度下2 , 4 。6 - t c p 的降解情况 f i g 4 - 1 0d e g r a d a t i o no f 2 ，4 ，6 t c pu n d e rd i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o n s 从图4 1 1 中可以看出，初始浓度小于1 0 0m g l 时，初始降解速率随着 2 , 4 ，6 t c p 浓度的升高而升高，而后达到某一极大值后会有所下降，表明2 ，4 ，6 t c p 的降解( 基于初始反应速率) 符合高浓度底物抑制的酶促反应类型，故采用a n d r e w s 方程模拟其降解动力学过程。 ，i = 薄f n l a x c k i ( 1 ) 式中：r i 为酶促反应速率，h - 1 ；c 为底物浓度，r a g l ；为米氏常数，m g l ； k 为抑制常数，m g l ；r m a x 为不存在抑制剂时的最大酶促反应速率常数，h - 1 。当 底物浓度较低时( 小于1 0 0m g l ) ，以1 r i 对1 尼作图，从直线的斜率和截距求得 动力学参数。产1 7 4 6h - 1 ，k i n = 3 8 3 3 3m g l 。当初始反应速率达到最大时，即当 c = 1 0 0m g l ，k i 彩= 2 6 0 8 7m g l ，因而得到p s b d r 降解2 , 4 ，6 t c p 的动力学 方程为： 1 7 4 6 ，；= 夏_ = 一 (2)83 3 3 “ 3 c 7 c 2 6 0 8 7 浙江工业大学硕士学位论文5 6 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 2 , 4 。6 - t c p 亳t j 始浓度( m g l ) 图4 1 1不同初始浓度下2 ，4 ，6 t c p 的初始反应速率 f i g 4 - 11 v a r i a t i o no f t h ei n i t i a lr a t eo f 2 ，4 ，6 一t c pd e g r a d a t i o nw i t hi n i t i a l2 , 4 ，6 - t c pc o n c e n t r a t i o n 1 e 图4 1 2 低2 ，4 ，6 t c p 浓度下1 尼和1 r i 之间的关系 f i g 4 1 2r e l a t i o n s h i pb e t w e e n1 ca n d1 r id u r i n gl o w i n i t i a l2 , 4 6 t c pc o n c e n t r a t i o n s 4 4 本章小结 本章采用混合光合细菌p s b d r 静息细胞降解2 , 4 6 t c p ，考察了醋酸钠添加 量、光照、接种量、初始p h 、氯化铵添加量和生化反应时间等因素对2 ，4 ，6 t c p 生物降解性能的影响。研究结果表明：当接种量为3 0 ，培养基初始p h 为7 0 ， 浙江工业大学硕士学位论文5 7 光合细菌降解废水中二氯苯酚和二氯苯酚的研究 培养基中不添加醋酸钠和氯化铵，在光照静置( 温度3 0 。c ，光照度4 8 0 0l x ) 的 条件下2 ，4 ，6 t c p 降解率较高，5d 后降解率能够达到8 2 3 以上。降解动力学研 究表明，p s b d r 静息细胞对2 ，4 ，6 t c p 的降解符合高浓度底物抑制的酶促反应类 型，其降解动力学参数r m a x = 1 7 4 6h 1 ，k i n = 3 8 3 3 3m g l ，k i = 2 6 0 8 7m g l 。 浙江工业大学硕士学位论文5 8 光合细菌降解废水中二氯苯酚和j 氯苯酚的研究 第五章结论与展望 5 1 结论 本文主要研究了混合光合细菌p s b d r 增殖培养基的优化及其静息细胞对模 拟废水中2 , 6 二氯苯酚( 2 ，6 d c p ) 和2 ，4 。6 三氯苯酚( 2 , 4 ，6 t c p ) 的降解，考察 了醋酸钠浓度、光照、初始p h 值、接种量、氯化铵浓度及生化反应时间等因素对 其生物降解性能的影响，在实验得到的较佳降解条件下，进行了2 , 6 d c p 降解途 径的初步研究和2 ，4 ，6 t c p 降解动力学研究。具体结论如下： ( 1 ) 根据混合光合细菌p s b d r 的形态学特征、部分生理生化特性，初步鉴 定得出p s b d r 的优势茵群为红假单胞菌。培养基组分如不同碳源、碳源浓度、 不同氮源、氮源浓度等因素都会对光合细菌的生长产生影响，并且导致茵体浓度、 生长周期等发生变化。在实验中，得出p s b d r 生长较为适宜的培养基条件为： 2 4 3 2g l 无水乙酸钠为碳源，1 2g l 氯化铵为氮源，生长因子添加量为2m l l 。 ( 2 ) 当2 6 d c p 浓度为5 0m g l 时，在接种量为3 0 ，培养基初始p h 为6 0 ， 培养基中不添加醋酸钠和氯化铵，光照敞口静置( 温度3 0 ，光照度4 8 0 0l x ) 的条件下p s b d r 静息细胞对2 , 6 d c p 的降解率较高，7d 后降解率能够达到8 0 以上。降解途径研究表明，2 6 d c p 可能是在单加氧酶的作用下形成二氯对苯二酚， 然后再逐步脱去氯取代基生成对苯二酚并在双加氧酶的作用下进行开环反应。 ( 3 ) 当2 ，4 ，6 t c p 浓度为5 0m g l 时，在接种量为3 0 ，培养基初始p h 为 7 o ，培养基中不添加醋酸钠和氯化铵，光照静置( 温度3 0 ，光照度4 8 0 0l x ) 的条件下p s b d r 静息细胞对2 , 4 6 t c p 的降解率较高，5d 后降解率能够达到 8 2 3 以上。降解动力学研究表明，p s b d r 静息细胞对2 4 6 t c p 的降解符合高 浓度底物抑制的酶促反应类型，其降解动力学参数= 1 7 4 6h - 1 ，k m = 3 8 3 3 3m g l ， k i = 2 6 0 8 7m g l 。 5 2 展望 p s b d r 静息细胞降解2 , 6 二氯苯酚和2 4 6 三氯苯酚的成功为工程_ k n 定化 细胞大规模降解氯酚提供了良好的应用前景。目前国内外关于p s b 降解废水