（环境科学与工程专业论文）表面增强拉曼技术检测环境中病原微生物的研究.pdf

d e t e c t i o na n dd i s c r i m i n a t i o no fp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m si nt h e e n v i r o n m e n tu s i n gs e r s b y l vp u b e ( h e n a nn o r m a lu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e r0 fs c i e n c e l n e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l 0 f h n n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rg o n gj i - l a i m a y ，2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成臬。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：吕嵌e t 期：如年f 月5e t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密曰。 ( 请在以上相应方框内打“v ”) 作者签名：吕莨e t 期：z 。f f 年月3e t 导师签名：象饮隶 日期：矽，f 年月岁日 摘要 表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，简称s e r s ) 是 一种特殊的表面光学现象，灵敏度高，选择性强，特异性好，在粗糙表 面能够增强吸附分子的拉曼信号，因此已被广泛应用于医学，生物化学， 微生物学，环境，考古等多个领域。随着生物技术的发展及微生物污染 的严重化，利用s e r s 技术检测病原微生物的研究也越来越多。 本论文的研究内容和结论主要包括以下几个方面： 1 利用柠檬酸钠作为还原剂，对传统制备银溶胶的方法加以改进合成 纳米银颗粒；然后在制备的银溶胶里加入氯金酸和盐酸羟胺溶液制备银 核金壳纳米颗粒；利用两种不同的晶种子还原法制备纳米金颗粒；对这 三种纳米颗粒进行t e m 表征，并以对巯基苯甲酸作为标记分子研究它们 的s e r s 活性，结果表明银核金壳的拉曼信号要比银溶胶和金溶胶的信号 强，不同晶种子法制备的金纳米颗粒拉曼光谱和尺寸都有差别。 2 利用对巯基苯甲酸作为活性分子，制备a g a u 壳型s e r s 纳米颗粒 核酸探针，选取嗜肺军团菌m i p 致病基因片段，采用“三明治结构检 测嗜肺军团菌。通过两次杂交测拉曼信号，实验发现杂交样品有良好的 拉曼信号而空白样品没有信号。 3 利用柠檬酸钠作为还原剂，对传统制备银溶胶的方法加以改进合成 纳米银颗粒，以它作为基底，并在“w h o l e - o r g a n i s mf i n g e r p r i n t i n g 技术 的基础上，以整个大肠杆菌和志贺氏菌为研究对象，通过和纳米银颗粒 混合制片，利用表面增强拉曼效应检测并区分大肠杆菌和志贺氏菌。结 果表明，未与纳米银颗粒混合的大肠杆菌和志贺氏菌没有明显的拉曼信 号，而与纳米银颗粒混合后拉曼信号得到增强，有明显的拉曼信号，并 且两种菌的拉曼信号有明显的区别。然后做了重现性实验，拉曼信号重 现性良好。实验能够鉴别大肠杆菌和志贺氏菌，可以为检测病原体研究 及实际应用提供依据。 关键词：表面增强拉曼散射；嗜肺军团菌；大肠杆菌：志贺氏菌；银溶 胶；金溶胶；银核金壳纳米颗粒 a b s t r a c t s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) i sas p e c i a ls u r f a c eo p t i c a l p h e n 0 1 m e n o n i ts h o w sh i g hs e n s i t i v i t y ，s e l e c t i v i t y a n ds p e c i f i c i t yf o r d e t e c t i n gt h em o l e c u l e sa b s o r b e do nt h es u r f a c eo ft h em e t a ls u b s t r a t e sa n d p r e s e n t sp l e n t i f u lr a m a ni n f o r m a t i o no ft h em o l e c u l es t r u c t u r e s t h e r e f o r e ， s e r sh a s b e e n w i d e l yu s e d i nm e d i c i n e ，b i o c h e m i s t r y ，m i c r o b i o l o g y ， e n v i r o n m e n t ，a r c h a e o l o g ya n do t h e r f i e l d s w i t ht h ed e v e l o p m e n t o f b i o t e c h n o l o g ya n dm i c r o b i a lc o n t a m i n a t i o n ，d e t e c t i o na n d d i s c r i m i n a t i o no f p a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m su s i n gs e r si sa l s oi n c r e a s i n g t h em a i nr e s u l t s a n dc o n c l u s i o n sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 a c c o r d i n gt oam o d i f i e dl e ea n dm e i s e lm e t h o d ，t h ei n f l u e n c eo f r e d u c i n ga g e n t sd o s a g eo nt h es i z ea n dd i s t r i b u t i o no fc o l l o i d a ls i l v e rw a s i n v e s t i g a t e d t h e n a d d e d g o l d c h a l o r i d e a c i da n d h y d r o x y l a m i n e h y d r o c h l o r i d e s o l u t i o nt o p r e p a r ea g a u c o r e - s h e l ln a n o p a r t i c l e s ；a n d u s i n gt w o d i f f e r e n tr e d u c t i o nm e t h o do fc r y s t a ls e e d t o p r e p a r eg o l d n a n o p a r t i c l e s m o r e o v e r ，t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p ya r eu s e dt o c h e c kt h es i z ea n ds t a b i l i t y o ft h e s et h r e en a n o p a r t i c l e s w ec h o o s e 4 m e r c a p t o b e n z o i ca c i da s t h ep r o b em o l e c u l e s s e r sa c t i v i t i e so ft h e s e t h r e en a n o p a r t i c l e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er a m a ns i g n a l o fa g a uc o r e s h e l ln a n o p a r t i c l e sw a ss t r o n gt h a nt h er a m a ns i g n a l o f s i l v e rc o l l o i da n dg o l dc o l l o i d t w o d i f f e r e n t g o l dn a n o p a r t i c l e s h a d d i f f e r e n ts i z ea n ds e r ss i g n a l 2 a g a uc o r e s h e l ln a n o p a r t i c l es e r sg e n ep r o b ew a sp r e p a r e d a n d 4 m e r c a p t o b e n z o i e a c i dw a su s e da sr a m a nr e p o r t e r t h e c o r e s h e l l n a n o p a r t i c l es e r sg e n ep r o b ew a su s e df o rt h ed e t e c t i o no fm i pg e n eo f l e g i o n e l l ap n e u m o p h i l a su s i n gs a n d w i c h e d t y p e t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o w e dt h a to b v i o u sr a m a ns i g n a lc a nb eo b s e r v e d i nt h ep r e s e n c eo f t a r g e tp r o b eu s i n ga g a uc o r e s h e l ln a n o p a r t i e l es e r sa sd e t e c t i o np r o b e h o w e v e r ，n os i g n a lc a nb ef o u n di nt h ea b s e n c eo ft a r g e tp r o b e t h e r e f o r e ， g e n ep r o b el a b e l e db ya g a u c o r e s h e l ln a n o p a r t i c l es e r st a g si n t h i s s t u d yp r o v i d e d a p o t e n t i a l m e t h o df o rd e t e c t i o n o f l e g i o n e l l a m 硕士学位论文 p n e u m o p h i l a s 3 c o l l o i d a ls i l v e rn a n o p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e du s i n gs o d i u mc i t r a t ea s r e d u c i n ga g e n t a c c o r d i n g t oam o d i f i e dl e ea n dm e i s e lm e t h o d ，t h e i n f l u e n c eo f r e d u c i n ga g e n t sd o s a g e o nt h es i z ea n dd i s t r i b u t i o no f c o l l o i d a ls i l v e rw a si n v e s t i g a t e d s e r sw a su s e dt od e t e c ta n dd i s c r i m i n a t e e c o l ia n ds h i g e l l as p p b a s e do nt h e “w h o l eo r g a n i s mf i n g e r p r i n t i n g ” t e c h n o l o g y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a te s c h e r i c h i ac o l ia n ds h i g e l l a s p p t h e m s e l v e sh a dn oo b v i o u sr a m a ns p e c t r a ，b u t t h em i x t u r eo ft w o b a c t e r i aa n ds i l v e rc o l l o i dh a do b v i o u sr a m a ns p e c t r a a n dt h er a m a n s p e c t r ao ft w om i x t u r e sw e r es od i f f e r e n tt h a te s c h e r i c h i ac o l ia n ds h i g e l l a s p p c a nb ee a s i l yd i s c r i m i n a t e d t h e nr e p r o d u c i b l ee x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e da n dt h er e p f o d u c i b i l i t yo fe x p e r i m e n t sw a sg o o d t h i ss t u d yc a n d e t e c ta n dd i s c r i m i n a t ee s c h e r i c h i ac o l ia n ds h i g e l l as p p s oi tp r o v i d e st h e b a s i sf o rp a t h o g e n sd e t e c t i o n k e y w o r d s ：s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ；l e g i o n e l l ap 咒e “，竹d p f z 口s ； e s c h e r i c h i ac o l i ；s h i g e l l as p p ；s i l v e rc o l l o i d ；g o l dc o l l o i d ；a g a u c o r e s h e l i v 基于s e r s 技术检测病原微生物的研究 目录 学位论文原创性声明i 学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t 1 i i 附图索引v i i i 附表索引i x 第一章绪论1 1 1 拉曼散射简介1 1 2 表面增强拉曼散射( s e r s ) 的发现2 1 3 表面增强拉曼散射( s e r s ) 的特点3 1 4 表面增强拉曼散射( s e r s ) 的机理4 1 5 表面增强拉曼散射( s e r s ) 活性基底的制备6 1 6s e r s 的主要应用9 1 6 1s e r s 在生物和医学中的应用9 1 6 2s e r s 在免疫学中的应用1 0 1 6 3s e r s 在环境分析中的应用10 1 7 病原微生物的研究进展12 1 7 1 嗜肺军团菌1 2 1 7 2 大肠杆菌和志贺氏菌1 3 1 8 本文的研究工作1 4 1 8 1 研究内容1 4 1 8 2 研究目的及意义1 5 第2 章金银溶胶和银核金壳纳米粒子的研究1 6 2 1 前言1 6 2 2 实验部分1 6 2 2 1 试剂、仪器及样品1 6 2 2 2 溶液的配制1 7 2 2 3 银溶胶的制备1 7 2 2 4a g 核a u 壳的制备( 4 0 - 7 0 n m ) 1 8 2 2 5 金溶胶的合成1 8 v 硕十学位论文 2 2 6 纳米粒子与对巯基苯甲酸的反应18 2 3 结果与讨论1 8 2 3 1t e m 表征1 8 2 3 2 纳米颗粒的s e r s 活性1 9 第3 章核壳型s e r s 纳米探针检测嗜肺军团菌的研究2 3 3 1 前言2 3 3 2 实验部分2 3 3 2 1 靶基因设计2 3 3 2 2 核壳型s e r s 标记物的制备2 4 3 2 3 镀金玻片的洗涤2 4 3 2 4d n a 杂交实验2 4 3 2 5 空白实验2 4 3 2 6s e r s 信号的测定2 5 3 3 结果与讨论2 5 3 3 1 实验原理分析2 5 3 3 2s e r s 信号分析2 5 3 4 本章小结2 7 第4 章s e r s 技术鉴别大肠杆菌和志贺氏菌的研究2 8 4 1 前言2 8 4 2 实验部分2 8 4 2 1 洗涤试验所用器皿2 8 4 2 2 银溶胶的合成2 9 4 2 3 硅片的切割与洗涤2 9 4 2 4 细菌的购买及处理2 9 4 2 5 细菌的处理2 9 4 2 6 纳米银颗粒的处理2 9 4 2 7s e r s 测定样品的制备3 0 4 2 8 空白实验3 0 4 2 9s e r s 信号的测定3 0 4 3 结果与讨论3 0 4 3 1 细菌的s e m 表征3 0 4 3 2 细菌和纳米银颗粒混合的t e m 表征31 4 3 3s e r s 光谱分析3 1 基于s e r s 技术检测病原微生物的研究 4 3 4 硅片上的重现性实验3 4 4 4 小结3 5 第5 章芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的培养及利用s e r s 技术初步检测研究 3 6 5 1 前言3 6 5 2 实验部分3 6 5 2 1 细菌的培养3 6 5 2 2 银溶胶的制备3 7 5 2 3s e r s 样品的制备3 7 5 2 4s e r s 信号的测定3 7 5 3 结果与讨论3 7 5 3 1 细菌的s e m 表征3 7 5 3 2 细菌的s e r s 信号分析3 8 5 4 月、结3 9 结论4 0 参考文献4 2 附录a攻读学位期间所发表的学术论文目录5 1 致谢5 2 v 硕 ：学位论文 附图索引 图1 1 拉曼散射和瑞利散射能级示意图2 图2 1 银纳米颗粒，金纳米颗粒及银核金壳的透射电镜照片1 9 图2 2 三种纳米颗粒与对巯基苯甲酸反应后的s e r s 信号图2 0 图2 3 加入1 0 m l 超纯水制得的银核金壳纳米颗粒的s e r s 信号图2 1 图2 47 0 n m 金颗粒的t e m 表征图2 2 图3 1s e r s 纳米探针检测嗜肺军团菌的实验原理图2 5 图3 2 核壳型s e r s 纳米探针与嗜肺军团菌特定基因发生反应后及空白 实验的拉曼光谱图2 6 图3 3 基因杂交后的s e r s 信号图2 6 图4 1 大肠杆菌的s e m 图图4 2 志贺氏菌的s e m 图3 0 图4 3 大肠杆菌和纳米银颗粒混合后的t e m 图3 1 图4 4 志贺氏菌和纳米银颗粒混合后的t e m 图31 图4 5 纳米银和两种菌混合后及空白实验的拉曼光谱图3 2 图4 6 大肠杆菌不同三明治结构的s e r s 光谱图3 3 图4 7 银膜志贺氏菌银膜结构的s e r s 光谱图3 3 图4 8 大肠杆菌重现性拉曼光谱图3 4 图4 9 志贺氏菌重现性拉曼光谱图3 4 图5 1 五种细菌的扫描电镜图3 8 图5 2 银膜五种菌的s e r s 光谱图3 9 v i 基于s e r s 技术检测病原微生物的研究 附表索引 表2 1 实验所用试剂1 6 表2 2 实验所用仪器1 7 表4 1 牛肉膏蛋白胨培养基的配制2 9 表5 1 培养基的配制3 7 i x 基于s e r s 技术柃测病原微生物的研究 1 1 拉曼散射简介 第一章绪论 1 9 2 8 年印度物理学家r a m a n 等1 1 】以棱镜、汞灯和照相底板作为实验 工具，以苯液体为试样，发现了一种比入射波长短或长的散射现象，称 为拉曼散射，从而证实了1 9 2 3 年德国物理学家s m e k a l i z 】从理论上的预测。 拉曼散射是由于物质对光的非弹性散射引起的。当光子作用于分子 时，因为碰撞方式的不同，会有多种散射形式出现。根据光散射前后有 无能量变化，散射方式分为瑞利散射和拉曼散射；我们利用拉曼光谱效 应的量子理论即光量子和分子的碰撞来解释散射现象：频率为v o 单色光 的光子能量为h v o ，h 为普朗克常数，当光子h v o 和分子作用时，有可能 发生弹性和非弹性两种碰撞；当频率为v o 的入射光照射在分子上后，由 于受到能量为h v o 的入射光子的激发，原来处于基态e o 的分子跃迁到一 个受激虚态，虚态不稳定寿命极短而立即辐射跃迁回到基态e o ，此过程散 射光与入射光的频率相等，属于弹性的瑞利散射【3 1 。拉曼散射是光子和 散射物质中的分子相互作用时发生了能量改变，频率发生变化的散射。 拉曼散射的量子理论能级图如图1 1 所示。在非弹性碰撞过程中，分子和 光予之间发生了能量的交换。光子的运动方向和频率皆发生了变化，光 子既能改变分子的运动方向，还能将自身的一部分能量传递给分子，转 变为分子的转动能或振动，另一种可能是光子从分子的振动或转动得到 能量【3 ，4 】。在这两种过程中，光子的频率都发生变化。光子得到能量增加 为h ( v o + v ) 的过程对应于频率增加的反斯托克斯拉曼散射，在瑞利线的高 频一侧；光子失去能量减少为h ( v o v ) 的过程对应于频率减小的斯托克斯 拉曼散射，在瑞利线的低频一侧【4 1 。拉曼散射光强只是瑞利光强的百分 之几，所以，拉曼散射光的检测需要高分辨率的单色仪及线宽窄的光源。 当改变激发光的波长使之接近或位于散射分子的电子吸收光谱带内时， 某些拉曼带的强度将大大增强，这种现象称为共振拉曼效应( r e s o n a n c e r a m a ne f f e c t ) 1 5 - 7 1 。 硕十学位论文 i i i = = = 目= | l l 目目号_ l 目自自目_ e e _ _ _ - _ _ e = 目= = 目自目目_ = = = i 而 局 一一 虚态自 l i h 码h ( 删 m 卜 i i h j 振动朗 红外吸收拉曼放射 瑶利歇射拉曼散射 新托克新线 反斯托克蜥线 图1 1 拉曼散射和瑞利散射能级示意图 近年来，建立了以拉曼效应为基础的拉曼光谱分析法。红外与拉曼 两种光谱技术互补，能够提供分子的结构信息，拓宽了表面科学的研究 方法。拉曼光谱测量时快速、简单、准确、性能可靠；而且样品制备简 单，一般不破坏样品，可以进行_ 无损检测；水对光谱的干扰小，所以能 直接用于水溶液的测量，并且可以方便地改变激发光的波长等优点f8 1 。 但是通常的拉曼光谱技术的检测易受荧光干扰，灵敏度很低，空间分辨 受衍射极限的限制，因而他不适合于表面分析，在单分子检测至痕量检 测和表面科学等领域的应用相对较少1 9 , 1 0 l 。随着激光技术的问世和光电信 号转换技术的提高，计算机的应用与纳米技术的发展，开始以激光作为 拉曼光谱的激发光源，使得拉曼效应太弱、检测灵敏度低的弱点被逐渐 攻克；拉曼光谱分析法的应用更为方便，技术也有了很大提高【11 i 。表面 增强拉曼光谱技术，针尖增强拉曼光谱技术，共振拉曼光谱技术等其他 拉曼技术的出现使得拉曼光谱技术在各个领域的应用更为广泛。 1 2 表面增强拉曼散射( s e r s ) 的发现 自1 9 2 8 年被发现和证实后，因为拉曼光谱的检测灵敏度非常低，拉 曼光谱的发展及应用远不如后来发展的红外光谱，它的用途往往是作为 红外光谱的补充用来鉴别有机化合物的结构，官能团以及构象，而在表面 科学方面的应用微乎其微，一直以来没有成为有效的实验室工具。而直到 7 0 年代初，采用激光作为其激光发射源之后，这一分子振动光谱技术才 成为了研究各种物质分子结构与微观结构的重要工具。即使如此，对于 表面或是界面分子的结构及性质的研究分析还十分困难，主要是因为参 与表面过程和反映的物种常常仅有单分子层，甚至是亚单分子层，而分 子的拉曼散射是二次光子过程，分子的微分拉曼散射界面通常仅有 1 0 吃，c m 。z s r d i l 引。因此，拉曼光谱在单分子检测方面的应用受到很大的限 制。 2 摹于s e r s 技术检测病原微生物的研究 1 9 7 4 年，f l e i s c h m a n n 等将银电极采用电化学氧化还原粗糙化处理后， 成功地获得了吡啶吸附在粗糙银电极表面的高质量拉曼光谱，他们给出 了这样的解释一电化学粗糙化处理后电极表面积增加，所以可以检测到 更多的吸附分子f l 引。v a nd u y n e ，和m g a l b r e c h t 等人在1 9 7 7 年通过研 究发现，即使银电极表面仅仅是经过十分轻微的粗糙化处理，表面积大 约增加了10 倍，同样也可以获得很强的表面拉曼光谱。经过计算，分子 拉曼信号增强了约1 0 5 1 0 6 1 1 4 , 1 5 l 因此，研究人员认为电级粗糙化的表面 必然存在某种物理效应，这种效应称为表面增强拉曼散射 ( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e r s ) ，所得光谱成为表面增强拉 曼光谱( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y s e r s ) 。这种表面增强现 象不仅给电化学家带来了希望，而且也吸引了理论物理，固体物理，化 学，界面，催化，光谱学等方面的研究人员，使其实际应用和理论研究的 开展空前活跃。由于s e r s 具有很高的灵敏度，能够检测到吸附在金属表 面的单分子层和亚单分子层的分子，又能给出表面分子的结构信息，被 认为是一种很好的表面研究技术。近年来，人们又对金属表面的粗糙度 对拉曼增强起何种作用及其缘由，激发能量和s e r s 强度之间的关系，基 底不同增强效果的差异及s e r s 的增强机理等问题从实验和理论上进行 了一系列研究。 1 3 表面增强拉曼散射( s e r s ) 的特点 从1 9 7 4 年s e r s 发现至今，经过大量的实验和理论研究，人们归纳 得出了s e r s 效应的一些特点1 1 6 ，1 7j ： ( 1 ) 大量分子都能被检测到它们的s e r s 信号，但因所用的s e r s 基 底不同，以及分子与金属的作用方式不同等因素，各自的增强因素并不 相同，一般物理吸附的分子的增强因子较低。 ( 2 ) 作为s e r s 基底的前提条件是表面进行粗糙化处理或表面具有纳 米尺度的粗糙度。不同的表面方法获得的表面的活性不同，粗糙度不同 可使增强因子从1 0 6 到1 0 1 4 ，吸附在粗糙金、银、铜等表面的分子的拉曼 信号强度要比普通分子增加1 0 4 1 0 7 倍【18 1 。 ( 3 )s e r s 具有极高的表面灵敏度，吸附在金属表面的第一层分子可 获得最大的增强。影响s e r s 强度的因素主要有基底材料的种类、表面形 貌、物理性质及吸附分子的相互作用【l9 1 。 ( 4 ) s e r s 的强度与激发光的入射角度有关，对不同金属基底和不同 探针分子的影响差不多相同。一般来说照射在样品上的入射光与检测的 拉曼散射光之间的夹角为o 。、9 0 。和1 8 0 。为宜【20 1 。s e r s 谱峰的相对 3 硕l ：学位论文 强度以及频率和分子本体的常规拉曼光谱存在较大的差别；在电化学体 系中，s e r s 谱峰强度随电位变化曲线往往出现一极值，并且该极值可能 随激发线波长的变化而发生位移。 ( 5 ) s e r s 并不是简单的共振效应引起的，普通的拉曼光谱中谱带的 退偏比在o o 7 5 之间，全对称振动模式的拉曼光谱谱带的退偏比接近于 o 【2 。在常规粗糙化的金属表面，s e r s 是完全退偏振的，而在单个的纳 米粒子或纳米管，线的表面s e r s 谱峰可能是偏振的【2 2 】；拉曼定律在s e r s 效应中被放宽，许多拉曼非活性的振动模式也在s e r s 光谱中检测的到，并 且s e r s 谱峰强度随激发线波长的变化偏离正常拉曼散射强度。 ( 6 ) 在具有s e r s 效应的粗糙表面欠电位沉积极少量的非s e r s 活性 金属如p b ，t i 等会导致s e r s 效应的减弱和淬灭，s e r s 活性位也可能随 外界条件，如电极点位，升降温等过程的变化而不可逆的消失，但经过再 次粗糙后可重新获得s e r s 活性。 ( 7 ) s e r s 光谱实际上是s e r s 谱峰与荧光导致的强的连续背景的叠 加，在一定范围内，该背景强度随着波数增加而降低。 ( 8 ) s e r s 的强度在单分子吸附的情况下与覆盖度呈非线性关系，不 是所有吸附在衬底基底表面的分子都具有增强拉曼作用，只有吸附在衬 底表面某些位子的分子才能产生强的表面拉曼效应。s e r s 强度还有分子 离金属基底表面的距离有关，会随着距离的增加而迅速降低。 ( 9 ) s e r s 效应可在从紫外到可见到近红外很宽的激发光波长区间获 得，并且s e r s 效应可调谐，如表面纳米尺度与激发光频率间的调谐，电 化学调谐增强效应等。自s e r s 发现以来，已经在众多不同的界面和介质 中观察到s e r s 效应，如电极一电解质界面、金属一气相界面、溶胶一液相 界面、固一固界面、半导体一液相界面等1 23 。虽然s e r s 效应得到普遍应 用，但其应用也受到了诸多限制：受到荧光、样品的热效应等干扰因素 使其定量分析存在困难；基底的重现性和稳定性差，在一定程度上阻碍 了s e r s 技术的应用；s e r s 对检测对象有一定的要求，检测分子需含有 芳环，杂环，氨基，羧酸基等具有拉曼活性的基团之一【24 1 。 ， 1 4 表面增强拉曼散射( s e r s ) 的机理 s e r s 机理的研究一直存有争议，直到现在还没有完全解决。目前普 遍认为存在物理增强( 电磁增强，e m ) 和化学增强( 非电磁增强，c h e m ) 两种机理 2 5 , 2 6 , 2 7 】，其中物理增强机理的研究较为流行电磁场机理( e m ) 是一种物理模型，它认为具有一定表面粗糙度的类自由电子金属基底的 存在，使得入射激光在表面产生的电磁场较大地增强，由于拉曼散射强 4 基于s e r s 技术检测病原微生物的研究 度和分子所处光电场强度的平方成正比，因此极大地增加了吸附在表面 的分子产生拉曼散射的几率，从而提高检测到的表面拉曼强度1 2 8 , 2 9 l 。电 磁场增强机理的模型主要有表面等离子体共振( s u r f a c ep l a s m a r e s o n a n c e ) ，避雷针效应( l i g h t n i n gr o de f f e c t ) ，镜像场作用( i m a g ef i e l d e f f e c t ) 等几种在这些物理模型中，表面等离子体共振模型在理论和实验 上都研究得比较多 3 0 , 3 1 l 。该模型认为，当光照射在粗糙化的金属基底表 面时，金属表面的等离子体被激发到高的能级后，然后和光波的电场藕 合，并发生共振效应，使得金属表面的电场增强，进而产生增强的拉曼 散射至今为止能产生表面等离子体共振的金属主要有碱金属以及贵金属 金、银和铜等自由电子金属，这些金属的表面增强因子和金属表面本身 的光学性质、表面粗糙颗粒的密度和尺寸等有关，而且入射光子的能量 也可影响到等离子体共振的产生。这类模型不需要吸附分子和金属基底 之间因为化学作用成键，但是因为金属表面局域电场的增强使s e r s 信号 异常，因而没有办法具体说明不同吸附分子产生的s e r s 信号的差异，因 此一般只能用来解释为什么只有在粗糙的金、银和铜表面才能获得较好 的表面增强拉曼光谱1 3 引。 在研究过程中发现还有很多无法用电磁场增强模型来合理解释的实 验现象，如：1 探针分子不同增强效果不同。例如在相同的实验条件下， 拉曼散射截面几乎相同的二氧化碳和氮气的拉曼光谱强度有很大差别， 增强因子相差2 0 0 倍1 3 3 , 3 4 】。2 分子以多层连续吸附到金属基底表面时， 基底表面第一层分子的s e r s 强度总是要比其他几层中分子的s e r s 信号 强1 0 0 倍以上【35 1 。3 许多实验中，化学吸附与s e r s 效应密切相关。只 有在粗糙金属表面吸附了分子，才能产生非常大的拉曼散射增强效果， 因为只有两者接触才能够发生电荷转移。例如在研究表面增强拉曼散射 强度与吸附分子在金属基底表面的覆盖度的关系时发现，只有在覆盖度 达到一定程度时，吡啶分子才开始通过n 原子上的孤对电子化学吸附到 基底表面【3 6 】。4 一些实验表明，不是所有吸附在增强基底表面的分子都 能产生s e r s 信号，只有少数吸附在基底表面某些被称为活性位点上的分 子才有较强的s e r s 效应【37 1 。5 某些体系中，s e r s 强度都会随着电极电 位的变化而出现一个最大值，而且该最大值会随激发光波长的变化而位 移。6 s e r s 谱峰强度不与激发光频率的四次方成正比时，吸附取向的变 化和覆盖度都不会影响拉曼信号强度【3 引。7 s e r s 谱与普通拉曼光谱相比， 部分谱峰的相对强度会发生明显变化。研究表明当吡啶分子吸附在金属 基底表面时，它的四个全对称振动膜的谱峰强度都得到了增强1 3 9 j 。 因此说明除了物理增强效应以外，必然还存在着其他的增强效应。 5 硕十学位论文 s e r s 科学家们又提出了许多模型，如主要研究金属表面与吸附物种作用 以及成键的化学增强机理。化学增强主要认为吸附分子和金属基体表面 形成了化学键，两者之间的吸附是化学吸附，增强因子可达1 0 0 左右1 40 1 。 所提出的化学增强模型有活位模型和电荷转移模型等。这两种模型分别 依靠金属表面存在的“活位、“增原子 产生增强效果，都表现为短 程效应。而电荷转移模型较受人关注。电荷转移模型认为：当一分子被 吸附到金属基底表面时，能产生新的激发态，形成新的吸收峰。当金属 表面受到波长合适的激发光照射时，电子就从金属的费米能级附近共振 跃迁到吸附分子上，或者从吸附分子共振跃迁到金属上，因而改变了分 子的有效极化率，从而产生了s e r s 效应。至今还没有一个完善的理论可 以用来解释s e r s 技术所有的实验特性，但是现在大部分的学者认为这两 种因素在一定时候可能同时起作用，它们对表面增强拉曼散射效应产生 的相对贡献随体系的不同而不同，因此如何区分两者的贡献率是s e r s 研究所面临的难题。 1 5 表面增强拉曼散射( s e r s ) 活性基底的制备 s e r s 基底的制备一直都是s e r s 技术最重要的研究领域，随着s e r s 技术的发展，其应用越来越广泛，如何制备出重复性好而且具有合适粗 糙度的纳米结构表面获得高强度的s e r s 信号是实验上亟待解决的难题。 s e r s 基底应该具有稳定、制备方法简单、实用方便、便于储存、表面增 强拉曼作用较好等优点1 2 2 ，4 1 1 。新型表面增强拉曼散射基底的制备一直是 拉曼领域研究的重点之一。基底制备方法的发展不仅能够拓宽s e r s 技术 的应用范围，而且能够为s e r s 理论的研究提供理想的模型。现有的