（发酵工程专业论文）根霉液体发酵生产碱性果胶酶及应用研究.pdf

摘要 摘要 纺织工业中，棉织物生物精练代替传统的碱煮炼具有环保、节能等优点，碱性果胶 酶是生物精练中主要的酶制剂。目前碱性果胶酶多由细菌、放线菌产生，而根霉产碱性 果胶酶尚未见任何报道。本论文对新发现可产碱性果胶酶的根霉g z 1 1 进行了液体发酵 产酶研究，优化了培养条件，研究了碱性果胶酶的酶学性质，并试验了该酶在棉织物生 物精练中的应用效果。 通过测定不同培养时间聚半乳糖醛酸酶p g 、聚半乳糖醛酸裂解酶p g l 、菌体干重 及发酵液残糖，确定发酵周期为4d 。根霉g z 1 1 产碱性果胶酶的摇床培养条件为：种 龄2 0h ，接种量6 ，培养温度2 8 ，摇床转速1 6 0r m i n ，p g 初始p h 4 0 ，p g l 初始 p h 5 0 ，装液量5 0m l 2 5 0m l 。在此发酵条件下，通过单因素和l i 8 ( 3 5 ) 正交试验得到该 菌株摇瓶液体发酵的最佳培养基组成为( g l ) ：橘皮粉2 0 0 ，可溶性淀粉10 0 ，硫酸铵 2 0 0 ，麸皮4 5 0 ，c a 2 十o 3 3 ，t w e e n 一8 02 5 ，k 2 h p 0 44 0 ，k h 2 p 0 44 0 。优化后p g 酶活 力为1 5 9 2 8 万i u m l ，p g l 酶活力为2 0 6 5i u m l ，比发酵基础培养基分别提高了3 4 9 8 和6 2 2 1 。 对根霉碱性果胶酶酶学性质进行了研究：p g 、p g l 的最适p h 分别为8 6 和9 4 ， 最适反应温度分别为5 0 和4 5 。p g 在温度低于5 0 ，p h 4 0 9 4 的环境中可以较 好的保持酶活力；p g l 在温度低于4 5 ，p h 5 0 1 1 o 的环境中可以较好的保持酶活力。 n a + 和c a 2 + 对酶有一定的激活作用，k + 、z n 2 + 、m g z + 和h 9 2 + 对酶有一定的抑制作用。 通过单因素和正交试验得出p g l 的最佳稳定剂配方为：糊精5 ，e d t a 2 ，乙二醇 3 ，乙酸钠2 。在酶液中加入此复合稳定剂后，p g l 的酶活残留率比不加入稳定剂高 出6 7 3 5 。 通过单因素试验，得出自制碱性果胶酶处理棉织物的最佳精练条件为：棉织物沸水 预处理1 0m i n ，p g l 添加量1 2 0 0i u l ，精练浴p h 8 6 ，精练时间4 0m i n ，精练温度6 0 。 在此精练条件下，添加复合稳定剂后，棉织物毛效和失重率分别提高了1 1 0 9 5 和 1 2 9 6 6 。用自制碱性果胶酶处理后棉织物的失重率、毛效与诺维信公司s c o u r z y m e3 0 1 l 产品处理后的失重率、毛效相接近，基本上达到常规碱精练工艺的要求，手感较柔软， 表面光滑。 关键词：根霉；碱性果胶酶；液体发酵；生物精练；稳定剂 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt e x t i l ei n d u s t r y , b i o s c o u r i n go fc o t t o nf a b r i c sh a sr e p l a c e dt r a d i t i o n a la l k a l i n es c o u r i n g d u i n gt oi t se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na n de n e r g ys a v i n g t h ea l k a l i n ep e c t i n a s ei st h em a i n e n z y m ep r e p a r a t i o ni nb i o s c o u r i n g a tp r e s e n t ，t h ea l k a l i n ep e c t i n a s ei sp r o d u c e db yb a c t e r i a a n da c t i n o m y c e sm o s t l y i th a sn o tr e p o r t e dt h a tr h i z o p u ss p p r o d u c e sa l k a l i n ep e c t i n a s e r h i z o p u sg z 1 1 p r o d u c i n ga l k a l i n ep e c t i n a s eh a db e e nf o u n d t h ec u l t u r ec o n d i t i o n sa n d e n z y m a t i cp r o p e r t i e s w e r es t u d i e d i t s a p p l i c a t i o nw a st e s t e d i nt e x t i l ei n d u s t r y f o r b i o s c o u d n go ft h ec o t t o nf a b r i c w i t ht h ee n z y m a t i ca c t i v i t y , b i o m a s sa n dr e s i d u ls u g a ra si n d e x e s ，4d a y sw a sc h o s e na s t h ef e r m e n t a t i o np e r i o d t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：s e e da g e2 0h ，t h e i n i t i a lp ho fp ga n dp g l4 0a n d5 0s e p a r a t e l y , t h ec u l t u r et e m p e r a t u r e2 8 ，t h ei n o c u l u m s i z e6 ，v o l u m eo fm e d i u m5 0m l 2 5 0m l ，t h es p e e do fs h a k e r16 0r m i n ，c u l t u r i n g9 6h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h eo p t i m a lm e d i u mi n g r e d i e n t so ft h i ss t r a i nw e r es t u d i e db ys i n g l e f a c t o rt e s ta n dl i s ( 3 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u mw a s d e t e r m i n e d ( g l ) ：o r a n g ep e e lp o w e r2 0 0 ，s o l u b l es t a r c h10 0 ，( n h 4 ) 2 8 0 42 0 0 ，w h e a tb r a n 4 5 0 ，c 一+ 0 3 3 ，t w e e n - 8 02 5 ，k 2 h p 0 44 0 ，k h 2 p 0 44 0 u n d e rt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，t h eh i g h e s ty i e l d so fp ga n dp g l r e a c h e d1 5 9 3m i l l i o ni u m la n d2 0 6 5i u m l ， w h i c hi n c r e a s e db y3 4 9 8 a n d6 2 21 r e s p e c t i v e l y t h ec r u d ea l k a l i n ep e c t i n a s ep r o p e r t i e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mp h ，t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dt h es t a b l ep hr a n g eo fp gw e r e8 6 5 0 a n d4 0 - 9 4r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mp h ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dt h es t a b l ep hr a n g eo fp g lw e r e9 4 ，4 5 ， a n d5 0 11 0r e s p e c t i v e l y t h et h e r m a ls t a b i l i t yw a ss t u d i e d ，w h e nt h et e m p e r a t u r ew a su n d e r 5 0 f o rp ga n du n d e r4 5 f o rp g l t h e yc o u l ds t a ys t e a d y i n f l u e n c e so ne n z y m a t i c a c t i v i t yo fm a n yk i n d so fi o n sw e r ea l s os t u d i e d n a + a n dc a 2 + c o u l dp r o m o t e dt h e i rc a t a l y t i c a c t i v i t ys i g n i f i c a n t l y , w h i l ek + ，z n 2 + ，m 9 2 + a n dh 9 2 + r e s t r a i n e dt h e i ra c t i v i t y t h eo p t i m a ls t a b i l i z e rr e c i p eo fp g lw a ss t u d i e db ys i n g l ef a c t o rt e s ta n dl 9 ( 3 耳) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ：d e x t r i n5 ，e d t a2 ，e t h y l e n eg l y c o l3 ，s o d i u ma c e t a t e2 t h e r e s i d u a lr a t eo fp g la c t i v i t y 诵t hs t a b i l i z e rw a s6 7 3 5 h i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p t h eo p t i m a lc o n d i t i o n st h a tr e f i n e dt h ec o t t o nf a b r i cu s i n gc r u d ep e c t i n a s ew e r es t u d i e d b ys i n g l ef a c t o rt e s t ：t h et i m eo fb o i l i n gw a t e rp r e t r e a t m e n t10m i n ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n 12 0 0i u l ，p ho fs c o u t i n gb a t h8 6 ，s c o u r i n gt i m e4 0m i n ，s c o u r i n gt e m p e r a t u r e6 0 t h e c a p i l l a r ye f f e c ta n dw e i g h t - l o s sr a t i oi m p r o v e d110 9 5 a n d12 9 6 6 r e s p e c t i v e l yw h e nt h e s t a b i l i z e rw a sa d d e d c o m p a r i n gt ot h es c o u r z y m e3 01lo fn o v o z y m e s ，t h ew e i g h t - l o s sr a t i o a n dc a p i l l a r ye f f e c to ft h ec o t t o nf a b r i cw e r ec l o s ea n dc o u l dr e a c ht h ec o n v e n t i o n a ls t a n d a r d o fa l k a l i n es c o u r i n gc r a f t t h e s ec o t t o nf a b r i cw h i c hw e r er e f i n e db yc r u d ea l k a l i n ep e c t i n a s e 1 1 i a b s t r a c t m a d ei n0 1 1 1 l a bh a ds o f t e rh a n d l ea n ds m o o t hs u r f a c e k e yw o r d s ：r h i z o p u s ；a l k a l i n ep e c t i n a s e ；s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ；b i o s c o u r i n g ；s t a b i l i z e r i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使周过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日 期： 远巡兰 一 一 第一章绪论 第一章绪论 果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称，是一种复合酶。果胶酶分为酸性果胶酶和碱 性果胶酶两种，碱性果胶酶是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，目前广泛用于织 物处理、植物纤维脱胶、造纸、纯化植物病毒等方面【i j 。 生物酶制剂在工业中的应用越来越广泛，其污染小、耗能低已成为环保时代工业急 需的产品。碱性果胶酶在纺织业上的应用也逐渐代替了传统的碱精练，碱性果胶酶作为 精练工艺中的重要酶制剂，越来越受到人们的关注。 1 2 国内外研究现状 果胶酶的研究应用始于二十世纪三十年代，而工业化生产始于二十世纪五十年代， 迄今已有七十多年的历史。果胶酶具有广泛的微生物来源，细菌1 2 3 1 、放线菌4 1 、真菌【5 7 】 都可以产果胶酶。而产碱性果胶酶的菌种却为数不多，仅嗜碱芽孢杆菌【8 l ( b a c i l l u ss p ) 、 放线菌( a c t i n o m y c e ss p ) 【4 j 、枯草芽孢杆 翥 g ) ( b a c i l l u ss u b t i l i ss p ) 、螺孢菌( s p i r i l l o s p o r a s p p ) 0 0 l 及假单胞菌( 体e “如m o 阳ss p ) 1j 等几种。产碱性果胶酶的的真菌更是罕见，仅有 用p i c h i ap a s t o r i ss p 生产碱性果胶酶的报道【1 2 j 。1 9 7 2 年，k o k ih o r i k o s h i t l 3 】第一次用嗜 碱细菌制得了碱性果胶酶。此后相继有报道，从各种不同的环境中筛选出了产碱性果胶 酶的嗜碱菌，其中，j u n w e ic a o 1 4 j 等人分离出的嗜碱细菌n t t 3 3 所产的碱性果胶酶就具 有较好的苎麻脱胶的效果。 1 9 9 9 年丹麦n o v o z y m e s 公司推出了商品化的碱性果胶酶b i o p r e p3 0 0 0 l 。2 0 0 3 年他们 又推出基因改造微生物b a c i l l u s 的深层发酵产品碱性果胶裂解酶s c o u r z y m el 。碱性果胶 酶的问世，使其大规模的应用于工业生产，特别是纺织工业上，其应用效果也为各国研 究者所证实【l 勉6 。从近几年的文献报道来看，目前世界各国大多数都将碱性果胶酶用于 棉织物的精练上。e t t e r s i l5 j 对碱性果胶酶在棉织物精练工艺中的应用做了大量工作，发 现经碱性果胶酶精练后，棉织物的毛效稍高于传统碱精练；天津科技大学的刘曦【27 】等用 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l 西) t c c c l1 2 8 6 发酵产碱性果胶酶，响应面法优化了培养基， 最终p g l 酶活为1 4 8 2i u m l ；江南大学的刘慧娟瞵j 等用芽孢杆菌b a c i l l u ss p w s h b 0 4 2 0 2 产碱性果胶酶，采用温度控制策略使p g l 酶活力达到5 3 0i u m l ；y u nw a n g 1 2 1 等将p i c h i a p a s t o r i sg s l1 5 所产碱性果胶酶作为模型来研究提高外源蛋白的机制和策略，并通过在分 批发酵中控制甲醇浓度来提高p g l 产量，最终p g l 酶活达至1 j 4 3 0i u m l ；s o n i aa h l a w a t 9 】 等对b a c i l l u ss u b t i l i ss s 产碱性果胶酶的条件进行了优化，发现t w e e n 2 0 对产酶有很大的 促进作用，当浓度为0 3 时p g l 酶活为3 8 1i u m l 。确定了精练工艺：酶用量5u g ，处 理时间1 2 0r a i n ，p h 9 5 ，温度6 5 。研究了e d t a 及润湿剂对失重率的影响，在最优条 江南人学硕十学位论文 件下对棉织物进行精练，精练后棉织物的白度、拉伸强度和韧性比传统碱精练分别高出 1 6 、1 2 和3 0 。 目前，国内外研究碱性果胶酶时采用的菌种比较单一，用于工业化生产的多为细菌， 尚未见用根霉生产碱性果胶酶的报道。本文采用新发现根霉菌进行液体发酵产碱性果胶 酶的试验，研究了酶学性质并试验了其在棉织物精练中的应用，确定了自制碱性果胶酶 处理棉织物的工艺条件，为工业用碱性果胶酶提供了新的来源。 1 3 果胶酶分类及作用机理 通常情况下，可根据下列标准对果胶酶进行分类：( 1 ) 果胶、果胶酸或低聚半乳糖醛 酸是否为其优先底物；( 2 ) 果胶酶对底物作用是通过反式消去还是通过水解；( 3 ) 果胶酶 作用于底物的切割方式是任意的( 内切酶) 还是发生在末端方向的( 外切酶) ；( 4 ) 果胶酶的 最适作用p h 是酸性的还是碱性的【2 引。 根据上述分类方法可以将果胶酶大致分为以下三类： 1 果胶酯酶( p e c t i n e s t e r a s e ，p e ) 果胶酯酶即羧酸酯水解酶，系统分类名为p e c t i n p e c t y l h y d r o l a s e ( e c 3 1 1 1 1 ) 。它可 随机切除甲酯化果胶中的甲基，产生甲醇和游离羧基。p e 对果胶的去酯化过程是沿底 物分子线性进行的，这被称作单链机带l j ( s i n g l e c h a i nm e c h a n i s m ) 。通常酶的去酯化作用 不能进行完全，当酯化度大于1 0 时酯化作用就会停止。p e 对于果胶溶液的粘度几乎 没有影响。去酯化的果胶通过钙桥发生相互作用，为聚半乳糖醛酸酶( p g ) 、聚半乳糖醛 酸裂解酶( p g l ) 等其它果胶酶的作用创造条件。 2 果胶解聚酶( d e p o l y m e r i z i n ge n z y m e s ) 根据对底物的作用方式是反式消去还是水解，又将果胶解聚酶分为果胶水解酶和果 胶裂解酶两种。果胶水解酶又称为聚半乳糖醛酸酶，果胶裂解酶又称聚半乳糖醛酸裂解 酶。 聚半乳糖醛酸酶专一性水解底物的糖苷键，又分为内切聚半乳糖醛酸酶和外切聚半 乳糖醛酸酶，其作用机理如图1 1 【2 9 j 所示： h o c o 嘲 图1 - 1 果胶水解酶作用方式示意图 f i g 1 1t h es k e t c hm a po fp o l y g a l a c t u r o n a s ea c t i o nm a n n e r 聚半乳糖醛酸裂解酶通过反式消去作用切割伍一1 ，4 糖苷键，在半乳糖醛酸的非还原 2 第一章绪论 末端形成c 4 和c 5 不饱和键，又可分为内切聚半乳糖醛酸裂解酶和外切聚半乳糖醛酸裂 解酶两种，其作用机理如图1 - 2 3 0 1 所示： h h o c o 加o i o o h oh+ 图1 2 果胶裂解酶作用方式示意图 f i g 1 2t h es k e t c hm a po fp o l y g a l a c t u r o n a t el y a s ea c t i o nm f a r l e r 3 原果胶酶( p r o t o p e c t i n a s e ，p p a s e ) 催化不溶性原果胶分解出游离水溶性果胶质的酶的总称。 1 4 果胶酶的应用 根据果胶酶最适作用p h 的不同，将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶两种。酸 性果胶酶主要应用于食品行业特别是果汁果酒的加工业，近年来也不断开发了新的用 途。酸性果胶酶的用途主要包括：1 果汁果酒澄清，果胶酶可以降低果汁粘度，使果汁 易于处理而且透明澄清。用于果酒处理，可避免失光和出现混浊，从而保持果酒的稳定 性。果胶酶还可保持果粒的完整性。2 果蔬汁提取，果胶酶有助于提高水果在压榨过程 中的出汁率。3 水果和蔬菜的浸解、液化，生产单细胞果汁和菜汁。4 果实脱皮，含有 纤维素酶和半纤维素酶的粗果胶酶制剂能作用于果实皮层，使细胞分解而脱落。5 木材 防腐。6 麻类脱胶【3 1 1 。7 棉织物精练加工。 碱性果胶酶主要应用在以下几个行业中： 1 4 i 食品行业 1 4 1 1 茶叶和咖啡发酵 碱性果胶酶在咖啡发酵的过程中可除去咖啡豆的黏表皮，也可以用于茶叶的加工， 在茶叶中加入适量的碱性果胶酶可促进茶叶的发酵，它还可通过破坏茶叶中的果胶物质 来改善速溶茶粉在冲泡过程中形成泡沫的性能p 引。 1 4 1 2 榨油 在橄榄油榨制时加入碱性果胶酶，就可破坏起乳化作用的果胶从而提高油的收率， 而且榨出的油贮存时也非常稳定，多酚类物质和v e 含量也有所增加【3 3 】。 1 4 1 3 诱导织物抗病的绿色食品生产 自2 0 世纪9 0 年代以来，碱性果胶酶作为参与诱导植物自身防御系统的有效酶制剂已 引起人们的极大关注。碱性果胶酶诱导植物抗病的机理是：碱性果胶酶可降解寄主组织 的果胶质产生寡聚糖片段，这些寡聚糖片段是内源激发子，可以与植物细胞膜上的“受 江南大学硕士学位论文 体( 一种结合蛋白) 结合，产生激发植物防卫反应的信号【3 4 】。用碱性果胶酶作为新型生 防农药具有以下优点：对人畜无害，不污染环境，不伤害天敌，病原物不会产生抗药性， 用量低。因此碱性果胶酶有望开发为一类很有潜力的无公害生防农药【3 5 】。 1 4 2 纺织行业 1 4 2 1 棉纤维的生物精练 t s a k a i l 3 6 l 等人发现碱性果胶酶可使原果胶水解成为可溶于水的高聚合度的果胶分 子，从而开发出一种针对棉织物精练的生物化学工艺，称之为生物精练( b i o s c o u r i n g ) 。 棉花纤维表皮细胞上含果胶质层，它是影响纤维吸水性的重要因素之一。因此在棉织物 精练工艺中，果胶质及其他一些杂质是主要的处理对象。碱性果胶酶可使棉纤维上的果 胶物质水解，而非纤维素类的杂质被分散或乳化于煮炼浴中，从而增强其润湿性而不会 像纤维素酶那样攻击棉纤维素而降低棉纤维的强度【37 1 。传统的印染前处理工艺是在高温 和烧碱的共同作用下完成的。由于碱精练过程中使用了大量的烧碱和表面活性剂，若不 严格控制，棉纤维会因形成氧化纤维素而遭到损伤。另一方面，棉纤维表面因去除了大 量起润滑作用的蜡质而失去应有的手感。并且处理后需要用大量的酸中和，用大量的水 清洗，因此，该工艺用水量大，能耗高，耗时长，废液中c o d 值很高，是一种非环保型 的加工工艺。作为棉织物生物精练过程中至关重要的酶制剂【3 引，碱性果胶酶的研制及其 在棉织物精练中的应用，使一种全新温和的环保型精练方式成为可能。生物精练利用碱 性果胶酶的专一性，有效分解并去除在棉纤维表面对棉蜡等疏水性共生物起黏结作用的 果胶质，使疏水性物质从棉纤维表面脱落，而纤维本身却不受到损伤。因此，经生物精 练的棉纤维能最大程度地保持纤维强度、失重小【3 9 1 、织物手感柔软厚实、且富有弹性。 1 4 2 2 植物韧皮纤维脱胶 目前碱性果胶酶在麻类植物的脱胶工艺中得到了有效应用并越来越受到重视。麻类 纤维是非常优良的纺织品原料，但是这些纤维中除了含有纤维素外还含有2 0 3 0 的果 胶质。脱胶就是从植物纤维中除去有黏性的非纤维物质。传统的脱胶工艺能耗高，排放 大量有毒物质严重污染环境，且损害部分纤维，对其质量造成一定影响m 。采用微生物 和酶脱胶可以克服以上缺点。用碱性果胶酶处理可以有效快速除去与纤维粘着的胶类物 质，且不损害麻类纤维【4 1 1 。 1 4 3 造纸行业 在热磨机械纸浆过程中，从真叶木原料中释放出来的溶解性的胶体物质主要是溶解 性阴离子多糖( 果胶或聚半乳糖醛酸) ，在造纸过程中会严重影响过滤，需要添加大量的 阳离子聚合物来消除其危害。纸浆中的聚半乳糖醛酸与阳离子聚合物的结合能力与其聚 合度有关，聚合度小于3 时消耗阳离子不明显，聚合度大于6 时则会大量消耗阳离子。碱 性果胶酶可以将果胶或聚半乳糖醛酸降解，减少阳离子聚合物的消耗量，提高纸浆的质 量【4 2 1 。 4 第一章绪论 1 4 4 环境领域 在柑橘加工和蔬菜加工过程中会产生大量含果胶的废水，若在废水中加入碱性果胶 酶或产碱性果胶酶的微生物，就可以分解废水中的果胶，再用活性淤泥处理。这种方法 成本低，效果好且不产生二次污染【4 3 1 。 1 4 5 其他领域 碱性果胶酶还可用于纯化植物病毒、饲料添加剂以及洗涤剂中。 1 5 立题背景和意义 随着环境的恶化，生态平衡的失调，人们越来越重视环境对于人类生活及生命的影 响。人们对于环境健康的认识，使得人们的环保意识越来越强。许多国家政府为保护本 国公民的身体健康，陆续颁布法规法令，从法律上限量或禁止用于纺织品中的有毒有害 物质。因此利用酶法进行生物精练就成为实现绿色纺织品生产的趋势之一。 传统纺织工业碱精练的时代已经不再符合人们对于保护环境，节约能源的要求。生 物酶作为一种环境友好的生物催化剂，用于印染工业受到了人们广泛的关注和欢迎。目 前，国内市场多采用1 9 9 9 年诺维信公司推出的碱性果胶酶b i o p r e p3 0 0 0 l 或以该碱性果胶 酶为主体的复配酶n n s c o u r z y m e3 0 1 l i 删，国内尚无商品化的同类产品。采用生物酶代 替烧碱的酶精练工艺近年来受到国内外的普遍关注，并显示出很好的应用前景。酶精练 具有作用条件温和、耗水量低、排放废水的c o d 值低、棉纤维损伤小等优点，是一种节 能降耗、无污染的纺织清洁生产工艺。因此，研究开发适用于棉针织物酶精练加工的国 产碱性果胶酶具有重要的现实意义。本论文以新发现产酶菌株g z 1 1 发酵产生的碱性果 胶酶为研究对象，通过单因素试验确定了精练工艺，为实现该碱性果胶酶的工业化应用 提供一定的依据。 1 6 课题研究的内容 1 、根霉碱性果胶酶的液体发酵条件的优化； 2 、根霉碱性果胶酶酶学性质的研究； 3 、根霉碱性果胶酶的应用稳定性的研究。 4 、通过单因素法，研究了根霉碱性果胶酶精练棉织物的工艺条件； 第二章材料与方法 2 1 材料 第二章材料与方法 2 1 1 菌种 根霉( r h i z o p u ss p ) g z 1 1 ，由本实验室分离保藏。 2 1 2 培养基 2 1 2 1 活化( 保藏) 培养基( g l ) ：土豆2 0 0 、葡萄糖2 0 o 、琼脂粉2 0 0 。 2 1 2 2 筛选培养基( l ) ：果胶3 0 0 、n a n 0 33 0 、k 2 h p 0 4 3 h 2 03 3 、k c l0 5 、m g s 0 40 2 4 、 f e s 0 40 0 1 、( n i - h ) 2 s 0 42 0 0 、c a c l 2o 15 、k h 2 p 0 43 8 、琼脂粉2 0 0 、溴酚蓝0 2 。 2 1 2 3 种子培养基( g l ) - 豆粕粉2 0 0 、k h 2 p 0 44 0 、k 2 h p 0 44 0 。 2 1 2 4 发酵基础培养基( g l ) ：橘皮粉3 0 0 、麸皮6 0 0 、( n h 4 ) 2 8 0 42 0 0 、k h 2 p 0 4 4 0 、 k 2 h p 0 44 0 。 2 1 3 试剂 本实验所用试剂名称及详细信息列于表2 1 ： 表2 1实验试剂一览表 t a b 2 1e x p e r i m e n t a lr e a g e n t s 7 江南大学硕十学位论文 8 第_ 二章材料与方法 2 1 4 仪器 本实验所用仪器名称及详细信息列于表2 2 ： 表2 - 2 实验设备一览表 t a b 2 - 2e x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t s i n s t r u m e n t sm a n u f a c t u r e r c r 2 2 g 高速冷冻离心机 分析天平 u v 2 8 0 0 a h 紫外可见分光光度计 立式圆形压力蒸汽灭菌锅 1 0 1 a l 型电热鼓风干燥箱 电磁炉 移液枪 冰箱 超净工作台 台式离心机 恒温培养箱 s h z 2 2 水浴恒温振荡器 7 2 1 型分光光度计 h y g a 全温摇瓶柜 p h 计 8 1 2 型磁力恒温搅拌器 y g ( b ) 8 7 1 型毛细管效应测试仪 h h 4 数显恒温水浴锅 日本日立 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海医用核子仪器厂 上海实验仪器有限公司 广州美的公司 上海手术器械厂 海尔公司 苏州净化设备厂 上海安亭科学仪器厂 上海市跃进医疗器械一厂 江苏省太仓市医疗器械厂 上海第三仪器厂 江苏太仓市实验设备厂 北京h a n n a 公司 上海曹县行无线电元件厂 温州大革纺织仪器 金坛市富华仪器有限公司 2 2 试验方法 2 2 1 培养方法 2 2 1 1 斜面培养：将保藏在4 冰箱中的菌种接入斜面培养基，3 0 恒温箱中培养9 6h 。 2 2 1 2 种子培养：将己活化的斜面菌种接入种子培养基，装液量5 0m l 2 5 0m l ，旋转 式摇床转速1 6 0r r a i n ，2 8 ，震荡培养2 0h 。 2 2 1 3 摇瓶发酵培养：种子以6 ( v v ) 的接种量接入发酵基础培养基中，旋转式摇床转 速1 6 0r m i n ，2 8 ，震荡培养9 6h 。无特别说明，装液量均为5 0m l 2 5 0m l 。 2 2 2 分析方法 2 2 2 1 碱性果胶酶粗酶液的制备 粗酶液的提取：将发酵液在4 ，6 0 0 0r r a i n 条件下离心1 0m i n ，取上清液作为粗酶 液供酶活测定用。 9 江南大学硕士学位论文 2 2 2 2 菌体干重测赳4 5 】：取5 0m l 发酵液于1 0 0 0 0r m i n 条件下离心5m i n ，弃上清，取菌 丝体用蒸馏水洗涤，菌丝于6 0 烘至恒重，称重。 2 2 2 3 果皮粉的制备：新鲜果皮6 0 烘干，掰成碎片，用粉碎机粉碎，经4 0 目筛后得 到的果皮粉末。 2 2 2 4 残糖测定：用d n s 法测残糖【46 。 2 2 2 5 碱性果胶酶活力测定方法 ( 1 ) 还原糖法测定碱性聚半乳糖醛酸酶( p g ) 的活性 1 d n s 试剂配制：参考文献1 47 j 的方法。 2 测定方法：具塞试管中加入粗酶稀释液0 2m l ，然后再加入p h 8 6 含0 4 果胶 的甘氨酸- n a o h ( 0 2m o l l ) 缓冲液1 0m l ，5 0 恒温水浴反应3 0m i n ，用1 5m l 的d n s 终止反应，沸水煮5m i n ，立即冷却，再加入5m l 的蒸馏水，摇匀，在5 4 0n m 处测定 其o d 值。对照：先加入粗酶稀释液0 2m l ，随后加入1 5m ld n s 将粗酶液灭活，然 后加入p h 8 6 含0 4 果胶的甘氨酸n a o h ( 0 2t o o l l ) 缓冲液1 0m l ，5 0 恒温水浴反应 3 0m i n ，沸水煮5m i n ，立即冷却，再加入5m l 的蒸馏水，摇匀，在5 4 0m 处测定其 0 d 值。 3 标准曲线的绘制 准确称量2 0 0m g 固体d 半乳糖醛酸，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到1 0 0m l 容量瓶中，再定容到刻度，摇匀，得到浓度为2m g j m l 的d 半乳糖醛酸标准液。在编 号为0 - 6 的具塞试管中，分别加入配制好的d 半乳糖醛酸标准液0 ，0 2 ，o 3 ，o 4 ，0 5 ， 0 6 ，0 7m l 然后用蒸馏水定容至1 2m l ，摇匀后加入1 5m l d n s 试剂，沸水中煮5m i n ， 冷却，加5m l 蒸馏水，于5 4 0 姗处比色，测定其吸光度值，绘制标准曲线。并得到标 准曲线方程：y = 2 6 4 2 9 x + 0 2 1 0 5 1 6 1 4 毫l 2 曹l 一08 删 繇0 6 争。 0 ，2 o 00 10 20 30 40 5 0 d 5 加值 图2 - 1d 一半乳糖醛酸标准曲线 f i g 2 - 1s t a n d a r d i z e dc h iv eo fd g a l a c t u r o n i ca c i d 4 一个标准酶活单位( ) 定义为：每分钟分解底物产生lp m o l 半乳糖醛酸所需的酶 量。 ( 2 ) 碱性果胶裂解酶( p g l ) 酶活测定 反应体系为：粗酶稀释液2 0 此，含0 4 的聚半乳糖醛酸的甘氨酸n a o h ( 0 2m o l l ) 缓冲液( p h 9 4 ，含有0 5m m o l l 的c a c l 2 ) 2 0m l ，以无活性的酶液作为对照，以含底物 1 0 第二二章材料与方法 的缓冲溶液的加入起动酶促反应。 反应条件为：4 5 ，反应1 5r a i n ，用3m l 0 0 3m o l l 的磷酸终止反应，在2 3 5n n l 处测定其吸光度值【4 引。 一个标准酶活单位6 u ) 定义为：每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生li x m o l 的不饱和聚 半乳糖醛酸的酶量。 果胶裂解酶酶活计算公式： o d 2 1 e 10 d i l u t i o 疗 f a c t o rxv o l u m eo fm i x t u r e e n z y m ea c t l v l l v ：= - ；! ：二二：- - 一 。 t 4 6 0 0 b v o l u m eo f e n z y m ep r e p a r a t i o n 式中：4 6 0 0 ( l m 0 1 - 1 c m 。1 _ 卜不饱和聚半乳糖醛酸在2 3 5n m 处的摩尔吸光系数【4 9 】 t ( m i n ) - - 酶促反应时间( 在酶反应的线性范围内) b ( c m ) - - 比色皿厚度 2 2 2 6p g 最适温度 将一定稀释倍数的粗酶液分别在3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 恒温水 浴条件下反应，反应结束后测p g 酶活，以确定p g 的最适作用温度。 2 2 2 7p g l 最适温度 将一定稀释倍数的粗酶液分别在3 0 ，3 5 ，4 0 ，4 5 ，5 0 ，6 0 恒温水 浴条件下反应，反应结束后测p g l 酶活，以确定p g l 的最适作用温度。 2 2 2 8p g 的温度稳定性 将一定稀释倍数的粗酶液按2 2 2 4 所述方法分别在最适温度下测出酶活力，并以此 为相对酶活力1 0 0 计。然后将粗酶液分别在3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 的水浴下保温， 每隔一定时间取出，在最适温度下测定酶活力，并算出保温不同时间后的相对酶活。 2 2 2 9p g l 的温度稳定性 将一定稀释倍数的粗酶液按2 2 2 5 所述方法分别在最适温度下测出酶活力，并以此 为相对酶活力1 0 0 计。然后将此粗酶液分别在3 0 ，4 0 ，4 5 ，5 0 的温度下保 温，每隔一定时间取出，在最适温度下测酶活力，并算出保温不同时间后的相对酶活。 2 2 2 1 0 根霉碱性果胶酶的最适p h 分别用p h 4 0 1 0 6 的缓冲溶液配制含0 4 底物的溶液，用对应p h 的缓冲溶液将 粗酶液稀释到适当倍数，在最适作用温度下按2 2 2 4 所述方法测p g 、p g l 酶活。酸性 缓冲溶液为柠檬酸磷酸氢二钠，碱性缓冲溶液为甘氨酸一n a o h ( 0 2t o o l l ) 。 2 2 2 1 1 根霉碱性果胶酶的p h 稳定性 将粗酶液在最适温度、最适p h 下测得的酶活力计为相对酶活力1 0 0 。常温下将此 粗酶液分别在不同p h 值的缓冲液中放置2 4h ，稀释一定倍数然后按2 2 2 4 所述方法测酶 活，算出不同p h 缓冲溶液下放置2 4h 后p g 和p g l 的相对酶活力。 2 2 2 1 2 织物失重率的测定 将精练前后的棉织物分别在烘箱中以1 0 5 烘干至恒重，然后称量。质量分别计为 m l 和m 2 。 织物失重率= ( m l m 2 ) m l x l 0 0 江南大学硕士学位论文 2 2 2 1 3 毛效的测定 毛效是毛细管效应( c a p i l l a r ye f f e c t ) 的简称，是衡量纺织品润湿性或亲水性的指标。 它测量在一定时间内液面在织物上达到的高度。 按标准定时法( 3 0m i n ) i 贝w 定毛效。织物的毛细管效应的测定方法：打开毛细管效应 测试仪预热至2 5 ，将规格为经3 0c m ，纬5c m 的棉织物固定在毛细管效应测试仪上。 在棉织物的下端1c m 处各划一条直线，调节毛细管效应测试仪使液亟刚好浸没所划直 线，3 0m i n 后测量织物上液面上升的高度。 2 2 2 1 4 酶稳定性的测定 将添加不同种类、不同浓度稳定剂的酶液，在p h 8 6 ，6 0 温度下保温lh 后，立 即用冷水冷却，稀释至适宜倍数，测其酶活。以不加稳定剂的酶液作对照，分别计算酶 活残留率。 酶活残留率= ( 保温前的酶活力损失的酶活力) 保温前的酶活力1 0 0 2 2 3 处理工艺 2 2 3 1 碱性果胶酶精练工艺 工艺流程【5 0 】：预处理( 沸水煮1 0m i n ) 一果胶酶精练一酶失活( 沸水煮2m i n ) 一水洗( 去 离子水洗2 次) 一1 0 5 下烘干 2 2 3 2 碱精练工艺 工艺流程【4 8 】：碱精练( 氢氧化钠4g l ，表面活性剂德比度g y0 5g l ，浴比1 ：3 0 ， 温度9 5 ，时间4 0m i n ) - - - 8 0 热水洗1 次- - 6 0 热水洗1 次一冷水洗2 次一1 0 5 下 烘干 1 2 第三章结果与讨论 3 1 发酵条件优化 第三章结果与讨论 3 1 1 发酵周期的确定 以发酵基础培养基为培养基进行摇床培养，1d 取样一次沏, o p g 酶活力，p g l 酶活力、 发酵液残糖及菌体量，结果如图3 1 和3 2 所示： 时间( d ) 噎一p g 酶活( 万i u m l )+ p o l 酶活( i u m l ) 图3 1 不同时间的p g 和p g l 酶活 f i g 3 - 1t h ee n z y m ea c t i v i t yo fp ga n dp g