（林产化学加工工程专业论文）微藻油脂制备生物柴油研究.pdf

摘要 本研究旨在开发一种富含油脂的微藻资源来制备生物柴油，从以下四个方面对微藻 小球藻进行了系统的研究：微藻的培养及培养条件优化、微藻油脂提取条件研究、富含油 脂微藻培养条件探讨、微藻油脂制备生物柴油及产品性能研究，主要结果如下： 三株小球藻( 俐。陀f f 口点印，劬舰妇s 伽舡丹i 册岛胁v 砒渺鼢) 生长和繁殖的适 宜培养条件为：培养基为b g u ，接种密度o 2 5 ( o d 5 4 嘶) ，初始p h8 ，培养温度2 5 ， 光照强度3 5 0 0 l u 】( 0 5 0 0 i u ) ( ，尿素均为三者更适宜的氮源，适宜的氮含量依次为o 1 2 5 9 l 、 0 0 6 2 5 9 l 、o 1 2 5 朗。 微藻油脂提取适宜的方法为溶剂浸提法，以石油醚乙醚( 体积比2 ：1 ) 混合液为浸提溶 剂，在4 0 水浴中浸提5 h 。 通过对不同培养条件下微藻的油脂得率的研究，确定了三株微藻最佳的富集油脂的条 件；采用气质联用和气相色谱法分析了微藻的主要脂肪酸组成及含量，结果表明三株小球 藻的主要脂肪酸组成均为c 1 6 和c 1 8 脂肪酸。 将微藻生长的最适条件与富集油脂条件综合考虑，筛选出富含油脂的微藻藻株为 劬z d 愆池卿，其优化的培养条件为：初始p h 8 ，温度2 5 、光照强度3 5 0 0 l u x 、以硝酸 钠为氮源并使其含氮量为o 2 5 虮，在此条件下。微藻油脂含量高达4 3 7 。 采用碱催化转酯化法将微藻油脂制备成生物柴油，并测定该生物柴油产品的主要性能 指标：密度、运动黏度、燃烧值、闪点、酸值及十六烷值，结果表明，以微藻油脂制备的 生物柴油符合生物柴油国家标准g b 厂r2 0 8 2 8 2 0 0 7 和美国标准a s t m6 7 5 l 0 3 ，可作为燃 料使用。 关键词：生物柴油，小球藻 肠陀砌互印，微藻油脂，提取方法，脂肪酸组成 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作 ： 所取得的成果。尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容和致谢的地方外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者c 本人签名，：音沸沣游6 月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版( 中国科学技术 信息研究所；国家图书馆等) ，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京林业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以汇编和综合 为学校的科技成果，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文全部或部分内容 保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密彰 ( 请在以上方框内打“ ”) 学位论文作者( 本人签名) ：卉弗弗加砖年6 月f 1 日 艚划引帖引：渺衍柚棚 1 文献综述 随着全球范围内的能源需求不断增加、原油价格飙升及愈加严格的环保要求，开发可 再生、环保的替代燃料已成为经济可持续发展最重要课题之一，利用生物质资源生产燃料 技术应运而生。 生物柴油( b i o d i e s e l ) ，是指以油料作物、野生油料作物和工程微藻等水生植物油脂， 以及动物油脂、废餐饮油等为原料油通过酯交换( t 雠l s e s t e r i 6 c a t i o nr e a c t i o n ) 工艺制成的 甲酯或乙酯燃料。作为可替代石化柴油的清洁生物燃料，生物柴油的生产成本和使用性能 都与现用石化柴油基本相当，且具有良好的环境特性和可生物降解性，具有广阔的发展前 尉1 纠。 1 1 生物柴油概述 1 1 1 生物柴油的性质 与石化柴油的性能相比，生物柴油具有以下性质，同时这也是生物柴油的优越性所在 f 3 4 】 o 1 生物柴油比石化柴油具有相对较高的运动粘度，这使得生物柴油在不影响燃油雾 化的情况下，更容易在汽缸内壁形成一层油膜，从而提高运动机件的润滑性，降低机件的 磨损。 2 生物柴油的闪点较石化柴油高，有利于安全运输、储存。 3 十六烷值较高，一般大于5 0 ，抗爆性能优于石化柴油。 4 生物柴油含氧量高于石化柴油，可达l o ，在燃烧过程中所需的氧气量较石化柴 油少，燃烧、点火性能优于石化柴油。 5 无毒性，而且生物分解性良好( 9 8 可降解) ，健康环保性能良好。除了供公交 车、卡车等柴油机作替代燃料外，也可作海洋运输、水域动力设备、地底矿业设备，燃油 发电厂等非道路用柴油机的替代燃料。 6 基本不含芳香族烃类成分所以不具致癌性，而且硫、铅、卤素等有害物质含量极少。 7 不需改动柴油机，可直接添加使用，同时无须另添设加油设备，储存设备及人员 的特殊技术训练。 8 既可作为添加剂促进燃烧效果，又是燃料，具有双重效果。 9 生物柴油以一定的比例与石化柴油调和使用，可以降低油耗、提高动力特性，降 低排放污染率。研究发现，用生物柴油和2 撑柴油l ：l 混合，可以达到最佳的燃烧工况p j 。 l o 环境友好，采用生物柴油的燃烧生成物中，有毒有机物排放量仅为l 1 0 ，颗粒物 为普通柴油的2 0 ，c 0 2 和c o 排放量仅为石化柴油的1 0 ，混和生物柴油可将含硫排放 物从5 0 0 p p m 降低到5 p p m 。 。 美国西南研究所会同美国国家再生能实验室( 陋l ) 对燃用生物柴油的滑车在底盘 测功器上进行了尾气中有害气体对人的体重、食欲、死亡率、血液、神经、肺部、眼睛及 d n a 等方面的影响得出如下结论：尾气中各项有害气体和活性碳氢化合物均低于燃用柴 油的货车；可降低多环芳香族碳氢化合物而并无新的碳氢化合物形成。 也正是生物柴油的这一系列优越性，使生物柴油成为当今各国研究机构的研究热点， 作为一个具有开发前景的能源也吸引了不少企业的目光。 1 1 2 生物柴油的研究进展 目前，生物柴油的研究主要集中在两个方面：一是对生物柴油生产工艺的研究；二是 对生物柴油的生产原料的研究。 1 1 2 1 生物柴油生产工艺的研究 目前，生物柴油的主要生产方法有直接混合法、微乳液法、高温热裂解法、酯交换法 等，其中最常用的是酯交换法，包括液体酸碱催化，固体体酸碱催化，酶催化，全细胞催 化及超临界催化等。 直接混合法混合法是将生物柴油与石化柴油、添加剂、降凝剂、抗磨添加剂等混 合，改善生物柴油的特性，达到柴油的使用要求。生物柴油可以任何比例与从石油提炼出的 柴油相混合，形成生物柴油混合物。j o h n s o n 等1 6 l 将生物柴油与石化柴油l ：l 质量比混合， 得到的混合柴油结晶点降至2 0 以下。n o u r c d d i n i 等t 7 j 通过在生物柴油中添加由甘油与 或异戊烯在强酸催化条件下反应生成的甘油醚，从而将生物柴油的浊点有效降低至o 以 下。a u s c h m 等佯j 向油菜籽油甲酯中加入质量分数0 0 0 5 5 的抗凝剂聚( 甲基) 丙烯 酸系列，倾点降至一4 0 左右，软化点可降至4 2 以下。由此法制备的生物柴油为液态， 轻便故便于运输；且属可再生能源，热值高，但又存在粘度高、易变质、不易完全燃烧的 缺点。 微乳液法微乳液法是将生物柴油与溶剂形成微乳液使用，同时还可以添加表面活 性剂等，从而有效改善其性能。同时它有助于充分燃烧，可和其他方法结合使用。珏( u r a 等 纠以w ( 高温裂解生物质得到的生物柴油) ：w ( 石化柴油) ：w ( 聚氧乙烯系列的表面活化 剂) = 4 5 ：5 0 ：5 混合形成微乳液，所得燃料闪点在7 0 以上，燃点在9 0 以上，倾点在 - 4 5 以下，具有良好的稳定性和与正常柴油相近的物理特性。w e i l z e i 等l l o j 以矿( 生物柴 油) ：y ( 添加剂) = ( 1 9 9 ) ：l 混合形成微乳液，其中添加剂是由乙醇( 含水量0 5 2 5 ) 、c 3 至c 1 2 直链或支链醇( 或者) 中的任意一种或多种、不含水的氨或尿素混合的脂 肪酸组成，所得燃料的完全燃烧性能得到了很大提高。但微乳液在低温下并不稳定，微乳液 中的醇具有一定的吸水性i l 。 高温热裂解法目前，高温热裂解主要有植物油的热裂解和生物质的热解两种途径。 王以平等1 1 2 】对植物油的热裂解作了一些尝试，以生物质为原料热解合成生物柴油的研究 主要集中在以下两方面：( 1 ) 以木材和农作物秸秆为原料的快速热解，所得生物柴油的氢 含量为6 2 ，氧含量为3 7 3 ：( 2 ) 藻类的慢速热解。吴庆余等【1 3 】利用微藻快速热解合成 生物柴油，得到的微藻快速热解油氢含量比木材或农作物秸秆的快速热解油高，氧含量则 较低，平均热值高达2 9m j k g 一，是木材或农作物秸秆等的1 5 倍，同时也更稳定，适宜于 2 用作制备生物柴油的原料。但反应产物难以控制，所需反应设备昂贵等也影响了高温热裂 解法推广使用。 酯交换法酯交换法是指以各种油脂和短链醇为原料，以酸、碱、酶等为催化剂，或 者在超临界条件下不使用催化剂进行酯交换反应合成生物柴油的方法，是目前应用最广的 方法。 酸催化酸催化是普遍应用于工业合成生物柴油的方法，在这方面已有很多报道 u 。宋庭礼等【1 4 l 利用高酸值动植物油为原料，硫酸为催化剂，4 0 8 5 下反应，然后分 相、脱色，得到生物柴油。叶活动等1 1 5 j 利用废动植物油在硫酸催化作用下合成出生物柴 油。林华超【l6 l 以酸化植物油、下水道油及回收煎炸油为原料，经酸催化反应得到生物柴油。 反应结束后加入阻聚剂硼酸减压蒸馏，所得到的生物柴油可替代0 # 柴油。b o o c 0 c k 等( 1 7 j 以无水甲醇和脂肪酸甘油酯为原料，先以质量分数2 的硫酸为催化剂，5 0 6 5 下反应 4 5r 血，再以氢氧化钠为催化剂( 同时中和硫酸) ，在同样温度下反应l om i n ，最终得到的 生物柴油中甲酯含量在9 9 以上。 碱催化碱催化也是工业合成生物柴油常用的方法。朱长江u 引先用硫酸铝将动物油 预处理，分离出胶质和杂质，然后再将净化后的动物油与甲醇、甲醇钠反应合成生物柴油。 b a m b o r s t 等1 1 9 j 合成生物柴油时，所使用的催化剂甲醇盐( 如甲醇钠、甲醇钾等) 分两次加 入，初始加入质量分数0 0 7 的甲醇盐，4 5m i n 后再补加o 0 8 ，收率9 8 5 以上。碱催化 时，反应速率比酸催化快。当油酸中游离脂肪酸和水的含量高时，酸催化比碱催化效果好 1 2 0 j 。但酸碱催化中所使用的强酸和强碱对设备腐蚀严重，副反应多，后处理复杂，环境污染 严重。因此，人们致力于研制新型酯合成催化剂，如杂多酸、固体超强酸( 碱) 、相转移催 化剂、金属氧化物及无机盐类、生物酶、离子型有机金属化合物【2 l l 。 酶催化酶是一种适宜的生物催化剂，它能够在亲脂性有机溶剂或者超l 晦界介质中催 化甘油三酯与短链醇的酯交换反应，生成生物柴油。它可以是来源于植物、细菌、真菌或 真核细胞的任何脂肪酶，主要是酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、毛霉脂肪酶和猪胰脂肪酶等。 亲脂性有机溶剂中的酶催化具有反应条件温和、醇用量少、无污染物排放、产品分离纯化 简便等优点，而引起广泛关注。h a a l s 等b 2 j 以甘油三酸酯、乙醇、脂肪酶( m 心0l i p a s e 或 c e l i p a s e 或p s 一3 0l i p a s e ) 为原料合成生物柴油。邓利等【2 3 】以固定化假丝酵母脂肪酶催化油 酸与甲醇反应得到生物柴油。 超临界催化超临界催化是一种高效简便的方法，即在超临界流体参与下进行酯交换 反应。在反应中，超临界流体既可作为反应介质，也可直接参加反应。超i 晦界流体对操作温 度及压力变化具有很强的敏感性，从而可通过改变反应中的操作条件来调节超临界流体的 物理特性( 包括密度、温度、粘度、扩散系数、介电常数、反应速率常数等) ，以进一步影 响反应体系在超临界流体中的传质、溶解度及反应动力学性能，从而改善产率、选择性及 反应速率。该法反应时间短、过程简单、安全、高效、无需催化剂及后续的分离纯化过程。 s a k as 等【2 4 】进行的试验是在锡浴加热的管式反应器中，处于超临界状态的甲醇与菜籽油 发生酯交换反应，醇油摩尔比为4 2 ：l ，反应温度3 5 0 4 0 0 ，压力4 5 6 5m p a ，反应时间 2 4 0s ，菜籽油转化率在9 5 以上。d e n 血b a sa y h 一2 5 j 的试验是在高压釜中，处于超临界状 态的甲醇与榛子油发生反应，摩尔比为4 l ：l ，反应温度4 5 0 5 2 3k ，压力4 5 6 5m p a ，反应 时间2 0 0s ，榛子油转化率达到9 0 以上。 此外，目前也有研究采用全细胞催化的方法来制备生物柴油【2 6 l ，其将全细胞吸附在 一些多孔可渗透的生物质支撑物中，就可省去复杂的酶纯化和固定化过程，大大降低工业 生产的成本。全细胞生物催化剂在工业生产中的应用潜力巨大，通过基因工程技术提高脂 肪酶的表达水平和对甲醇的耐受性等，可以进一步提高全细胞的使用效率。 1 1 2 2 生物柴油生产原料的研究 成本过高一直是生物柴油发展的瓶颈问题，所以应该在降低原料成本上作出更大的 努力，展开以各种生物质为原料的生产途径的研究，以期最大限度降低原料成本，增加生 物柴油大规模产业化的可行性。我国就各种生物质原料作了一些初步的研究，并取得了一 定的进展。 l 、以植物油脂为原料制取生物柴油 利用油菜籽、大豆、花生以及各种油料作物所提取的油脂为原料。其中以油菜籽制取 的生物柴油中不饱和脂肪酸甲酯含量较多【2 7 】。目前，基因工程改造油菜籽已取得了初步的 进展，这是因为油菜作为我国最主要的油料作物，它与模式植物拟南芥同属十字花科芸苔 属，亲缘关系非常相近，拟南芥功能基因可直接应用于油菜的表达调控。目前利用油菜制造 生物柴油技术已有较为成熟的生产工艺，特别是我国运用具有自主知识产权的“底物竞 争”基因调控技术育成反义p e p “超油”油菜，大幅度提高了油菜含油量。由此可见，利用 基因改良如油菜等油料作物进行生物柴油的生产将大有可为。 利用木本油料植物制取生物柴油。我国产油林木种类丰富，常见的产油林木有油棕、 麻疯树、光皮树、油茶等，我国有很多科研单位正在相继开展这方面工作，其中建立了良种 供应基地的有1 0 种左右。这些产油林木可以大面积广泛种植，既营造了良好的生态环境， 也带来了经济效益。 利用滩涂能源植物制取生物柴油。某些滩涂耐盐植物，如海滨锦葵、碱蓬和海蓬子的 种子也富含油脂。在海滨滩涂盐碱地开展此类植物的种植栽培，有望为生物柴油的生产提 供廉价的原料来源。 2 、微生物发酵法制取生物柴油 某些微生物如酵母、霉菌和藻类等在适合的条件下能将碳水化合物转化为油脂贮存在 体内，称为微生物油脂。 从含油酵母中提取油脂制取生物柴油。据报道国内已进行了广谱碳源产油酵母菌的筛 选【捌，其中油脂含量最高可达菌体干重的7 0 以上。这些产油酵母菌能高效利用和转化各 种农林废弃木质纤维素原材料【2 9 】。研究表明，产油酵母可利用海洋滩涂耐盐植物大米草的 水解液转化产生微生物油脂【3 们。微生物油脂发酵周期短，不受场地、季节、气候变化等的 影响，并且所利用的原料价格低廉。可见，利用微生物发酵法获得油脂原料制取生物柴油具 有非常大的发展潜力。 从含油的藻类中提取油脂制取生物柴油。含油藻类同样是潜在的生物柴油生产原料。 据报道异养培养小球藻( c 柚o r e i l ap r o t o t h e c 0 i d e s ) 的含油量可达藻体干重的5 7 2 ，经快速热 4 解可获得生物油p 。但微藻属于低等植物，在基因工程改造以及进行高密度培养等技术上 还要克服很大的困难。国内外有许多科学家正在探索并研制“工程微藻”，希望能实现规 模化养殖，降低成本，为获取油脂资源提供一条可靠的途径。 3 、利用餐饮废油制取生物柴油 以植物油为原料生产生物柴油成本偏高，而将餐饮业废油脂进行回收生产生物柴油则 是一个相对较好的方案晔j 。这样既节省了能源，又使废物资源化，减少了污染。但餐饮废油 脂是含有杂质的高酸值油脂，含有较多游离脂肪酸、聚合物、分解物等杂质，在酯交换反应 之前，必须对其进行预处理，包括废油脂物力精炼和甲醇预酯化【3 3 1 。但值得注意的是餐饮废 油的利用存在资源总量有限，供应不稳定，原料组成及性能变化大等影响因素。 1 1 3 生物柴油的国内外应用现状 1 1 3 1 国外现状 欧盟是全世界生物柴油发展最快的地区【3 4 】。据欧洲生物柴油委员会公布的数据，2 0 0 2 年欧盟生物柴油生产总量为1 0 6 5 万t ，2 0 0 3 年提高到1 4 3 4 万t ，增加了3 5 ；2 0 0 4 年提高到 2 2 4 6 万氓增加了1 0 。预计到2 0 1 0 年产量将达到8 0 0 万1 0 0 0 万t ，生物柴油在柴油市场中 的份额将达到5 7 5 ，2 0 2 0 年可达到2 0 。德国是目前全球最大的生物柴油生产国，主要以 纯态生物柴油( b 1 0 0 ) 作为车用燃料，享受免征燃油税政策。法国的生物柴油以5 的调和比 例加入到石油柴油中进入市场。同时在排放控制严格的地区，b 3 0 生物柴油也作为公共交 通燃料。意大利是目前欧洲生物柴油使用最广的国家，生物柴油主要用于柴油车辆和农业 机械方面，基本上使用纯态生物柴油作为车用燃料。巴西采用其丰产的蓖麻油为原料生产 生物柴油；印度是通过大规模种植麻疯树等非食用油料作物开发生物柴油；菲律宾用椰 子油生产生物柴油；马来西亚采用棕榈油和废油生产生物柴油。 1 1 3 2 国内现状 我国生物柴油的研究与开发虽起步较晚，但发展速度很快。早在2 0 世纪8 0 年代，原 机械工业部和原中国石化总公司就拨出专款立项，专题研究长达l o 年之久。中国科学院、 中国农业工程研究设计院、辽宁省能源研究所、中国科技大学、河南科学陆军化学所、长 沙市新技术研究所与湖南省林业科学院等单位也都对生物柴油作了不同程度的研究。近两 年来，海南正和生物能源公司等民营企业相继开发出拥有自主知识产权的生产技术，并建 成年产超过l 万t 的试验生产厂。此外，江西巨邦化学公司进口美国转基因大豆油和国产 菜籽油生产生物柴油，正在建设l o 万妇生产装置。鉴于生物柴油作为替代燃料的重要意 义和发展潜力，我国相关行业和各地政府对此都给予了高度重视。因为有比较丰富的麻疯 树果油资源，湖北广东、贵州、四川、福建、海南等许多地区都把发展生物柴油作为近期 科技攻关项目和发展规划。目前海南正和生物能源公司( 厂址在河北邯郸武安) 生产能力为 3 万t 乜古杉集团公司生产能力为4 万t 乜福建卓越新能源发展公司生产能力为3 万t 现 都已拥有自主知识产权的技术。预计我国2 0 0 6 年生物柴油产量超过了2 4 万吨。 5 1 1 4 限制生物柴油发展的关键因素 原料供应、原料价格和政策的不完善已经成为制约生物柴油发展的关键。有关专家认 为，只有破解这三大难题，我国生物柴油才有望走上规模化、产业化发展的道路1 3 习。 目前，生物柴油规模化生产面临的首要困难是原料资源得不到保证。据估算，我国的 麻疯树、黄连木等油料植物可满足年产上千万吨生物柴油的原料需要，废弃动植物油回收 可年产约5 0 0 万吨生物柴油，因此，从理论上讲，我国生物柴油发展潜力是巨大的。虽然 南方地区种植了一定数量的麻疯树等油料植物，但分布分散且数量小，尚不足以支撑生物 柴油规模化生产。 中国农科院油料研究所所长、博士生导师王汉中研究员说，发展生物柴油的瓶颈是原 料供应和原料价格。在特殊情况下，获得足够量的原料更为重要。尽管许多木本油料都可 以加工为生物柴油，但规模有限。大豆、花生等草本油料作物也可以作为生物柴油的原料， 但由于它们与我国的主要粮食作物如水稻、玉米等争地，扩大种植面积的潜力有限。 中国农科院油料研究所加工工程中心主任、国家油菜工程技术研究中心副主任、博士 生导师黄风洪研究员同样指出：技术不是问题，主要是原料供应和价格问题。鉴于这种实 际情况，寻求新的来源更为广阔的原料也成为解决这一问题的可行方法，因此我们就把目 光投向资源广阔的海洋微藻，以期获得新的突破。 1 2 微藻概述 藻类，尤其是海洋单细胞藻类，即微藻，是地球上最早的生物物种，它们中的某些物 种已经在地球上生存了3 5 亿年之久。它们能十分有效地利用太阳能将h 2 0 、c 0 2 和无机盐 类转化为有机资源，是地球有机资源的最初级生产力，有了它们才有了大气中的氧气，才 有了海洋和陆地的其他生物，也才有了人类。随着科技水平的不断提高，人口的不可逆性 增长、人类生活水平的不可逆性提高、陆地资源和可耕种面积的不可逆性减少，全球性食 品资源短缺压力日益增加。开发和利用海洋微藻是最长远的解决人类食品资源和能源的重 要途径。因为藻类不仅富含蛋白质、脂肪和碳水化合物这三大类人类所必需的要素，而且 还含有可燃性油类、各种氨基酸、多种维生素、抗生素、高不饱和脂肪酸以及其他多种生 物活性物质，是人类向海洋索取食品、药品、燃料、生化试剂、精细化工产品以及其他重 要材料的一把金钥匙。 微藻是一类单细胞生物，与陆地微生物相比，微藻具有如下特点：u q 1 微藻具有叶绿素等光合器官，是非常有效的生物系统，能有效地利用太阳能通过 光合作用将h 2 0 、c 0 2 和无机盐转化为有机化合物，因其固定和利用c 0 2 可以减少温室效应。 2 微藻一般是以简单的分裂式繁殖，细胞周期较短，易于进行大规模培养，由于微 藻通常无复杂的生殖器官，使整体生物量容易采收和利用。 3 可以用海水、咸水或半咸水培养微藻，因此是淡水短缺、土地贫瘠地区获得有效 生物资源的重要途径。 4 微藻富含蛋白质、脂肪和碳水化合物，某些种类还富含油料、微量元素和矿物质， 6 是人类未来重要的食品及油料的来源。 5 微藻，尤其是海洋微藻，因其独特的生存环境使其能合成许多结构和生理功能独 特的生物活性物质。特别是经过一定的诱导手段微藻可以高浓度地合成这些具有商业化生 产价值的化合物，是人类未来医药品、保健品和化工原料的重要资源。 1 2 1 小球藻简介 小球藻( 矾肠阳蚴是小球藻属绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，卵孢藻科，小球藻属，包 括大约l o 个种。细胞形态为圆形或椭圆形，细胞直径2 1 2 岬，在人工培养的情况下， 生长良好时，细胞会变小。它不能形成合子，而是形成自体孢子进行繁殖，每个母细胞一 次可分裂为4 、8 或1 6 个子细胞。小球藻一般分布在土壤和淡水水域中，有的还以内共生 体的形式出现在无脊椎动物体内t 3 7 l 。 据研究表明郾j ，小球藻细胞组成中的蛋白质含量为7 3 8 8 ，碳水化合物为 5 7 q 8 ，脂类为4 扣8 6 。小球藻细胞中脂类含量的增加主要是由于脂肪酸积累的结果。 在氮饥饿条件下，蛋白核小球藻在生长时可形成高达8 6 的脂类，而在正常的小球藻细胞中， 脂类含量为2 5 。在正常和氮饥饿条件下生长的小球藻在脂肪酸组成上没有明显的差异。此 外，小球藻的异养培养技术，特别是高细胞浓度培养技术的研究得到了较深入的发展f 3 9 4 1 1 ， 这对于我们制备生物柴油需要高生物量的微藻来说，也是具有重要价值的。 晚 a毋 c 图卜4 3 小球藻属 a 营荞细胞：b 、c 似亲孢子的形成和释放 图1 一l 小球藻的繁殖过程 f i 昏l lp r o p a g t i o no f c 掩勋 嵋陋 1 2 2 微藻的开发研究进展 图1 2 显微镜下的小球藻 f i g 1 2c 撮功，i g 细u n d e rt h em c r o g r a p h y 长期以来，人们仅仅是把微藻作为鱼、虾、贝类幼体或成体的直接或间接的活饵料。 近几十年来，人们逐渐注重微藻生物活性物质的研究和开发。微藻的研究始于1 8 世纪末， 单细胞藻类的培养开始于1 9 世纪初，我国朱树屏教授1 9 4 2 年培养成单细胞藻，它先后替代 粮食、饲料。8 0 年代人们己了解微藻中存在着丰富的、结构独特的生物活性物质，其中 有许多具有药理活性，是十分丰富的高价值化学品及药品的来源，在医药和保健品的开发 应用方面具有巨大的潜力。当前，微藻及微藻产品在医药工业中的应用正逐步受到人们的 重视。目前，藻类生物技术的研究开发遍及世界各地，藻类生产公司大量涌现。从微藻中提 取色素、微藻多糖、多不饱和脂肪酸、毒素、抗生素、甜菜碱、酶、甾醇等活性物质在当 前都有研究，并取得了一定的成果。 色素从微藻中提取的色素主要有b 胡萝卜素、虾青素和藻蓝素。b 一胡萝卜素是 7 v a 的前体，有抗氧化、抗突变、抗衰老、预防癌症、增加免疫力等作用。虾青素具有很强 的抗氧化功能，能清除体内自由基，对紫外线引发的皮肤癌有很好的治疗效果，还能显著促 进机体抗体的产生心j 。藻蓝素亦称藻蓝蛋白，是一种安全无毒的色素蛋白，能促进血细胞再 生，是一种理想的光敏剂，国外已用于癌症的光动态治疗。藻蓝蛋自在螺旋藻中含量异常丰 富，是天然蓝色素的巨大资源宝库，可取代合成色素用于仪器、医药和化妆品工业；高纯度的 藻蓝蛋白是一种荧光分子探针，它与其他配体分子结合后，可以标记各种生物大分子用于 生物分子试剂岬j 。目前从螺旋藻中提取藻蓝蛋白已在日本进行商业化生产。 多糖微藻多糖是广泛存在于微藻体内的一种天然大分子物质，具有抗肿瘤、抗病 毒、抗辐射损伤、抗突变、抗衰老、抗凝血、降血脂及调节机体免疫能力等广泛的生理功 能。据研究表明螺旋藻多糖对体外培养的胃癌细胞、结肠及直肠癌细胞均有一定的抑制作 用，且呈剂量依赖性州j 。而且螺旋藻多糖对小鼠s 1 8 0 肉瘤的抑制作用，发现螺旋藻多糖在 5 肛1 0 0 p 幽 i d 的剂量范围对肉瘤有抑制作用，具有明显升高小鼠外周血自细胞的功能，促进 荷瘤小鼠淋巴细胞转换作用，促进荷瘤小鼠脾呦胞对靶细胞的细胞毒作用【4 5 l 。 多不饱和脂肪酸当前研究较多的多不饱和脂肪酸( p u f a ) 是二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) ，它们具有独特的生理功效，有预防和治疗心血管疾病、癌症，调 节中枢神经、视觉系统的功能，可提高人体的免疫机能调节能力，防止记忆力减退。2 0 世纪 8 0 年代初期，已经开始利用微藻生产多不饱和脂肪酸。人们对微藻中脂肪酸组成进行分析， 对富含p u f a 的藻种进行筛选，对影响微藻p u f a 积累的理化条件( 光照、温度、p h 、盐度、 溶氧量、氮源浓度和磷源浓度、n a c l 浓度、微量元素、二氧化碳等) 进行深入探讨，并拟定 了不少微藻高产p 吼的最佳培养方式和培养条件【4 “引。国际上已有o n l e g at e c h 、m a i t e k 、 n i l s s i no i l s s i i lo i u i l i s 等公司利用微藻培养生产e p a 和d h a ，并已开发了3 0 多种d h a 保健 营养品，e p a 在9 0 年代初就被日本正式批准用于治疗心血管疾病的药物。我国科学院海洋 研究所研制出富含e p a 或d h a 的海洋微藻胶囊( 片) 。目前，日本d h a 保健食品的应用在世 界上居领先地位，我国只有小规模生产，对微藻多不饱和脂肪酸的研究还大多处于实验室和 试生产阶段，还需进行更迸一步的研究开发。 微藻油脂美国国家可更新实验室( n r e l ) 通过现代生物技术建成。工程微藻”，即硅 藻类的一种“工程小球藻”，其利用“工程微藻“生产生物柴油，为生物柴油生产开辟了一条 新的技术途径。在实验室条件下可使“工程微藻”中脂质含量增加到6 0 以上，户外生产也 可增加到4 0 以上，而一般自然状态下微藻的脂质含量为5 - 2 0 。 “工程微藻”中脂质 含量的提高主要由于乙酰辅酶a 羧化酶( a c c ) 基因在微藻细胞中的高效表达，在控制脂质 积累水平方面起到了重要作用。目前，正在研究选择合适的分子载体，使a c c 基因在细 菌、酵母和植物中充分表达，还进一步将修饰的a c c 基因引入微藻中以获得更高效表达。 在国内，清华大学吴庆余，缪晓玲等也报道利用微藻快速热解的方法制备生物柴油。利用 微藻或“工程微藻”生产生物柴油的优越性在于：微藻生产能力高、用海水作为天然培养基 可节约农业资源：比陆生植物单产油脂高出几十倍；生产的生物柴油不含硫，燃烧时不排 放有毒害气体，排入环境中也可被微生物降解，不污染环境，发展富含油质的微藻或者“工 程微藻”是生产生物柴油的一大趋势。 8 1 2 3 微藻生长及脂肪酸组成的影响因素研究 在单细胞微藻的培养过程中，培养基成分、温度、光照、p h 值、培养方式、通气量、 盐度等均会影响微藻的生长以及其脂肪酸的含量与组成，这些因子，除了具有合适的范围 外，也可能存在交互作用。 1 2 3 1 培养基成分 培养基中氮源对微藻的生长及脂肪酸的影响最为显著。微藻通常可以利用铵盐、硝酸 盐及尿素等作为其氮源。单胞藻虽对这些盐类都能吸收与利用，但在吸收的速度与利用的 程度上是有差别的1 4 9 御j 。其中有机氮尿素对不同微藻生长影响的情况较无机氮的复杂。已 经证实许多藻含有尿素酶，在它的催化下，尿素分解出氨被微藻利用1 5 。可能是酶功能 的差异造成了各种微藻利用氮的能力差异，结果也支持了藻类对氮盐喜好和利用能力存在 差异的观点垆到。沈颂东研究证实哪j ，氮的浓度对小球藻的影响比较复杂，要视氮源而论， 当氮源为n a n 0 3 时，淡水小球藻的生长高峰在氮添加浓度为o 0 8 0 1 6 n 1 0 扎；而当尿素作 为氮源时，淡水小球藻的生长高峰在氮添加浓度为o 0 0 25 0 0 1 5 m o 儿。 y ，o n 鲫a n i t c h 撕等研究发现聊i ，三角褐指藻在利用铵、硝酸盐和尿素等作为氮源时，e p a 含量分别占脂肪酸的2 5 2 ，l o 0 和3 1 8 。一般说来p u f a 和e p a 的比例随氮浓度的 增加而增加，可能是由于低浓度使其平均分裂速率降低【5 5 一。 1 2 3 2 温度 温度是影响藻类所有代谢活动的一个主要因子【5 7 l ，也是影响微藻脂肪含量和脂肪酸 种类的重要因素之一。早期研究表明，在极端高温或低温条件下，微藻合成脂肪的量减少 郾 5 9 j ，并指出极端温度下合成受限可能是相关的酶发生不可逆损伤所致。在一定范围内升 高培养温度会使某些藻的脂肪含量增加，但是，高温下培养的微藻不饱和脂肪酸的含量下降 刚l 。o p u t e 认为存在脂肪合成的最适温度，且因种而异。 。s e t 0 等研究认为扣，c 忍z d 陀妇肌加枷泌f ，撇只有在低温下培养才能产出大量的e p ：a ， 当m 纫如妇c 勋北，- f z f 聊培养温度从1 0 升到2 5 时e p a 从2 8 4 下降到1 8 1 ，d h a 从8 3 下降到6 5 【6 2 l 。也有报道说，随温度的升高，某些微藻p u 狐变化不明显，甚至 升高f 6 3 】。温度对微藻p u f a 的影响因种而异，总的趋势是随温度的降低脂肪酸的不饱和 度增加，但生长变慢，生物量降低。 1 2 3 3 光照 光照是影响微藻光合培养最重要的因子。藻类细胞只能在某一时刻利用有限的光能进 行光合作用，高于某一强度的光照不能被藻细胞利用，而是以热能形式的散发被浪费了， 甚至这种高强度的光还会抑制藻的生长，即光饱和效应，同时，也会存在光抑制、光限制 效应等。 9 光照强度的增加有利于p u f a 的合成，脚，6 5 l 对于许多硅藻和裸甲藻，低光照强度可 以增加p u f a 的形成和积累，但对于一些绿藻和红藻，效果相反。大多数藻低光照下，e p a 的 含量达到最大值，而d h a 含量随光照强度的增加而增加惭 6 7 1 。也有报道，小球藻的饱和 脂肪酸和一烯酸含量随光照强度的增强而增加，而p u f a 的含量则反而下降【钙l 。 1 2 3 4p h 值 p h 值是影响藻类有关生长代谢等许多生理过程的另一重要因子，它会影响光合作用 中二氧化碳的可用性，在呼吸作用中影响微藻对有机碳源的利用效率，并影响培养基中微 藻细胞对离子的吸收和利用，以及代谢产物的再利用和毒性郾l 。藻类生长的p h 值在不同 种之间存在差异，一般来说，小球藻的生长的p h 值范围是4 5 1 0 6 ，在p h 5 5 8 0 时有 利于小球藻的生长。此外，p h 还能影响微藻细胞中代谢产物的形成，对其组成与含量均 会有所影响。 1 2 3 5 培养方式 小球藻细胞除了可以利用光能和c 0 2 进行自养生长外，还可以在添加有机碳源的条 件下进行异养生长【6 9 】。在两种不同的培养方式中，小球藻不仅在细胞结构上有所差异u j ， 而且在生化成分上也会有很大的不同。在脂肪含量及组成方面，有研究表明，当自养向异 养培养转化后，细胞的脂肪含量急剧增加可高达细胞干重的7 0 ，是自养细胞的脂肪 含量的4 4 倍【7 1 】。而两者的脂肪酸组成也有所不同，异养小球藻细胞中油酸、亚油酸和棕 榈酸的含量较多，但是亚麻酸却较少，而自养细胞却相反【7 2 1 。然而，也有研究得出完全 不同的结果，可能是由于藻种不同的原因。 1 3 本课题的研究目的及内容 本研究旨在开发种富含油脂的微藻资源来制备生物柴油，并对该技术的可行性进行 初步的研究与探索。本课题的主要研究内容有以下四个方面： l 、微藻培养与培养条件的优化。对影响微藻生长速率的主要因素，诸如培养基、接 种密度、p h 值、光照强度、温度、氮源及微藻培养方式等进行研究与探讨，确定各株微 藻适宜的培养条件。 2 、微藻油脂提取与分析方法的研究。对比不同的提取方法的提取效果，以期获得最 适宜的提取方法。同时，通过气相色谱分析或气一质联用技术来分析微藻的脂肪酸组成。 3 、微藻油脂得率与脂肪酸组成的影响因素分析。主要考察不同培养条件对微藻油脂 得率及脂肪酸组成的影响，以期获得微藻油脂得率最高，且脂肪酸组成以c 1 6 和c 1 8 为主 的藻株及培养条件。 4 、生物柴油的制备及产品性能研究。利用本试验培养、采收所得的藻粉经提取得到 的微藻油脂，通过酯交换反应来制备生物柴油：并对其产品的主要性能指标进行测定，探 讨其进一步开发应用的可行性。 1 0 2 微藻的培养条件优化 2 1 实验材料与方法 2 1 1 藻种 小球藻国妣妇卿购自中国科学院海洋研究所 小球藻c 肠陀妇册，d 舫z 切z 口购自中国科学院水生生物研究所 小球藻c 忍肠化妇1 ，“船括购自中国科学院水生生物研究所 2 1 2 试剂与仪器设备 所采用的培养基有b g l l 培养基、s e 培养基、水生6 号培养基及舵培养基四种培养 基，主要使用的试剂如表2 1 表2 - 4 所示；所使用的主要仪器设备如表2 5 所示。 表2 1b g l l 培养基 r a b l e2 一lb g l lm e d - u m 工作液 g ，l 1 5 0 0 4 o 0 7 5 0 0 3 6 0 0 0 6 0 0 0 6 0 0 0 1 0 0 2 l m l 9 9 9 m l n a n 0 3 k 2 哟4 3 h 2 0 m g s 0 4 7 h 2 0 c a c l 2 2 h 2 0 c 6 h 9 0 7 h 2 0 f e ( n h 4 ) 3 ( g 6 h 5 0 7 ) 2 e d t a n a 2 c 0 3 a 5 + c o h 2 0 注：a 5 + c o 由h 3 8 0 32 8 6 舀z n s 0 4 4 h 2 00 2 2 2 岛m n c l 2 4 h 2 01 8 l 吕c u s 0 4 5 h 2 00 0 7 9 舀 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0o 3 9 & c o ( n 0 3 ) 2 6 h 2 00 0 4 9 9 溶于去离子水中，并定容1 0 0 0 m i ，每l l 培养基取l m l 。 表2 - 2 s e 培养基 1 b l e 2 2 s e m e d u m 工作液 n 心i 0 3 k 2 ，i m 3 h 2 0 m g s 0 4 。7 h 2 0 c a c l 2 2 h 2 0 k h 2 p 0 4 o 2 5 9 o 0 7 5 9 0 0 7 5 9 o 0 2 5 9 o 1 7 5 9 n a c i s o i i e x 出臣c t r c l 3 6 h 2 0 f e e d l a a 5s o l u t i o n d i s t 1 l e dw a t e r o 0 2 5 4 0 m i o 0 0 5 l m l l m l 9 5 8 m l 注：a 5s 0 l u t i o n 事由h 3 8 0 32 8 6 z n s 0 4 4 h 2 00 2 2 2 m 屹1 2 - 4 h 2 01 8l 舀c u s 0 4 5 h 2 0o 0 7 9 ( 陌 4 ) 6 m 0 7 0 2 4 - 4 h 2 00 3 9 9 溶于去离子水中，并定容1 0 0 0 m l 每l l 培养基取l m l 。 s o i ie 炳a c t 幸( 土壤提取液) 配置方法：取花园土未施过肥o 5 埏置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏 水i 0 0 0 毫升，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热2 小时。冷却数小时，在无菌条件下过滤，取上 清液，将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1 0 0 0 毫升，土壤提取液保存在4 0 c 备用。 表2 - 3 水生6 号培养基 t a b i e2 - 3h y d p h n y6 。m e d i u m 注：s o i le 删的配置方法同上s e 培养基中s o i i 删的配置方法。 表2 - 4 耽培养基 t a b i e 2 4 舵m e d i u m 工作液 鲫 n 2 l h c 0 3 1 2 9 n a c l l g k h 2 p 0 4o 0 2 9 k n q o 1 9 n h 2 c o n 】o 0 3 9 m g s 0 4 7 h _ oo 0 2 9 舵微量元素溶液l l n l 耽维生素溶液 i m l d i s t i i i e dw a t e r 1 0 0 0 m i 1 2 注：舵微量元素溶液是由z n s 0 4 4 h 2 0o 0 2 3 舀m 陀2 4 h 2 0o 0 7 8 9 c u s 0 4 5 h 2 0o o lo g f e c 6 h 5 0 7 5 h 2 0 o 0 0 3 9 舀n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0o 0 0 7 3 舀c o c l 2 6 h 2 00 0 1 2 岛n a 2 e d t a0 0 0 4 3 5 9 溶于去离子水中，并定容至 l 删，每l l 培养基取l i i 。 舵维生素溶液由维生素b 1 2o o 0 0 5 9 ，维生素b lo 1 9 溶于去离子水中，并定容至l o o o m l ，每l l 培养基取i m l 。 表2 - 5 使用仪器设备一览表 1 阻b i e2 - 5a p p a 豫t i l s 仪器名称及型号生产厂家 s p x - 2 5 0 l 好型微电脑光照培养箱 r 一3 5 h 光照培养箱 a 1 1 e g 阳x - 2 2 r 离心机 超低温冰箱 a i p h al - 2 冷冻干燥机 u v 二2 4 5 0 紫外及可见光分光光度计 a i r t e c h 超净工作台 ) s 1 7 c e 倒置生物显微镜 d 1 自动蒸汽灭菌锅 d h g - 9 0 2 3 a 电热恒温鼓风干燥箱 p h s - 2 5 型p h 计 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 s 卸y oe i e c t r i cc o ，l t d b e c 般呦nc o u l t e r ，l i i c n e wb n m s w i c ks c i e n t i f i cc 0 m a r t mc 晡s tg e 丘i e r t r o c k n i i g s 锄l a g e ng m b h s h i m a d z u 苏净集团安泰公司 上海长方光学仪器有限公司 北京发恩科贸有限公司 上海精宏实验设备有限公司 上海雷磁仪器厂 2 1 3 微藻的培养 接种前，为防止藻种污染，培养用的工具与器皿都经过严格的灭菌。将培养至对数生 长期的微藻予m l e g mx - 2 2 r 离心机中离心，弃去上清液后，在浓缩藻液中加入少量新鲜 培养基，混匀后量取一定量的藻液转接至新鲜配置的培养基，并通过测定其吸光值来调控 其初始接种密度。将新鲜藻液置于光照培养箱中静置培养，光暗周期为1 2 h ：1 2 h ，每天振 摇3 4 次，培养温度与光照强度依据2 1 6 设置。同时，定期采用倒置生物显微镜进行观 测，以确定微藻是否正常生长以及有无杂菌污染等。 2 1 4 微藻生物量的测定方法 l 细胞干重法 取6 m l 藻液置于已预恒重的1 0 i n l 离心管中，5 0 0 0 晌血离心3 血，弃去上清液，将 离心管敞口置于烘箱中，8 0 烘干至恒重，称量，做3 个重复，取平均值。 2 浊度法 采用紫外可见分光光度仪测定微藻溶液在5 4 0 眦处的吸光值( o d 5 4 0 ) 。用移液枪移取 3 l i l l 待测藻液于l c m 的比色皿中，以去离子水为参比样测定其在5 4 0 眦处的吸光值，通 过测定其每天的吸光值来绘制微藻的生长曲线，并对其生长情况作出评价。 3 比生长速率的计算 比生长速率用来评价微藻的日生长情况及平均比生长速率，即其在一定时期内的总体 生长情况。该指标的计算以浊度法测定的吸光值为基