（环境科学专业论文）基于cellsense生物传感器的污染物毒性分析技术研究.pdf

摘要 广阔的推广应用前景。 关键词：全细胞生物传感器，大肠杆菌( e c o l i ) ，生物毒性，固定方法 a b s t r a c t a b s t r a c t b i o s e n s o ri sa na n a l y t i c a ld e v i c et h a tc o m b i n e sa b i o l o g i c a ls e n s i n gd e m e n t ( s u c ha s e n z y m e ，m i c r o o r g a n i s m s ，d n ae t e ) w i t ha 仃卸d u c e ft op r o d u c eab i o l o g i c a ls i p t h a tc o u l db ec o n v e r t e di n t oam e a s u r a b l er e s p o n s ef o rl a t e ra n a l y s i s t h em a i n a d v a n t a g e so f f e r e db yb i o s e n s o r so v e rc o n v e n t i o n a la n a l y t i c a lt e c h n i q u e sa l et h e p o s s i b i l i t yo fm i n i a t u r i z a t i o n ，r a p i dd e t e e t i o n ，a n dw o r k i n go n - s i t ee t c b i o s e n s o r s c a nb eu s e da se n v i r o n m e n t a lq u a l i t ym o n i t o r i n gt o o l s o nt h eb a s e o f o p t i m i z a t i o no ft h ea n a l y t i c a lp a r a m e t e r sa n dm i c r o o r g a n i s m i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sb yu s i n gc o m m e r c i a lc e l l s e n s ob i o s e n s o r sw i t he c o , c e l l s e n s eb i o s e n s o rw i t hd i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s m ss u c ha se c o t o p l o ，b a c i l l u s s u b t i l i sa n d p r o t e u sm i r a b i l i s 肿c o n s t r u c t e da n do p t i m i z e di nt h i sd i s s e r t a t i o n t h e i r p e r f o r m a n c e sf o rt o x i c i t yt e s t so fh e a v ym e t a l s ，o r g a n i cm a t t e r sa n dl e a e h a t e sf r o m d i f f e r e n tf f e a t m e n tu n i t sa r ca l s oi n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp - b e n z o q u m o n e 啪b eu s e d 器a ne x c e l l e n tm e d i a t o rf o r c e l l s e n s eb i o s e n s o r , a n dt h es u i t a b l et o x i c i t yi n h i b i t i t i m ei sa b o u t3 0 m i n i i n h i b i m r ye f f e c t so ff o u rh e a v ym e t a l st oc o m m e r c i a le c o c a nb er a n k e di na d e c r e a s i n go r d e ro fh 矿 c u 2 + z n 2 + n i 2 + , w h i c ha c c o r d st o t h er e s u l t so f c o n v e n t i o n a lb a c t e r i a lc o u n t i n gm e t h o d 1 kc e l l s e n s eb i o s e n s o rw i t he c d ，fa l s o s h o w sag o o d , r e p r o d u c i b l eb e h a v i o rw h e n t e s t i n gt o x i c i t yo fh e a v ym e t a l s ，t h er s d i sl e s st h a n5 t h et o x i c i t yt c s 拓o fo r g a n i cc o m p o u n d sw i t h i nc e r t a i nc o n c e n t r a t i o n r a n g e su s i n gc e l l s e n s eb i o s e n s o ra l s og a i ns a t i s f y i n gr e s u l t s r e s e a r c ho nm i c r o o r g a n i s mi m m o b i l i z a t i o nm e t h o d ss h o w e dt h a tp o l y e a l b o m t e m e m b r a n ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o de x h i b i t e dt h eb e s tt o x i c i t yt e s tp e r f o r m a n c e t h o s e b i o s e n s o r sk c e pv e r ys t a b l ew i t h i nt w om o n t hi n4 0r e f r i g e r a t o r , a n dn od i s t i n c t m a b s l r a c t d i f f e r e n c ei ss h o w e di nt o x i c i t yt e s tr e s u l t s c e l l s e n s eb i o s e n s o r sm a d eb yu s i n g g a - b s ai m m o b i l i z a t i o nm e t h o d , p v a - h 3 8 0 3a n ds o d i u ma l g m a t ee n t r a p m e n t m e t h o dd on o ts u i tf o r t h et o x i c i t ya n a l y s i s d i f f e r e n c e se x i s ta m o n gc e l l s e n s eb i o s e n s o r sw i t ht h es a m em i c r o o r g a n i s ma t d i f f e r e n tc u l t i v a t i o np 商o d s i tw a so b s e r v e dt h a tc e l l s 锄s eh i o s e n s o r sw i t he c o l i t o p1 0 、b a c i l l u ss u b t i l i sa n dp r o t e u sm i r a b i l i sa tl a t e - l o gp h a s es h o wb e t t e rm s p o u s e p e r f o r m a n c e s t h el e a c h a t et o x i c i t yt e s tr e s u l t sa l s os h o w e dt h a tl a b - m a d ee c o l ib i o s e n s o rc a l l r e f l e c tt o x i c i t yc h a n g eo f l e a c h a t es a m p l e sf r o md i f f e r e n tt r e a t m e n tu n i t s c e l l s e n s eb i o s e n s o ri sau s e f u la n d p r o m i s i n gd e v i c ef o rt o x i c i t yt e s ta n d a s s e s s m e n t o fd i f f e r e n tp o l l u t a n t s ，w h i c hp o s s e s s e st h em e r i t so fc o n v e n i e n c e ，s e n s i t i v ea n df a s t d e t e c t i o n , a n do n - l i n ea n a l y s i s k e y w o r d s ：w h o l e c e l li i o s e n s o r , e c o l i ，b i o l o g i c a lt o x i c i t y , i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子 版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、 缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检 索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有 关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在 不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部 内容用于学术活动。 学位论文作者签名：王虹 加8 年月j l | 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 指导教师签名： 学位论文作者签名： 年月 日 年月 日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：互虹 砒年弓月i b 日 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 环境样品综合毒性生物测试方法 近几十年来，合成化学物质种类及用量剧增，对水环境造成日益严重的污 染棚。含重金属、内分泌干扰素等无机及有机毒性物质废水的大量排放，对污 水处理厂生物处理系统及天然水体造成巨大冲击。有些毒性物质在很低浓度水 平时亦显示出对生物强烈的毒害作用，此时，以c o d 等常规指标的总量控制将 无法满足水体污染控制的需求。因此，必须选择合适的方法对废水的综合毒性 进行评价，以反映废水对人类和其他生物的危害。 目前，废水毒性的测定主要有理化方法和生物学方法。传统的化学物理分 析方法虽能定量分析废水中主要污染物的成分及含量，但不能直接和全面地反 映各种有毒物质对环境的综合影响。而废水中组分复杂的污染物潜在的生物效 应( 如毒性、致突变性、潜在内分泌干扰性等) 信息的匮乏加大了对废水风险 评价的难度。生物测试能够弥补理化检测方法的不足，因此在水污染研究中， 它已经成为监测和评价水体环境的重要手段之一。 生物方法不仅能较全面地分析废水中复合污染物的联合毒性作用，并能充 分了解各种环境因子( 如p h 、温度、溶解度) 对污染物毒性效应的具体影响， 具有很大的优势。近年来，大量基于微生物、植物、无脊椎动物及鱼类等的生 物毒性测试方法开始建立并迅速发展。由于不同生物对不同毒性物质的敏感程 度存在差异，因此，在实际应用中，大量处于不同营养级的不同种类的生物常 被选作毒性测试的指示生物。 1 1 1 鱼类毒性实验 鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时， 就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变，直 至死亡。鱼类急性毒性实验一般程序为：在规定的条件下，使鱼接触含不同浓 度受试物的水溶液，实验周期2 4h , - - 9 6h ，在2 4h 、4 8 h 、7 2h 和9 6h 时记录实验 鱼类的死亡率，确定鱼类死亡5 0 0 6 时的受试物浓度，以半数致死浓度l c s 0 表示旧。 目前国际通用的急性毒性实验标准用鱼是斑马鱼，国内常用于毒性测试的鱼还 第1 章绪论 有青、草、鲢、鳙四大家鱼等r 7 ，舯。 鱼类毒性实验在国内外进行的均比较早，目前已有大量的研究报道。国内 杨霓云等【9 】在五氯苯酚( p c p ) 、邻氯苯酚( 2 c p ) 和2 ，4 二氯苯酚( 2 ，4 - d c p ) 等3 种 物质单一毒性试验结果的基础上，按照等毒性单位设计，采用相加指数法，对 五氯苯酚( p c p ) 与邻氯苯酚( 2 c p ) 或2 4 二氯苯酚( 2 , 4 - d c p ) 以及这3 种物质 共存对斑马鱼( b r a c h y d a n i or e r i o ) 的联合毒性进行了试验研究。结果表明，邻 氯苯酚( 2 c p ) 和2 ，4 二氯苯酚( 2 , 4 - d c p ) 与五氯苯酚的联合毒性效应均表现为 协同作用。刘红玲等【l o 】采用斑马鱼胚胎发育技术研究氯代酚和烷基酚类化合物 的毒性，观察化合物对不同发育阶段斑马鱼卵的影响。研究表明，该类化合物 对斑马鱼胚胎发育均有明显抑制作用，可以造成胚胎发育畸形甚至死亡，具有 特定的最敏感毒理学终点。斑马鱼胚胎技术具有成本低、操作简易、影响因素 少、毒性指标丰富、灵敏度高等优点，正逐步成为传统成鱼急性毒性试验的替 代手段【1 1 1 。 此外，研究毒性物质对受试鱼组织中a t p 或酶变化也是鱼类毒性实验研究方 向之一。如陈家长【1 2 】以罗非鱼t i l i p i a 为试验鱼类，采用人工水族箱培养法，研究 了其暴露于不同浓度溴氰菊酯后组织中过氧化氢酶c a t 和单胺氧化酶m a o 活性 的动态变化。贾秀英【1 3 】在实验条件下研究了铜和镉中毒鲫鱼组织n a + - k + - a t p a s e 酶活性的变化。 目前，鱼类急性毒性实验的发展已经较为成熟和完善，已为制定水质标准、 评价环境质量和管理废水排放提供大量的数据支持，但仍存在耗时较长和对操 作者要求较高等不足。 1 1 2 无脊椎动物 大型无脊椎动物被广泛用作水环境风险评价中慢性毒性测定的指示生物。 其中，最常见的大型洹d a p h n i a ，具有敏感、繁殖周期短等生理特性，是国际公 认的标准试验生物，相关毒性试验被许多国家定为毒性必测项目 1 4 l 。大型蚤2 1 d 存活繁殖试验则是评价和监测污染物对无脊椎动物急性毒性的标准方法。汪丽【1 5 】 研究了两种光照( 光暗比= 1 4 ：l o h 和0 ：2 4 h ) 条件下，2 0 种蒽醌类化合物对大型涵的 急性毒性，比较了两种助溶剂( 二甲基亚砜和丙酮) 对此类化合物毒性的影响， 并根据毒性数据建立了定量结构活性关系( q s a r ) 模型。任宗明【l6 】监测了余 氯对用于在线监测的大型蚤的毒性效应，讨论了饮用水中余氯对大型蚤的急性 2 第1 章绪论 和慢性毒性。 其他无脊椎动物，如水螅、片脚类动物、石蝇、海生动物( 虾、牡蛎等) 也可用作毒性指示生物【。欧小兵掣1 8 1 研究重金属铜( c u 2 + ) 、镉( c d 2 + ) 对水 螅的急性毒性和联合毒性作用，探索水螅( h y d r as p ) 对c u 2 + 、c d 2 + 以及两者混 合的毒性效应，证实了水螅对两种重金属的毒性反应快速且敏感。 1 1 3 植物和藻类 多种以植物作为受试生物的毒性测定方法已建立并发展起来，但相较之下 运用范围较狭窄。植物毒性测试方法具有成本低、易实现、并能达到毒理学终 点( 如发芽率、生物量、酶活性等指标) 等优点，常用于污泥等固体样品浸出 液的毒性测定，但是此类试验所需测试周期较长。宋玉芳 1 9 】测定了水溶液和4 种 土壤( 红壤、草甸棕壤、暗棕壤和栗钙土) 条件下，铜、锌、铅、镉单一污染 对白菜种子发芽与根伸长的抑制率，以及暗棕壤条件下重金属的复合污染效应。 结果表明，同一浓度下，重金属对白菜根伸长抑制率均明显大于对种子发芽抑 制率；重金属在土壤中对白菜根伸长抑制效应明显低于其在水体中的抑制效应。 郑世英【刎采用水培方法，研究铅胁迫对玉米种子萌发及叶片渗透调节物质含量 的影响。结果表明：铅对玉米种子萌发率有低浓度的促进效应和高浓度的抑制 效应。p b 2 + 浓度较低时，不影响玉米种子的发芽指数，随着p b 2 + 浓度的提高，发 芽指数逐渐降低；种子的活力指数与发芽势均随着p b 2 + 浓度的提高而逐渐降低。 随着p b 2 + 浓度的增加，叶片内的可溶性糖和脯氨酸含量均显著增加。 藻类对于许多毒物比鱼类、甲壳类更敏感，具有生长周期短、易于分离培 养、可直接观察细胞水平上的中毒症状和可以得到化学物质对许多世代及种群 水平影响等特点，是较为理想的试验材料【2 ”。张铁明等嗍选用铜绿微囊藻 ( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o a a ) 和脆杆藻( f r a g i l a r i a s p ) 为试验材料，在不同锌离子 浓度下对两类微藻的增殖影响进行研究分析。藻类增长潜力( a g p ) 试验结果 显示，在z n 2 + 浓度为o 0 2 1 0 0 峙几的液体培养基中，铜绿微囊藻的生长增殖快； z n 2 + 浓度在o 0 2 峙l 时，脆杆藻的生长繁殖快。刘涛1 以斜生栅藻细胞的生长状 况、光合色素( 叶绿素a ，叶绿素b 、类胡萝h 素) 及蛋白质含量的变化作为指标， 研究了不同质量浓度的高效氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性效应，分析测得高效氯 氰菊酯对斜生栅藻的2 4 、4 8 、7 2 和9 6h 时的e c 5 0 分别为1 1 7 l 、6 1 9 、4 0 3 、2 8 7 m e d m l 。 3 第1 章绪论 一般而言，藻类毒性实验的重现性较差，而且目前用藻类进行废水综合毒 性的研究报道还很少。 1 1 4 细菌 用细菌来评价废水毒性是基于毒性效应对细菌的某些可见特性的作用。如 细胞生长、运动性、呼吸速率和生物发光、酶活性变化、a t p 水平、微热量等的 变化。细菌用来做毒性评价有以下优点：生物机体小、种群数量大、生长繁殖 快、保存简单方便、试验费用低、对环境变化的反应快、生长条件便利，并且 同高等动物有着类似的物理化学特性和酶作用过程等特点，因此特别适合于生 物毒性试验，有些已被许多国家定为废水毒性测定的标准方法伽。 在基于细菌的毒性检测方法中，运用最广泛当属发光细菌法，常用的两种 发光细菌v i b r i o 舾西折和尸肋幻6 韶b 删聊lp h o s p o h r e u m 均为海洋性细菌。发光细 菌毒性检测的原理是发光细菌体内的荧光素酶催化荧光素的氧化作用，反应如 式( 1 1 ) 所示： f m n h 2 + 0 2 + r - c o - h + f m n + r - c ! 0 0 h + h 2 0 + l i g h t ( 1 1 ) 发光细菌与毒性物质接触时细胞的状态( 包括细胞壁、细胞膜、电子的转移系 统、酶及细胞质的结构) 将被改变从而将导致生物发光的减弱。 目前，国内外已开发出多种基于发光细菌法测定毒性的商品化毒性检测系 统，如美国a z u r e n v k o n m e n t a l 公司的m i c r o 吣x 毒性检测系统、b e c k m a n 公司的 l u m i s t o x 及m e r c k 公司的t o x a l e r t 等，国内的清华大学亦研制出一种基于类 似原理的在线水质毒性监测仪。发光菌毒性测试系统由于其快速、简便、经济 而得到广泛应用，m i 啪缸。法亦由于其重现性能佳、操作简易被定为d i n 和i s o 标准方法瞄】。2 0 0 1 年，j c n n i n g s 等人嗍用三种发光菌测试系统( t o x a l e r tl o o ， m i c r o t o x a n dl u m i s t o x o ) 测定了8 0 多种化合物的毒性并将结果进行了比较， 认为三种测试系统有很好的相关性。张金丽等人 2 7 】利用m i c r o m x 技术检测5 种多 环芳烃化合物的生物毒性，结果表明m i 啪魄技术可有效检测低环化合物萘的生 物毒性，但对高环化合物( 墨环) 的检测因受其低水溶性的限制而灵敏度降低。 由于发光细菌v i b r i of i s c h e r i 和p h o t o b a c e t e r i u mp h o s p o h r e u m 均属于海洋生 物，在测试过程需要3 n a c l 以维持细菌正常生存，对淡水体系样品测试时高浓 度c l 。的存在会影响水样中的一些污染物，尤其是重金属污染物的生物可利用性 和毒性顺序，另外，明亮发光杆菌的p h 适应范围窄，必须将样品p h 调至 4 第1 章绪论 7 3 7 5 后才能测定，影响了样品中有毒组分毒性的真实性，因此，该类毒性检 测方法亦具有明显的局限性 2 8 1 。1 9 8 5 年8 月我国学者从青海湖的裸鲤 ( g y m n o c y p r i sp r z e w a l s k i i ) 体表分离得到一种发光细菌( v i b r i oq i n g h a i e n s i s s p n o v - 0 6 7 ) 是迄今为止正式报道的唯一的非致病的淡水发光细菌【2 9 1 。v i b r i o q i n g h a i e n s i ss p n o v - 0 6 7 具有较广泛的酸碱和温度适应性，并可在蒸馏水中正常发 光，其应用使测试体系得到简化，受到研究者的重视。 近年来国内将发光细菌用于毒性测试的研究见表1 1 。 表1 1 国内发光细菌毒性试验部分研究 t a b 1 1s o m er e s e a r c he x a m p l e so f t o x i c i 姆t e s t s u s i n gl u m i n e s c e n tb a c t e r i a 毒性测试艨发光菌种类 ( m e c 删s o誓警 研究结果 瑟 吉至襄磊鑫霉明亮誊光杆 一 - 4 。：1 9 1 - 害翟臂篥雾；藉；品象p 。， 污水厂进出水 4 ” 的综合毒性 h 矿、c a 2 + ， p b 2 + 、z 丑2 + 、 总c r 、总一 c n 、c u 2 + 、 s 。标液 原水水样、水中 有机污染物经 过富集的水样 油田采油污水 ( 含重金属及 有机物) 生物毒性大小：h 矿 0 0 7 2 3 4 4一 c d 2 + p b 2 + z n 2 + 总1 3 1 c r 总c n c u ” s r 水中影响发光的物质会 对测定结果产生干扰， 可以采用液液萃取和半 渗透膜生物模拟采样技 r 3 2 术作为水中有机有毒物 质毒性测试的样品前处 理手段 发光菌可以准确判断采 油污水的综合毒性和毒 【3 1 性等级 妻鬟2 。1 2 。, 铜锌对q 6 7 联合毒性 一qinghaieasis裂04655：一缀瓣嚣c33，spn o v - 0 6 743 6 重金属混合物 汞 ，一 7 酱：艘思墨【】 镉， ”4 ”t 呈4 ” 镍1 2 5 0 3 沉 城市污水再生 工艺不同处理 阶段水样 综上所述，常规的生物毒性测试手段的发展已较为成熟，大大弥补了理化 5 pnv一啷 咖 啦 弭 降氯毒水 著但消污显，的了能性成高 理毒形提性处水中著毒 物污艺显生市工物级城毒产二低消副 厶一 军 第1 章绪论 分析方法存在的不足。但生物实验依然存在周期长、操作复杂等问题，不能满 足对环境质量实时预报预警、突发毒物泄漏应急监测、污染处理设施在线监控 等的需要，而微生物传感器符合上述要求。近年来，随着微生物固定化技术的 发展，微生物传感器的研究和应用取得很大进展。 1 2 全细胞微生物传感器研究进展 生物传感器是以生物学元件( 如酶、微生物细胞、d n a 等) 作为功能性识 别元件，识别和感知目的被测物并且按一定规律转换成为可识别信号的器件或 装置【3 5 】。与传统的离线分析技术相比，生物传感器具有体积小、选择性好、灵 敏度高、响应快等优势，能在复杂的体系中进行快速在线连续监测，在环境监 测、食品分析、生物医学等领域有着广阔的应用前景。 0 0 0 c i o 黼o u o o o 0 孙dna ：患：尊i 微生物l 物 = = = 转：善；：! ： l 珏 ：；：缀：萎蠹 ；：韩! ；誊! ；： 抗体抗原j ! ：棒。： 圈i 1 徽生物传感器结构倚图 f 蟾1 1c o n c 培u r a t i o no f b i o s e n s o r 根据识别元件种类的不同，生物传感器可被分为三大类【3 6 】：分子生物传感 器( 抗体、d n a 、酶等) 、细胞传感器和组织传感器( 如图1 1 ) 。分子生物传感 器由于其只针对靶分子起作用而具有很高的专一性和灵敏度，如酶生物传感器 即利用化学物质对特定酶的选择性作用，探知目标分析物的存在。虽然酶作为 生物敏感元件具备专一性和特异性等优点，但酶的纯化过程复杂，费用昂贵， 复杂反应需要构建多酶系统等，限制了其在实际测试中的应用。相比之下，全 细胞传感器有其独到之处，它可以克服酶价格昂贵、提取困难及不稳定等弱点， 对于复杂反应，还可同时利用微生物体内的辅酶。此外，全细胞微生物作为生 物识别元件还具备以下优点：适合测定较宽范围的化学物质、能耐受较宽的p h 和温度范围和易于进行基因改造修饰【3 7 】等。 常见的作为分子识别元件的全细胞包括细菌、酵母菌、真菌，植物和动物 6 第1 章绪论 细胞等，其工作原理大致可分为以下几种类型：( 1 ) 利用微生物体内含有的酶 ( 单一酶或复合酶) 系来识别分子【鲳】，这与酶电极相类似；( 2 ) 可通过检测微 生物对有机物的同化作用生成的代谢物，来估计受试物的浓度；( 3 ) 还有一类 传感器则通过测定微生物呼吸代谢的强度变化，反映其受到毒性物质毒害的程 度。由此可见，选择不同的微生物测定不同的物质，各种微生物响应机理不尽 相同。 根据信号转换原理的不同，还可将生物传感器分为电化学型、光学型、质 量敏感型和热学型生物传感器等。电化学生物传感器具有灵敏度高、携带方便、 与现代分析仪器的兼容性好等特点，是目前应用最为广泛的一种。光学全细胞 生物传感器是基于光学特性，如最简单的光吸收、荧光或磷光、生物或化学发 光、反射、莱曼散射和折射率等原理p 9 】，是继电流和电势型之后应用最广的一 类生物传感器， 1 2 1 电化学全细胞微生物传感器 电化学生物传感器的研究较为成熟，按照传感器器件检测原理，基于活细 胞的电化学全细胞生物传感器可被分为电流型、电位型及电导型生物传感器三 类。 1 2 1 1 电流型微生物传感器 电流型生物传感器将生物催化反应产生的响应信号转变为电流信号输出， 输出电流大小和待测物质浓度存在一定关系。常用的参比电极包括c l a r k 溶氧电 极、h 2 0 2 电极及燃料电池型电极等。电流型电化学传感器是三种电化学传感器 中最易实现、研究最多和应用最广的一种，它为微尺寸范围内电活性物质的测 定提供了一种高灵敏度的方法【帅】。 b o d 生物传感器多为电流型生物传感器。最常见的电流型b o d 生物传感器 的基本原理为：微生物在分解有机物的过程中消耗水中的溶解氧，导致溶解氧 浓度降低，这一信号的变化与样品中b o d 浓度存在一定的线形关系，通过溶解 氧浓度变化的检测，可以得到水样的b o d 值【4 ”。适用于b o d 生物传感器生物敏 感元件的菌种有：e s c h e r i c h i a 疗【4 2 】，p s e u d o m o n a s p g t d 0 4 2 ，k l e b s i e l l as p 4 3 ， s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 4 4 ，t r i c h o s p o r o nc u t a n e u m 4 5 1 ，b a c i l l u ss u b t i l i s 4 5 ，4 6 等。 由单一菌种所制成的敏感元件具有性能稳定、重现性好等优点，大多数b o d 生 7 第1 章绪论 物传感器均为单一菌种传感器。近年来很多学者开始采用混合菌种制作b o d 传 感器生物膜，以克服单一菌种对有机物的广谱性较差的缺点【4 5 ，钥。 用于乙醇和葡萄糖测定的电流型全细胞传感器是除b o d 生物传感器外的第 二大类电流型微生物传感器【耜】。近年来，随着环境污染问题的日益严重，电流 型全细胞生物传感器环境监测技术逐渐受到人们的重视，如许多研究者利用电 流型全细胞传感器进行痕量有机磷农药检测 4 9 ，删，酚类物质测定【5 1 5 2 l ，阴离子表 面活性剂【5 3 】等。有关电流型全细胞生物传感器研究和应用情况见表1 2 。 袭1 2 电流型全细胞生物传感器研究情况 t a b 1 2a m p e r o m e t r i cw h o l e - c e l lb i o s e n s o r s 测定参数徽生物种类 检测限漶定范围电极种类 妻盏 乳酸 维生素 b l 葡萄糖 木糖o 5 m m 小于1 m m 5 0 x l 矿 一l o - l p m 小于6 m m o 5 2 0m m 石墨糊电极 【5 4 】 溶氧电极 【5 5 】 石墨糊电极 【5 6 】 溶氧电极 【5 7 】 撩笏p s e u d o m 洲o n a sp 翠p b 羹, 勒戮 一 电极眇， p p b 对氧磷m w 妇印0 1t t m 对氧磷 一 溶氧电极 【5 0 】 翳誊篙p p s 。e 砌u d o m 。o s n m a 日 一 点。甲0 基5 - 6 对0 硫溶氧电极【5 l 】 物、甲基 p “删b d s mu m ；甲基对硫 ”“。” f 5 1 1 对硫磷 5 0 0 2 6 磷0 3 - 2 5 州 型塑茎坠丝! 竺! 丝翌：! ! 业=整墨皇堡 【：翌 1 2 1 2 电导型微生物传感器 电导型传感器是一种建立在双电层理论上的传感技术，其通过检测溶液的 电导率实现对离子浓度的测定。从原理上讲，电导型传感器应该是最灵敏的电 化学检测方法，但由于溶液中电导的测量不是特异性的，通常溶液中都会有其 它的离子存在，从而产生很高的背景信号，这就决定了电导型传感器更多是适 用于对迁移速度快的无机离子和某些有机物质进行分析【帅】。如p c j r o a c h 等人 唧】研制了一种能够测定丙烯腈的电导型全细胞传感器。他们将砌d 面c d c c 瓣t u b e r 一一一一一一洲一 第1 章绪论 n c i m b4 0 7 5 7 固定于细胞二甲基硅树脂海绵中，在腈水解酶催化作用下，丙烯 腈转化为丙烯酸铵引起溶液电导值变化，在2 - 5 0 r a m 范围内，丙烯腈浓度和输出 电导信号呈现线性关系，可依此为丙烯腈进行定量分析。 1 2 1 3 电位型微生物传感器 电位型传感器主要使用离子选择型电极，其核心部件是传感器的离子选择 性敏感膜，它能对溶液中被测离子进行选择性响应，从而引起膜电位的变化， 当达到平衡时，膜电位的变化与被测离子活度的关系符合能斯特( n e m s t ) 方程， 即电位差与溶液中待测离子活度的对数在一定范围内呈线性关系，通过此关系 可实现对待测物质的检测删。电位型微生物传感器的响应时间、检测下限等性 能均与基础电极的性能密切相关。 常见离子选择型电极包括p h 电极、铵离子电极和氯离子电极等。有些微生 物传感器将携带有机磷水解酶基因的e c o l i 基因工程菌和p h 电极结合，通过测定 有机磷农药水解过程产生的氢离子浓度间接测定有机磷农药的浓度 6 0 ，6 1 l 。还有 研究者g p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 司定于聚四氟乙烯膜上并附于氯离子电极表面 制成电位型微生物传感器，用于测定地下水或工业废水q a t c e 含量懈鲫。表1 3 为其它基于不同电极的电位型全细胞生物传感器的研究情况。 表1 3 电位型全细胞生物传感器研究情况 t a b 1 3 p o t e n t i o m e t r k w h o l 啡l i m o 蛐绷 测定参数 徽生黧萎细胞 检测限溯定范围电极种类 妻盏 半胱氨酸 蔗糖 金属离子的毒性 t r i c h o s p o r o n j i r o v e c i iy e a s t s a c c h a r o m y c e s c e r e v 搿l o e 心脏细胞 o 2 1 5 0 m g la 9 2 s 电极 3 8 】 l x l 0 - 5 3 x 1 0 - 2m 氧电极【“】 一一 6 5 】 1 氯丁烷： 卤代碳氢化合物尉台i 篱髻；鬈p ；毳芝秦 一 0 0 4 m g l 离毛黧性【6 6 】 电极 1 乙醇誓翁：雾；翟了 一o 0 2 5 0 m m氧电极 【6 7 】 1 2 2 光学全细胞微生物传感器 光学生物传感器具有结构紧凑、适应性广、抗噪等优点，主要有生物发光 传感器和荧光传感器两类。 9 第1 章绪论 1 2 2 1 生物发光类传感器 国内外采用发光菌生物传感器用于污染物急性毒性分析的研究比较多。应 用发光菌进行生物毒性分析有显著优点：操作无需严格无菌；发光变化先于基 本代谢变化因而对毒性更为敏感；与光电检测手段相结合，自动化程度高、结 果客观、人为误差少。闰鹏等人呻】以明亮发光杆菌为生物识别元件，以硅光电 二极管作为细胞光信号和电信号转换的敏感元件，构建了细菌发光传感器，分 别对苯酚、乐果、乙醛、h 9 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 等污染物急性毒性进行快速检测研 究。张理兵等人御】以明亮发光杆菌作为指示物制作了光纤式发光菌传感器，测 得勐”的e c 5 0 大约为5 0 6 m g l 。 随着基因工程技术的发展，大大克服了天然发光菌的种种限制，重组发光 茵应用于各种金属、化学毒物分析的研究和报道日益增多。发光菌所携带的l u x 基因按照其功能可分为”l i g h to n 和“l i g h to f f 两种模式u o 。“l i g h to n 模式将目的 基因和妇基因融合构成重组体，当目的基因对应的特异化学物质存在时，l u x 基 因将被一同表达；重组体是否发光和环境中是否含有该物质相关。“l i g h to f f 模 式中则延用天然发光菌遇毒性物质发光减弱的特点，将l u x 基因和有机体存活状 态下始终表达的启动子融合，构建的指示菌发光的强弱能反映污染物毒性的强 弱。目前，现有的发光细菌生物传感器基本基于以上两种原理。如a b d - e 1 h a l e e m d 等人r 7 1 】将从工业废水中筛选t p , 的a c i n e t o b a c t e rs p d f 4 作为宿主，导入l u x 基因 构建基于“f i g h to f f 模式的基因工程发光菌生物传感器，用于测定废水中z n 、c d 、 f e 、c o 、c r 等金属的生物毒性。 生物发光传感器除了能够进行重金属生物毒性分析外，还可用于测定重金 属的生物有效性 7 2 - 7 5 1 。c t i b a z a r w a 等人【7 6 1 利用r a l s t o n i ae u t r o p h ac h 3 4 的 p m o l l 5 5 0 质粒内的c n r y x h 调控基因结合i u x c d a b e ，建立以r a l s t o n i a e u t r o p h aa e 2 5 1 5 为宿主细胞的全细胞生物传感器，用来测定钴和镍的生物利用 度。s i s k ot a l l r i 咖e n 等旧将质粒p 1 2 5 8 内的c a d a 抗性基因和m 蹦因融合，分别 建立以s t a p h y l o c o c c u sa u y e l & $ r n 4 2 2 0 和b a c i l l u ss u b t i l i sb r l 5 1 为宿主的生物传 感器，通过金属存在和不存在情况下发光强度的对比，考查金属浓度及生物利 用情况。 生物发光传感器还可用于水体营养盐的监测嗍。g i l l o r 和m b e u n k u i 等分别 将g l n a ：l u x 和n b l a ：l u x 基因融合a , s y n e c h o c o c c u ss p 和s y n e c h o c y s t i ss p 细胞构建 生物传感器用于检测水中的有效氮。s y n e c h o c o c c u sg l n a 报告基因对氨、硝酸盐、 1 0 第1 章绪论 亚硝酸盐及有机氮都很敏感：而s y n e c h o c y s t i sn b l a 报告基因主要应用于硝酸盐的 检测。g i l l o r 等人还研制了一种能够测定磷生物有效性的传感器，所使用的生物 敏感元件是融合= f f p h o a ：l u x 基因的s y n e c h o c o c c u ss p 菌株。 1 2 2 2 荧光生物传感器 近年来，随着对绿色荧光蛋白g 加基因研究的深入，利用绿色荧光蛋白构建 荧光生物传感器的研究迅速发展。由于曲基因良好的稳定性，荧光生物传感器 也比较稳定。有研究将p p n a r g f p 质粒中硝酸盐还原酶n a r g r i i 操纵予( p n a r ) 和罟勿基因融合，再将质粒转化a , e s c h e r i c h i a c o l i 内构建基因工程菌生物传感器， 用于环境水样中硝酸盐含量的测定，该法能避免水中其他电子受体的干扰 7 s q 。 还有研究者利用重鲑 e s c h e r i c h i ac o t i q l g f p 基因的d n a 损伤表达来测定目标物的 浓度7 9 】。 另一类利用藻类细胞作为生物敏感元件的荧光生物传感器能进行水体中毒 性物质的测定，其原理为：藻类在受到某些毒性物质刺激时，其光合作用电子 传递过程受到抑制，光合活性明显下降，导致藻液荧光产量的增加，通过测量 藻液中荧光强度的变化判定水中毒性物质的综合毒性。h a n hn g u y e n - n g o c 等【明 采用溶眩凝胶法固定绿藻c h l o r e l l av u l g a r i s 细胞，构建荧光微生物传感器检测 水中敌草隆的毒性和含量。m a n i n a e s s e n s 等人 8 1 】研制的光纤荧光生物传感器 原理也与之类似。 1 3 全细胞微生物传感器在污染物急性毒性分析中的应用 近年来，全细胞生物传感器在环境监测及水质毒性分析中的应用成为生物 传感器研究领域的一大热点。根据微生物的种类分类，目前常用于污染物急性 毒性分析的主要有以下几类：发光微生物传感器【8 ”、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 传感器i s 3 、埃希氏菌属( e s c h e r i c h i a ) 传感器i s 4 , s s 、蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) 与 藻类( a l g a e ) 传感器【8 l s o q 、酵母菌传感器r 8 7 , s s 与活性污泥( a c t i v a t e ds l u d g e ) 传感器等隅9 9 0 。急性毒性的分析对象包括有机物( 如，p a h 9 1 - 9 3 1 、氯酚等) 、 重金属( 如z n 2 + 、c u 2 + 等) 及实际水样。使用全细胞生物传感器进行生物毒性分 析优点包括：( 1 ) 检测范围宽、成本低、适用于大批量化合物和样品的初筛； ( 2 ) 灵敏度高、响应快、能在短时间内完成测试；( 3 ) 能实现快速在线连续 监测。随着人类生活、生产活动释放到环境中的污染物种类和数量的增加，及 第1 章绪论 污染物对生态环境和人类健康日趋严重的影响，具备在线快速预警和检测污染 物生物毒性功能的全细胞微生物传感器必将发挥越来越重要的作用。 1 4 本论文主要研究工作 随着生物传感器研究的深入，使得实现准确、快速和连续在线监测废水综 合毒性成为可能。 近年来，一种基于氧化还原介质的新型生物传感器c d i s e a s e 日益受到 人们的青睐。它可广泛