（遗传学专业论文）酵母双杂交系统筛选与myosin+Ⅹ相互作用的蛋白质.pdf

y 乏 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取 得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文 中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：主l 亟退 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编本学位 论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：乏覃也虹旦 指导教师签名： 日 期：这业：z e t 期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： *7 -一 酵母 度、相对 技术在研 肌球 部的m y t h 4 和f e r m 结构域可与多种功能蛋白相结合。这些蛋白与丝足的形成、神经 元的突起生长与投射、内皮细胞的迁移、细胞的粘附及有丝分裂中纺锤体的形成等过程 密切相关。因此m y 0x 在脊椎动物细胞中发挥了重要作用。 为了进一步深入的研究m y 0x 在脊椎动物体内的作用，本研究利用酵母双杂交技 术，以m y ox 的尾部结构域中的m y t h 4 和f e r m 结构为诱饵，对人胎脑c d n a 文库 进行了筛选。实验经l e u 、t r p 、h i s 、a d e 四种氨基酸营养缺陷型培养基筛选以及b 半 乳糖苷酶活性分析，共获得1 1 2 个阳性克隆，经过反复传代四种氨基酸营养缺陷型培养 基筛选和b 半乳糖苷酶活性分析，去除一个酵母菌株中含有两个c d n a 文库质粒的可 能，再经过回交实验验证，最大程度的保证了酵母双杂交结果的准确性。从酵母菌株中 提取质粒，转入大肠杆菌中，以氨苄青霉素( a m p ) 抗性筛选靶质粒，对部分阳性克隆 的插入片段进行测序，在g e n eb a n k 进行比对后分类，从分类结果可知与m y ox 相 互作用的蛋白涉及参与细胞迁移蛋白、细胞骨架蛋白、参与物质运输蛋白、参与基因表 达调节的蛋白、参与信号转导蛋白等，为深入了解m y 0x 在生理上的新功能奠定基础。 关键词：蛋白质相互作用；细胞迁移：细胞周期；酵母双杂交；m y 0 x i-f f | a bs t r a c t y e a s tt w o - h y b r i ds y s t e mi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm e t h o d st os t u d yp r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n t h es y s t e mi ss e n s i t i v e ，s i m p l ea n dr a p i d ，w h i c ht h es e q u e n c eo ft a r g e tp r o t e i n s c a nb eo b t a i n e dd i r e c t l y f o rt h el a s tf e wy e a l s y e a s tt w o h y b r i ds y s t e mi su s e dt os t u d y p r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n s c r e e nt h en o v e lp r o t e i n sa n ds t u d yt h ef u n c t i o no fp r o t e i n m y o s i nxi so n eo ft h em e m b e r si nu n c o n v e n t i o n a lm y o s i ns u p e r - f a m i l ya n de x p r e s s e s a tl o wc o n c e n t r a t i o n si nm o s tv e r t e b r a t e ，w h i c hi sr e l a t i v et of i l o p o d i a lf o r m a t i o n ，n e u r o n a l g r o w t h ，c e l lm i g r a t i o n ，c e l la d h e s i o na n dt h es p i n d l ef o r m a t i o no fm i t o s i s i nt h i ss t u d y ，y e a s t t w o h y b r i dt e c h n i q u ew a su s e dt oi d e n t i f yp r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t hm y 0x h e r e ，t h em y t h 4 d o m m na n df e i 蝴d o m a i no fm v oxt a i la r eab a i tt os c r e e nt h eh u m a nf e t a lb r a i ne d n a l i b r a r y p l a t i n gt h ec e l l so ns dw i t h o mh i s t i d i n e ，t r y p t o p h a n ，l e u c i n ea n da d e n i n et oa s s a yt h e c o t r a n s f o r m a n t st oe x p r e s st h er e p o r tg e n e sa n dd e t e c tt h ee x p r e s s i o no fl a cz g e n e at o t a lo f 112p o s i t i v ec l o n e sw e r eo b t a i n e d ，t h e n ，t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r ec u l t u r e di ns dm e d i u m w i t h o mh i s t i d i n e ，t r y p t o p h a n ，l e u c i n ea n da d e n i n ef i v et i m e st or e m o v et h ef a l s ec l o n e s t h e b a c k c r o s se x p e r i m e n tw a se m p l o y e dt oe n s u r et h er e s u l t s t h ep l a s m i dw a se x t r a c t e df r o m y e a s t a n dt h e ni tw a st r a n s f o r m e di n t oec o l ia n dt h et a r g e tp l a s m i dw a so b t a i n e db y s e l e c t i v ec u l t u r e t h ee d n as e g m e n to ft h ep o s i t i v ec l o n e sw e r es e q u e n c e da n dc o m p a r e d w i t t lg e n eb a n k t h ep r o t e i n ss c r e e n e di nt h i ss t u d yw e r ep r o b a b l yi n v o l v e di nc e l l m i g r a t i o n , c e l la d h e s i o n ，c y s t o s k e l e t o nr e a r r a n g e m e n t ，p r o t e i nt r a n s p o r t a t i o n ，r e g u l a t i o no f g e n ee x p r e s s i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n k e yw o r d s ：p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n ；c e l lm i g r a t i o n ：c e l lc y c l e ：y e a s tt w o - h y b r i d ； m y o s i n x i i ，if - 1 中文摘要 英文摘要 目录 1 引言 目录 1 1 酵母双杂交系统原理1 1 2 酵母双杂交系统的特点2 1 3 酵母双杂交系统的应用2 1 4m y ox 结构特征3 2 材料与方法 2 1 材料4 2 1 ：1 质粒与菌种4 2 1 2 化学试剂4 2 1 3p c r 引物4 2 2 实验方法4 2 2 1 制备酵母感受态细胞。4 2 2 2 小规模转化酵母细胞5 2 2 3 人胎脑c d n a 文库的滴度测定5 2 2 4 人胎脑c d n a 文库的扩增5 2 2 5 酵母大规模转化6 2 2 6 酵母质粒提取及氯化钙法转化大肠杆菌6 2 2 7 回交实验确定蛋白质之间特异的相互作用7 2 2 8 文库质粒c d n a 插入片段的序列分析7 3 实验结果 3 1 诱饵质粒的自激活活性检测8 3 2 人胎脑c d n a 文库的滴度测定、扩增9 3 3 酵母双杂交系统筛选人胎脑c d n a 文库9 3 4 假阳性克隆的排除9 3 5 阳性克隆的测序结果和同源性比较1 0 4 讨论 5 结论 参考文献 致谢 1 4 1 6 1 7 1 9 ilf 0 r 东北师范大学硕士学位论文 ， 1 引言 生物体系的正常运作与蛋白质之间的相互作用密切相关，例如：d n a 的复制及修 复、基因转录、蛋白质的翻译、修饰和定位以及细胞内外的信号转导等重要的生物过程 均涉及到蛋白质复合体的作用。认识这些蛋白质生物学功能是发现和验证在生物体中与 其相互作用的核酸或者蛋白质。酵母双杂交技术作为发现和研究活细胞体内的蛋白质之 间相互作用的技术平台【l j ，在近几年来得到了广泛运用。 酵母双杂交系统是利用真核生物的转录、翻译的特点，在真核模式生物酵母中进行 的研究细胞内蛋白质相互作用的一种生物学技术。它对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用 也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白 质之间相互关系的技术。已有的大量研究表明，酵母双杂交技术可以用来研究哺乳动物 基因组编码的蛋白质之间的相互作用。 1 1 酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录起始过程调控的认识。已经明确，转 录活化蛋白可以和d n a 上特异的碱基序列相互结合从而启动相应基因的转录。这种 d n a 结合、转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即d n a 结合 结构域( b i n d i n gd o m a i n ，b d ) 和转录活化结构域( a c t i v a t i o nd o m a i n , a d ) 分别来完成的， 并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的，这两个结构域通过共价或非共价连 接建立的空间联系是结合和激活能够发生的关键【2 3 j 。 根据这个特性，在酵母双杂交的g a l 4 系统中，将编码b d 的基因与已知蛋白( b a i t p r o t e i n ) 的基因构建在同一个表达载体上，使两个蛋白以融合蛋白b d b a i tp r o t e i n 的形 式在酵母中表达，同理，将编码a d 的基因和e d n a 文库的基因构建在a d e d n a 表达 载体上【4 】，使二者也以融合蛋白a d p r e yp r o t e i n 的形式表达。改造后的酵母a h l 0 9 细 胞的基因组不能激活g a l 4 ，因此不能合成l c u 、t r p 、h i s 、a d e 这四种氨基酸以及1 3 - 半乳糖苷酶，因此，酵母a h l 0 9 在缺乏这些氨基酸的培养基上无法正常生长。当同时 将上述两种载体转化改造后的酵母a h l 0 9 ，这两种载体所表达的b a i t p r o t e i n 蛋白和p r e y p r o t e i n 蛋白能够相互作用时，b d 结构域与a d 结构域相互结合，因此能够激活酵母基 因组中的报告基因h i s ，a d e ，l a c z 、m e l l ，从而通过功能互补和显色反应筛选获得阳性 菌落。将阳性反应的酵母菌株中的a d c d n a 载体提取分离出来，从而对载体中插入的 文库基因进行测序和分析工作【5 , 6 , 7 , 8 】。g a l 4 系统原理如图所示： 东北师范大学硕士学位论文 k 觚f g a l 4 b dg 吼气心 p g b k t 7 - b a hp a c t 2 一c d n a n a 1 0 9 ( t r p l e u h i s a d e 表达缺陷株) ，u a l 4 a d b a i tp r o t e i n c d n a p r o 池 g a i 4 7 掣舢 u a s p r o m o t e rm e y a d e & i i s l a c zr e p o r t e rg e n e 图1 酵母双杂交原理 1 2 酵母双杂交系统的特点 在以往研究工作中，研究人员发展了一系列确定蛋白质一蛋白质之间相互作用的实 验方法，例如：免疫共沉淀技术、g s t 融合蛋白技术、噬茵体展示技术、蛋白质芯片技 术等，同这些技术手段相比，酵母双杂交系统具有其独特优势。 首先，融合蛋白b d b a i t p r o t e i n 和a d 文库蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞 内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，它所证 实的蛋白质间相互作用将更接近于其在体内的真实水平。 其次，酵母双杂交系统的敏感度很高，可以检测到蛋白质之间结合常数低至 1 m m o l l 左右的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报告基因 表达过程中的多级放大效应反映出来；另外融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较 高的表达水平【9 , 1 0 , 1 1 】。 第三，在筛选c d n a 文库时，酵母双杂交系统能够更简捷地得到编码相互作用蛋 白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了蛋白抽提、纯化等 繁琐步骤。 1 3 酵母双杂交系统的应用 酵母双杂交系统自1 9 8 9 年f i e l d s 建立至今，得到了不断的发展与完善， 2 东北师范大学硕士学位论文 的优势，它已经被应用在许多研究工作当中。 酵母双杂交系统常用于鉴定与已知蛋白质相互作用的未知蛋白、发现新的蛋白质相 互作用和确定相互作用结构域的重要研究手段，已经成为发现新基因的主要途径。我们 将已知基因作为诱饵，在特定的c d n a 文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白质，从筛 选到的阳性克隆中可以分离得到a d 文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的 c d n a 片段，并对该片段的编码序列在g e n eb a n k 数据库中进行比较，从而了解c d n a 片段所编码的蛋白，建立与已知蛋白在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知 基因新功能或多个筛选到的已知基因之间功能关系的主要方法。除此之外，酵母双杂交 系统还被用于研究体内抗原和抗体的相互作用，筛选药物的作用位点、药物对蛋白质之 间相互作用的影响以及建立基因组蛋白连锁图等。 1 4m v ox 结构特征 m y ox 广泛存在于脊椎动物，是肌球蛋白家族成员之一，作为动力蛋白调节细胞的 基本生命活动。m y 0x 主要分为三个结构域，分别为头部的马达结构域，颈部的三个i q 基序( m o t i f ) ，随后是预测的铰链区以及尾部结构域。尾部结构域是m y 0x 区别于其它 肌球蛋白的主要特征，包括三个血小板一白细胞一蛋白激酶c 底物同源区( p l e c k s t r i n h o m o l o g y , p h ) 、m y t h 4( m y o s i n t a i l h o m o l o g y 4 ，m y t h 4 ) 和f e r m ( b a n d 4 1 e z r i n r a d i x i n m o e s i n ，f e r m ) 结构域【1 2 1 3 1 ，现有的研究表明，m y ox 头部结合肌 动蛋白【1 4 1 ，i q 基序与钙蛋白或类钙蛋白结合，铰链区可部分可以形成二聚体，p h 区通 常与磷酯酰肌醇结合，m y ox 通过m y t h 4 与肌动蛋白纤维和微管结合【l5 1 ，通过f e r m 与磷酸酪氨酸、整合素、e n a v a s p 、d c c n e o g e n i n 和b m p 6 等结合【幡2 1 】。这些分子在 胚胎时期的脑组织均有较高水平的表达，另外也有研究指出，m y ox 与丝状伪足的形成 和延伸、细胞迁移、神经突起生长和神经轴突投射相关1 2 2 , 2 3 1 因此，研究者推测m y ox 在神经系统发育中有一定的调节作用。也有研究表明，m y 0x 与有丝分裂有关，m y ox 定位于纺锤体的两极，并且对于维持有丝分裂中纺锤体的极性和长度有重要作用，另外， m y 0x 与纺锤体的锚定和移动有关。m y 0x 的m y t h 4 f e r m 结构域与i m p o r t i n a 相互 作用，因此推测m y ox 的定位可能与纺锤体组装因子有关，从而影响细胞周期【2 4 1 。 随着对m y ox 研究的深入，人们越来越关注m y 0x 的功能，本研究利用酵母双杂 交技术从人胚脑2 0 周的e d n a 文库中筛选到与m y ox 相互作用的新蛋白，从筛选到的 阳性酵母菌株中分离得到a d 文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的c d n a 片段，并对该片段的编码序列在g e n e b a n k 中进行比较，研究新蛋白与m y 0x 在生 物学功能上的联系。为不断地了解m y 0x 在生理上的新功能奠定基础。 东北师范大学硕士学位论文 2 1 材料 2 材料与方法 2 1 1 质粒与菌种 质粒p g b k t 7 一m y ox 为本实验室构建并保存、p g a d t 7 、p g b k t 7 l a m 、 p g a d t 7 一t 、p g b k t 7 5 3 、p c l l ，菌株酵母a h l 0 9 ，人胚脑2 0 周e d n a 文库均购买于 c l o n t e c h 公司。工程菌e c o l id h 5 a 为本实验室保存； 2 1 2 化学试剂 异丙基一p - d 硫代半乳糖苷( i s o p r o p y l - p - d - t h i o g a l a c t o s i d e ，i p t g ) 、卡那霉素( k a n ) 、 氨苄青霉素( a m p ) 、低分子量标准蛋白( 1 4 4 9 7 4k d ) 和预染的低分子量标准蛋白 ( 1 4 4 9 7 4k d ) 、各种氨基酸购自北京鼎国生物工程公司。 t 4d n a 连接酶，核酸限制性内切酶购买于n e b 公司，预混t a q 酶，d n a 分子量 m a r k e rd l 2 0 0 0 和d n a 分子量m a r k e rd l - 1 5 0 0 0 购自大连宝生物公司。 不含氨基酸的氮源( y e a s tn i t r o g e nb a s ew i t h o u ta m i l l oa c i d ) 购买于d i f c o 公司。 鲑鱼精d n a 购买于s i g m a 公司。 其余常规试剂为国产分析纯试剂。 各种培养基及溶液的配置均参照y e a s tp r o t o c o l sh a n d b o o k 、m a t c h m 削陋rg a l 4 t w o h y b r i ds y s t e m3 & l i b r a r yu s e rm a n u a l 。 2 1 3p c r 引物 5 a dp r i m e r 5 c t a t t c g a t g a t g a a g a ：l c c c c a c c a a a c c c 3 3 a dp r i m e r 5 g t g a a c t t g c g g g g t r i t t c a g t a t c t a c g a t - 3 2 2 实验方法 2 2 1 制备酵母感受态细胞 ( 1 ) 将冻存的甘油菌酵母a h l 0 9 用接种针取少量划在y p d a 平板上，复苏酵母细 胞，3 0 培养，直到酵母a h l 0 9 克隆直径长2 3 n l 】【n ，一般需要2 3 天。 ( 2 ) 从y p d a 平板上挑取生长1 3 周、直径2 3i 衄的酵母a h l 0 9 单克隆，在1 5 m l 离心管中加入lm ly p d a 液体培养基，接入挑取的单克隆，振荡打散菌落，然 后将其接入5 0m l y p d a 液体培养基中，3 0 、2 5 0 r p m 振荡培养过夜( 1 6 1 8 h r ) ， 至o d 6 0 0 1 5 ： ( 3 ) 取适量过夜培养菌液接种于3 0 0m l 新鲜的y p d a 液体培养基，至 4 东北师范大学硕士学位论文 o d 6 0 0 - 0 2 - 0 3 ，3 0 。c 恒温，2 5 0 r p m 振荡培养至o d 6 0 0 - 0 4 - 0 6 ( 约3 h ) ； ( 4 ) 室温离心2 5 0 0 r p m 5 m i n ，弃上清；加入2 5 5 0m ld d h 2 0 重悬洗涤酵母细胞， 离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用3m 1 1 1x t e l i a c 重悬后，分为两管离心， 1 5 0 0 0r p m 离心3 0 s e e 弃上清，每管加入6 0 0 9 l1 1 x t e l i a c 重悬，即为酵母感 受态细胞( 酵母感受态细胞一旦制备应尽快使用，以提高转化效率) 。 2 2 2 小规模转化酵母细胞 ( 1 ) 冰上融化待转化得质粒d n a 。 ( 2 ) 将鲑鱼精d n a ( 2 0 m g m 1 ) 煮沸1 0 m i n 制成载体d n a ，煮过立即放入冰上备用。 ( 3 ) 在1 5 m l 离心管中依次加入下列物质并混匀：质粒d n a ( 0 1 u g ) 、载体 d n a ( 0 1 i n g ) 、酵母感受态( 1 0 0 9 1 ) 。 ( 4 ) 每管中各加入5 0 0 9 lp e g l i a c ，剧烈振荡( 提高转化效率) ，3 0 温箱放置3 0 m i n ， 每1 0 m i n 颠倒混匀一次。 ( 5 ) 每管中各加入2 0 9 ld m s o ，缓缓倒置混匀( 不能振荡) ，4 2 c 水浴热休克1 5 m i n ， 迅速冰浴冷却1 - 2 m i n 。 ( 6 ) 室温离心1 4 ，0 0 0 r p mx5 s e c ，尽量弃尽上清，用l m l0 9 n a c l 重悬沉淀细胞， 取1 0 0 山涂布在相应的固体培养板上，室温下待菌液完全吸收，3 0 倒置培养， 直至克隆出现。 2 2 3 人胎脑c d n a 文库的滴度测定 实验中使用c l o n t e c h 公司提供的人胎脑c d n a 文库( 构建于载体p a c t 2 上) 。 ( 1 ) 冰上融化冻存的c d n a 文库。 ( 2 ) 将c d n a 文库充分震荡混匀，取1 山c d n a 文库加入到含有l m l 液体l b 培养基 的1 5 m l 离心管中，即将文库浓度稀释到l o 。3 倍，成为稀释液a 。之后再将文 库浓度稀释到1 0 西倍，成为稀释液b 。 ( 3 ) 取l 山稀释液a 加入到5 0 t t l 液体液体l b 培养基中，充分混匀，全部涂布于固 体l b a m p 平板上。 ( 4 ) 取5 0 i t l 、1 0 0 i _ d 的稀释液b 涂布于固体l b a m p 平板上。将上述平板在室温放 置15 m i n 2 0 m i n ，待菌液完全吸收，3 0 倒置培养3 6 - 4 8 h 。 ( 5 ) 计算e d n a 文库的滴定度： 稀释液a ：独立克隆数1 0 3 , 1 0 3 = e f u m l 稀释液b ：( 独立克隆数铺板菌液体积) 1 0 3 1 0 3 1 0 3 - - e f i g m l 2 2 4 人胎脑e d n a 文库的扩增 ( 1 ) 取5 0 9 le d n a 文库加入到1 0 m l 液体l b a m p 培养基中，充分混匀。 ( 2 ) 将上述菌液取1 5 0 9 l 涂布于1 5 0 m m 平板上，共涂布3 0 个平板。待菌液完全吸 收，3 0 c 倒置培养3 6 - 4 8 h 。 东北师范大学硕士学位论文 ( 3 ) 每个平板加入5 m l 液体l b ，收集所有菌落。合并所有液体l b 于5 0 0 m l 三角瓶 中，3 0 c 、2 0 0r p m 培养3 h 。 ( 4 ) 按照q i a g e n 公司质粒提取试剂盒操作指南提取质粒d n a 。 2 2 5 酵母大规模转化 按照c l o n t e c h 公司操作指南的推荐，本研究采用分步转化的方法转化酵母细胞。酵 母细胞a h l 0 9 首先被转化诱饵质粒p g b k t 7 m y ox ，将在s d t r p 型平板上生长的阳性 克隆制备成酵母感受态细胞，e d n a 文库质粒用醋酸锂法大规模转化酵母。 ( 1 ) 含诱饵质粒的酵母感受态细胞制备 将诱饵质粒p g b k t 7 m y ox 小规模转化酵母a h l 0 9 ，在s d t r p 营养缺失培养基 上生长3 5 天，挑取2 3 m m 的白色克隆在l m ls d t r p 营养缺失培养基中充分混匀，至 菌落完全打散。，然后接入5 0m ls d t r p 液体培养基中，3 0 、2 5 0 r p m 振荡培养过夜 ( 1 6 1 8 h r ) ，至o d 6 0 0 1 5 ；取适量过夜培养菌液接种于1 0 0 0m ls d 。t r p 液体培养基， 至o d 6 0 0 = o 2 o 3 ，3 0 恒温，2 5 0 r p m 振荡培养至o d 6 0 0 = 0 4 0 6 ( 约3 h ) ；室温离心 2 5 0 0 r p m 5 m i n ，弃上清；加入2 5 5 0m ld d h 2 0 重悬洗涤酵母细胞，离心弃上清，重复 洗涤一次，沉淀用3 0 血1 1 t 肌认e 重悬后，分为两管离心，1 5 0 0 0r p m 离心3 0 s e e 弃 上清，每管加入4 m l1 1x t e l i a c 重悬，即为含诱饵质粒的酵母感受态细胞。 ( 2 ) e d n a 文库质粒转化含诱饵质粒酵母细胞a h l 0 9 冰上融化待转化的e d n a 文库质粒d n a 。将鲑鱼精d n a ( 2 0 m g m 1 ) 煮沸1 0 m i n 制成载体d n a ，立即放入冰上备用。在5 0 m l 离心管中依次加入下列物质并混匀：质粒 d n a ( 5 0 0 u g ) 、载体d n a ( 2 0 m g ) 、酵母感受态( 8 咖) 。加入3 0 m lp e g l i a c ，剧烈振荡 ( 提高转化效率) ，3 0 温箱放置3 0 m i n ，每1 0 m i n 颠倒混匀一次。加入2m ld m s o ， 缓缓倒置混匀( 不能振荡) ，4 2 水浴热休克1 5 m i n ，迅速冰浴冷却1 - 2 r a i n 。室温离心 1 4 ，0 0 0 r p m 5 m i n ，尽量弃尽上清，用1 0 m l0 9 n a c l 重悬沉淀细胞，取l o o 肛1 涂布在 含x g 址的s d a d e l e u t r p h i s 固体培养板上，室温下待菌液完全吸收，3 0 c 倒置培养 5 7 天，蓝色克隆即为阳性克隆，挑取阳性克隆在含x 鲥的s d a d e l e u t r p h i s 的平 板上反复划线培养5 次，去除假阳性克隆。 2 2 6 酵母质粒提取及氯化钙法转化大肠杆菌 以s d a d e l e u t r p h i s 培养基培养阳性酵母克隆，酵母质粒的提取方法按照天根 公司酵母质粒提取试剂盒指南操作。 从阳性克隆中提取的质粒即含有诱饵质粒也含有e d n a 文库质粒，由于e d n a 文库 质粒带有氨苄青霉素抗性，诱饵质粒带有卡那霉素抗性，因此可在l b a m p 抗性下筛选 。 e d n a 文库质粒。用氯化钙法制备大肠杆菌感受态，以每1 0 i t l 提取的酵母质粒转化1 0 0 9 l e c o l id h 5 a 感受态，涂布于l b a m p 抗性平板，倒置于3 7 1 2 培养箱中过夜培养。 按照分子克隆所示质粒小提方法从大肠杆菌中提取e d n a 文库质粒，测定质粒浓 度。p c r 确定有无插入片段。 6 东北师范大学硕士学位论文 p c r 鉴定反应体系： 总体积( 2 5 1 ) 引物5 a d 引物3 a d 模板 预混t a q 酶 d d h 2 0 p c r 反应条件： 1p 1 1 肛l 0 5u l 1 2 5 山 9 5 肛l 9 5 c , 4 0 st 5 53072 个循环个循环 ，j l - - - - - 2 2 7回交实验确定蛋白质之间特异的相互作用 为了排除假阳性，将提取c d n a 文库质粒分别与p g b k t 7 m y ox 、p g b k t 7 , p g b k t 7 m y ox 与p g a d t 7 共同成对小规模转化酵母a h l 0 9 ，若诱饵质粒和文库质粒 存在特异的相互作用，则只有诱饵质粒和文库质粒共同转化的酵母才能在含x g a l 的 s d a d e l e u t r p - h i s 的平板上生长并变蓝，其他的对照组则无酵母菌落生长。从而验证 文库质粒与诱饵质粒相互作用的特异性和重复性。 2 2 8 文库质粒c d n a 插入片段的序列分析 文库质粒以5 a d 为引物对插入序列进行了部分或全长序列测定，用b l a s t n 软件 对测序所得c d n a 序列与g e n b a n k 数据库进行同源性分析，确定目的基因所编码的靶 蛋白。 7 和待筛选文库的自激活活性。 c t 2 上) ，这部分工作已经由供 a h l 0 9 菌株，在s d - t r p x - g a l 上筛选转化体，生长出的阳性克隆用于自激活验证。从显色结果看出( 见图2 ) ，阳性对 照( 图2 a 、b ) 有菌落生长并显蓝色，阴性对照( 图2 c ) 无菌落生长，表明实验体系 正确，转化p g b k t 7 - m y ox 的酵母克隆正常生长且没有显蓝色( 图2 d ) ，说明 p g b k t 7 一m y ox 诱饵蛋白没有自激活，可用于酵母双杂交筛选。 影” l l l k1 、：警叠：- ；。，。j 锺鲑。 b c d 图2 诱饵质粒自激活活性检测。a ：质粒p c l i 转化a h l 0 9 ，在含x - g a l 的s d - l o u 型平 板上生长并变蓝；b ：质粒p g b k t 7 - 5 3 和p g ad ，r 7 t 转化a h l 0 9 在含x - g a l 的 s d - a d e - l e u - t r p - h i s 型平板上生长并变蓝；c ：质粒p g b k t - l a m 和p g a d t t - t 转化a h l 0 9 ， 在含x - g a l 的s d - a d e - l e u - t r p - l - l i s 型平板上不生长；d ：质粒p g b k t 7 一m o y x 转化a h l 0 9 ， 在含x _ g a l 的s d - t r p 型平板上生长，但不变蓝 8 、 ，轧卜 ， ；ii 东北师范大学硕士学位论文 3 2 人胎脑c d n a 文库的滴度测定、扩增 在进行人胎脑p a c t 2 文库扩增前需要检测此c d n a 文库的滴定度，经计算此文库 的滴定度为2 1 0 8c f u m l ，符合酵母双杂交筛选对文库滴定度的要求，可用于扩增文库。 取5 0 9 l 待转化的文库菌种，铺于3 0 个氨苄抗性的l b 平板上，收获的菌体用大规模质 粒提取方法提取文库质粒，获得文库质粒1 5 m g ，用于后续实验。 3 3 酵母双杂交系统筛选人胎脑c d n a 文库 将5 0 0i , t g 人胎脑c d n a 文库质粒转化已含有p g b k t 7 m y ox 重组体的a h l 0 9 。 取1 0 0 r d 转化菌液涂布在s d l e u - t r p 的平板上，总计涂布3 个平板，检测转化效率，经 计算得到转化子约8 1 0 6c f u g g ，转化子总数超过了人胎脑e d n a 文库的独立克隆数， 满足文库筛选的要求。其余菌液涂布于含x g a l 的s d a d e l e u t r p h i s 的平板上培养5 7 天，获得阳性克隆，将获得的阳性克隆在含x g a l 的s d a d e l e u t r p - h i s 的平板上反复 划线培养5 次，去除假阳性克隆，共获得1 1 2 个阳性克隆。 3 4 假阳性克隆的排除 获得的阳性克隆提取质粒转化大肠杆菌，通过氨苄抗性筛选得到靶质粒，经过回交 转化含诱饵质粒的酵母，排除假阳性( 图2 ) 。p g b k t 7 与p g a d t 7 、p g b k t 7 与靶质 粒、p g b k t 7 m y o x 与p g a d t 7 、p g b k t 7 m y o x 与靶质粒共同转化酵母a h l 0 9 ，在 含x g a l 的s d l e u t r p 型平板上有菌落生长，但不变蓝，说明p g b k t 7 与p g a d t 7 、 p g b k t 7 与靶质粒、p g b k t 7 m y o x 与p g a d t 7 、p g b k t 7 m y o x 与靶质粒共同转入 酵母a h l 0 9 ，p g b k t 7 、p g a d t 7 、靶质粒、p g b k t 7 m y o x 均无自激活活性。这几 组质粒共转酵母a h l 0 9 后，在含x g a l 的s d a d e l e u t r p - h i s 的平板上只有 p g b k t 7 m y o x 与靶质粒共转酵母a h l 0 9 后有菌落生长，其他均无菌落生长，这表明 p g b k t 7 m y o x 与靶质粒存在特异的相互作用，也进一步证明靶质粒、p g b k t 7 m y o x 均无自激活活性。 9 东北师范大学硕士学位论文 图3 验证p g b k t 7 - m y o x 与靶质粒的相互作用。 a ：转化模式图；b ：p g b k t 7 与p g a d t 7 、 p g b k t 7 与靶质粒、p g b k t 7 - m y o x 与 p g a d t ? 、p g b k t 7 0m y o x 与靶质粒共同转化酵 母a h l 0 9 ，在含x - g a 的s d - l e u - t r p 型平板上有 菌落生长，但不变蓝：c ：p g b k t 7 与p g a d t 7 、 p g b k t 与靶质粒、p g b k t 7 m y o x 与p g a d t 7 、 p g b k t 7 m y o x 与靶质粒共同转化酵母a h l 0 9 ， 在含x g a l 的s d - a d e - l e u - t r p - h i s 的平板上只有 p g b k t 7 - m y o x 与靶质粒共转酵母a h 10 9 后有 菌落生长，其他均无菌落生长。 r 一j 0 夕1 芦夏j ：岛：乡 3 5 阳性克隆的测序结果和同源性比较 双杂交系统筛选出的阳性克隆c d n a 片段存在于p a c t 2 表达载体上，因此其读码 框必须与载体上所具有的g a i a 激活结构域的读码框一致。本研究所使用的文库其 g a i a 激活结构域的c 端通过多克隆位点及连接子编码的短肽与c d n a 编码的蛋白的n 端相连，从而以融合蛋白形式表达。因此我们只需进行阳性克隆的c d n a 序列同源性分 析即可知道c d n a 序列编码的蛋白。 我们将阳性克隆以5 a d 为引物对插入序列进行了部分或全长序列测定，用 b l a s t n 软件对测序所得的阳性克隆的c d n a 序列与g e n b a n k 数据库进行同源性分析。 以c c n b i l p l 的9 6 # 克隆为例，其测序长度为9 4 3 b p ，开放阅读框架长8 3 4 b p ，编码 2 7 8 个氨基酸。对9 6 # 克隆插入的核苷酸片段进行b l a s t n 比对分析，分析结果如下： r e i n m _ 1 8 2 8 5 2 1 l h o m o s a p i e n sc y c l i nb ii n t e r a c t i n gp r o t e i n1 ( c c n b l i m lt r a n s c r i p tv a r i a n t4 ，m r n a l e n g t h = 16 4 9 s c o r c = 1 4 7 8b i t s ( 8 ) ，e x p e c t = 0 0 i d e n t i t i e s = 8 0 0 8 0 0 ( 1 c a p s = 0 1 8 0 0 ( q 1 0 东北师范大学硕士学位论文 s t r a n d = p l u s p l u s q u e r y1 4 3 c 1 v r c a g c l ，i c t g g a g a c c t c a c t a t c c t a t t a t g t c t t t g t g t g 从g a c a t g c t g c t t t g | l | li i i | i f | | i f j l l s b j c t5 8 7 c t t c a g c l v r c t g g a g a c c t c a c t a t c c t a t t a t g t c t t t g t g t g 从g a c a t g c t g c l v r t g q u e r y2 0 3 s b j c t6 4 7 q u e r y 2 6 3 s b j c t7 0 7 q u e r y3 2 3 s b j c t 7 6 7 q u e r y3 8 3 s b j c t8 2 7 q u e r y4 4 3 s b j c t8 8 7 q u e r y5 0 3 s b j c t 9 4 7 q u e r y5 6 3 s b j c t1 0 0 7 q u e r y6 2 3 s b j c t 1 0 6 7 t 从t t a t c g a a a g t g t c g c a t c a 从c t c t c t g g c t a t g c a t g g g t c a c t g c c t g c t c t c a i ii | i | i i i l i | | | l | l l | l | l i l | l | l |