（材料学专业论文）化学法在钛基体上制备牛血清蛋白羟基磷灰石复合涂层.pdf

中文摘要 本文利用化学法，通过在模拟体液( s b f ) q h 添加牛血清蛋i 刍( b s a ) ，在t i 表 面制备牛血清蛋白一羟基磷灰石( h a a s h ) 复合生物活性涂层，即成分、结构等 与骨组织更加接近的仿生复合层，从而提高钛合金表面的生物相容性。 运用扫描电子显微镜( s e m ) 、x 射线衍射仪( x r d ) 、x 射线光电子能谱 ( x p s ) 、电子探针( e d s ) 、透射电子显微镜( t e m ) 和红外光谱( m ) 等检测设备对t i 合金试样在生物矿化后的钙磷生物活性涂层的表面形貌、成分以及物相组成等 进行了分析；分析了牛血清蛋白对涂层生物矿化的影响因素：并在此基础上优 化了制备的工艺；对涂层的生长机理进行了初步的探讨。 研究结果表明：添加牛血清蛋白后涂层更为均匀、平整，且在矿化过程中 牛血清蛋白通过化学作用和羟基磷灰石共沉积到基体钛的表面。模拟体液中添 加牛血清蛋白使复合涂层的晶粒细化。 牛血清蛋白在涂层生物矿化过程中，主要是通过与钙离子结合和与钙磷盐 共沉积到基体t i 的表面。在这个过程中磷主要影响涂层的晶粒取向。改进了模 拟体液以后，涂层晶粒具有了择优取向，得到了纳米级的针片状结构，这种结 构更加接近自然骨，从而可以提高其生物相容性。 根据生物矿化的原理和过程，t i 合金表面牛血清蛋白一羟基磷灰石生物活 性复合涂层的生长过程分晶体成核和晶体生长两个阶段。由于模拟体液中含有 的牛血清蛋白，使临界晶核的尺寸降低，且形核时间延长，使基体表面形核数 量增多。在以后的生长过程中，牛血清蛋白的官能团主要和c a 2 + 结合，从而进 一步影响对p 0 4 3 - 的吸附。最终在试样表面形成羟基磷灰石和牛血清蛋白的复合 目 ，右o 关键词：b s a h a 复合涂层，b s a ，仿生生长，t i a b s t r a c t t h i sw o r ki sm a i n l ya t t r i b u t e dt of o r mb s a h ac o m p o s i t ec o a t i n g so nt h e s u r f a c eo ft ib ya d d i n gb s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) i n t os b f ( s i m u l a t eb o d y f l u i d s ) ，o fw h i c ht h ec o m p o n e n ta n dm i e r o s t r u c t u r ea r em o r es i m i l a rt on a t u r a lb o n e t oi m p r o v eb i o a c o m p a t i b i l i t yo fc o a t i n g s t h ec o m p o n e n t sa n dm i c r o g r a p ho fc a l c i u mp h o s p h a t ec o a t i n g sw e r ei n v e s t i g a t e d b ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，x - r a yd i f f r a c t i o n ( x r d ) ，p h o t o e l e c t r o n s p e c t r o s c o p y ( x p s ) ，t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( t e m ) ，x - r a y s p e c t r o s c o p y ( e d s ) a n d i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ( i r ) a n a l y s e d f a c t o r so fb s a i n f l u e n c i n gm i n e r a lg r o w t ho fc o a t i n g s m o d i f i e dp r o c e s sc o n d i t i o n sa n d t h eg r o w t h m e c h a n i s mo fb s a h ac o m p o s i t ec o a t i n g so nt h es u r f a c eo ft iw a sd i s c u s s e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc o a t i n g sw e r es m o o t h e rw i t hb s ai ns b ft h a nt h a to f w i t h o u tb s a b s aa n dc a l c i u mp h o s p h a t ew e r ei n c o r p o r a t e dc o d e p o s i t e e d0 1 1t h e s u r f a c eo ft i t a n i u mb yc h e m c a li n t e r a c t i o n t h es i z eo fc r y s t a lw a sr e d u c e db e c a u s e o fa d d i n gb s ai n t os b f c a 2 十i o nm a ya f f e c tt h ec o n f o r m a t i o n a ls t a b i l i t yo ft h e s eb s ai ng r o w t hp r o c e s s a n dp h o s p h o n a t eg r o u p sm a ye f f i c i e n ti nr e g u l a t i n gc a l c i u mp h o s p h a t ec r y s t a l l i z a t i o n a n d g a i n e dc o a t i n g sw i t hp r e f e r r e do r i e n tc r y s t a la tt h es a m et i m er e d u c e d t h es i z eo f c r y s t a lw h i c hw i l li m p r o v eb i o c o m p a t i b i l i t yo fc o a t i n g sa f t e rm o d i f y i n gs b f a c c o r d i n gt ot h et h e o r ya n dp r o c e s so fb i o m i m e t i cm i n e r a l i z a t i o n ，t h eg r o w t h p r o c e s so fb s a h ac o m p o s i t ec o a t i n go nt h es u r f a c eo ft ic o u l db ed i v i d e di n t ot w o s t a g e s i e c r y s t a ln u c l e a t i o na n dc r y s t a lg r o w t h b e c a u s ew i t hb s a i ns b f ，c r i t i c a l n u c l e u ss i z ew a sr e d u c e 也g r o w i n gt i m ew a sd e l a y e da n dq u a n t i t yo fn u c l e u sw a s i n c r e a s e d b s ai n t e r a c t e dw i t hc a 十p r i m a r i l yt h e na h s o r p e dp 0 4 p f i n a l l yb s a h a c o m p o s i t ec o a t i n g sw e r ef o r m e d0 1 1t h es u r f a c eo ft i k e yw o r d s ：b s a h ac o m p o s i t ec o a t i n g s ，b s a ，b i o m i m e t i cg r o w t h ，t i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞蠢鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：褊剖瓦华签字日期：沙呷年乡月笋日 学位论文版权使用授权巾 本学位论文作者完全了解墨生盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨注盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：襁桫灸争 签字日期：彩四年石月华日 导师签名： 签字日期： 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 我国是一个人口大国，每年因病理、物理性因素导致硬组织损伤的患者超 过3 1 0 0 万人。与此同时，社会人口剧增，交通工具大量涌现，疾病、自然灾 害、交通事故、运动创伤和工伤等造成人们以外伤害剧增。随着社会文明进 步、经济发展和生活水平日益提高，人类对自身的医疗康复格外重视。因此利 用高科技修复因外伤、炎症、肿瘤和先天畸形等原因所造成的骨缺损，对解除 千百万患者痛苦以及恢复患者硬组织功能，无疑具有重大意义。当今世界各国 都十分重视硬组织修复人工材料的理论及实验研究，该领域的研究，对发展我 国新型的、符合我国国情的硬组织修复材料，具有明显的经济效益及较高的临 床应用上的社会效益，是一项十分重要的工作。 近年来，生物材料及制品产业已经形成并正在蓬勃发展，其市场销售额在 近十年世界经济衰退阴影下仍以平均每年2 0 的速率稳步增长，国际生物材料 产业的产值超过1 5 0 0 亿美元。就生物材料产业及日后社会发展来看，它可与二 十世纪五六十年代的汽车、半导体工业，七八十年代的电子、计算机工业在世 纪经济中的重要作用相比拟，这给各国的产业结构调整提供了一个机遇。生物 材料的研究与开发许多国家列入高技术关键新材料发展计划，并迅速成为国际 高技术制高点之一。 1 2 自然骨的结构 1 2 1 骨的结构 骨组织是坚硬而有一定韧性的结缔组织，骨是构成身体支架的器官。在人的 一生中，骨组织不断更新和改建，从而适应成年前机体的生长发育和成年后机体 支持功能的变化需求。人体9 9 以上的钙及8 5 的磷以磷灰石的形式贮于骨组 织中，因而骨又是人体的钙、磷贮存库。 从成分上来讲，骨主要由大约7 0 的矿物质( 主要成分为羟基磷灰石，h a ) ， 2 2 的蛋白质( 胶原纤维占9 5 ) 和8 的水构成【l ，2 】。 图1 1 中给出了长骨骨干的结构模式。长骨由骨松质、骨密质、骨膜、关节 第一章文献综述 软骨及血管、神经等构成 3 】。骨基质中的主要有机成分是胶原( 2 0 w t ) ，无机成 分是磷酸钙盐类即骨盐( 6 5 州) ，主要以结晶羟基磷灰石的形式存在，此外还有 一定的水分( 9 铆) 。从材料学的角度来看，自然骨可以认为是由无机纳米羟基磷 灰石和有机胶原纤维构成的复合材料。纳米粒子填充于胶原纤维基质中赋予骨坚 硬性和高的压缩强度，而胶原纤则维赋予骨强的韧性、弹性和高的抗拉、抗弯强 度。有机质与无机质结合，使骨组织具有坚强的支持能力 4 6 】。自然骨不是致密 的，其微孔分布均匀，相互贯通，以让血管及骨细胞长入。自然骨通过非常复杂 的方式巧妙的将有机的骨基质结构与无机的骨盐框架结构互相紧密地结合起来， 在人体中实现生物力学上要求 7 】。骨中羟基磷灰石针晶的定向分布大大增加了 骨的力学性能。在设计骨替代材料的过程中，骨组织的这些特点给材料工作者提 供了非常重要的启发和思路。 膏t 蕾 一耳簟 奎曩 一 ， 仆并量 摹位 量，卜 ，纤 巾舞 t 图1 - 1 长骨骨干结构模式图 f i g 1 - 1t h en l o d ep a t t e r no fo sl o n g u m & a p h y s i s 1 2 2 骨的微观结构 骨结构的基本概念来自于利用光学显微镜对骨的观察，而光学显微镜从起源 到现在己有3 0 0 年历史了。现在，利用光镜已对骨的微米结构进行了观察，在小 于这个尺度的范围内，许多细微的结构还有待研究，特别是对骨组织在钙化过程 中产生的微观复杂有序结构的研究。研究自然骨微观结构时常遇见的一个问题是 骨中的h a 晶体处于纳米尺寸，不易观察，骨中纳米晶体尺度范围一般在数十到 一百纳米之间，几到十几纳米宽。这也许是己知的生物体自身合成的最小的晶体。 这些晶体与胶原基质紧密结合在一起，产生了一个高度复杂且高度有序的复合结 构。这一复合结构自身呈薄片状，几微米厚，又作为基本单元，根据不同的骨类 第一章文献综述 型，进一步组成更高一级的结构。骨与其它生物体中组织一样，有着不同等级的 组织结构 7 】。对于研究制备仿生骨修复材料来说，了解自然骨的微观结构是非 常必要且意义重大的。 1 2 3 骨中羟基磷灰石的结构 骨磷灰石晶体的化学成分以h a 为主，呈弱结晶状态。这种h a 是非化学计 量比的物质，c a p 比值在1 5 1 6 7 之间，含有c 0 3 2 - 、f 一及少量n a + 、m 孑+ 等物 质。骨中的羟基磷灰石为六角晶体学对称结构，由于其长边侧面为( m o o ) 面，6 个 ( 1 0 0 ) 面压缩成对等状态，所以h a 最终呈针状或短棒状。图1 2 为人工合成的羟 基磷灰石的结构示意图，图1 - 2 ( a ) 表示h a 投影在( 0 0 1 ) 面的晶胞结构 8 】，图1 - 2 ( b ) 为( 1 0 0 ) 面上h a 的原子丰4 n 9 1 。羟基磷灰石的化学式为c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 属于六 方晶系的结晶结构。体外合成的骨磷灰石晶体也具有和骨组织中h a 同样的形 态，这说明了h a 的某种内在的性质，而不是因为生物因素造成的。 3 o o 0 第一章文献综述 图l 一2h a 的晶体结构：( a ) h a 投影在( 0 0 1 ) 面的晶胞结构；( 1 0 0 ) 面上h a 的原子排列 f i g1 - 2c r y s t a ls t n j c t u r eo f h a ：( a ) p r o j e c t i o no f h y d r o x y a p a t i t e 蛐r u c t u r ei n ( 0 0 1 ) c r y s t a ls u r f a c e ； ( b ) a t o m i ca r r a n g e m e n to f h y d r o x y a p a t i t ei n ( 1 0 0 ) c r y s t a ls u r f a c e 1 3 骨组织替换材料的发展、种类和要求 1 3 1 骨组织替换材料的发展 随着社会发展和科学技术进步，人类硬组织替换的需求越来越大。半个世纪 前，对骨的缺损或损失的修复，多采用自体移植和异体移植。自体移植是目前临 床上应用较多、效果最好的，但由于移植要产生吸收、重建、再吸收，因而要改 变形状，同时采用自体移植还增加了患者的痛苦，在骨缺损比较大的情况下，还 会受到来源的限制。为了解决自体移植所存在的一些难以克服的问题，异体移植 受到了特别关注。但是异体移植存在免疫反应，也有骨吸收问题，容易感染或传 染疾病，同时伦理道德问题也不容忽视。因此发展硬植入替代材料成为临床发展 的必要方向。 硬组织生物医用材料研究的历史与人类的历史一样漫长。公元前5 0 0 0 年，古 代人就尝试用黄金修复失牙。公元前2 5 0 0 年，中国和埃及的墓葬中就发现有假牙、 假鼻、假耳。到1 9 世纪，金、银、铂等金属开始用作人体硬组织修复物。1 9 世纪 末期，可吸收陶瓷一熟石膏已在临床中得到了应用，这是陶瓷在临床中应用的雏 形 1 0 】。2 0 世纪7 0 年代以来，医用金属材料、生物陶瓷、医用高分子材料都得 到了蓬勃发展。其间生物玻璃、玻璃陶瓷及羟基磷灰石等进入临床应用后，将生 物材料的研究推向了一个新的发展阶段。7 0 年代后医用复合材料的研究开发，成 4 第一章文献综述 为生物医用材料发展中最为活跃的领域之一。 进入9 0 年代，借助于生物技术与基因工程的发展，硬组织生物医用材料，已 由单纯的生物相容性材料过渡到生物相容性基础上的生物活性材料，其基本特征 在于具有促进细胞分化与增殖、诱导组织再生和参与生命活动等功能。这种将材 料科学与现代生物技术相结合，使无生命材料生命化，并通过组织工程实现人体 组织与器官再生及重建的新型生物材料已成为现代材料科学的研究前沿。 1 3 2 硬组织替换材料的种类 目前临床上应用的硬组织替代材料主要是医用金属材料、生物陶瓷和聚合物 以及由以上几种材料组成的生物复合材料。根据材料植入活体后的种植体一组织 反应类型不同，骨替换材料可分为以下四种 1 l 】。 生物惰性材料：材料与骨组织界面将形成不同厚度的纤维组织包裹，纤维包 裹的厚度取决于很多因素如种植体条件、宿主组织条件、界面上的运动及配合状 态、载荷类型等。生物惰性材料与周围骨组织之间的结合只是机械嵌连，植入体 内后容易发生松动和脱落。主要有不锈钢( 3 1 6 l ) 、c o c r 合金、纯钛和钛合 金等。 生物陶瓷材料( 生物可降解材料) ：材料将在体内发生分解或溶解，逐渐被周 围活体组织所取代。生物可吸收材料主要包括生物陶瓷材料和一些聚合物，他们 的降解产物必须为新陈代谢所接受，另外种植体的吸收速率必须与人体组织的修 复速率相匹配。磷酸三钙陶瓷在人体内吸收过快从而容易造成缺陷。自固化磷酸 钙，也称骨水泥，它是由几种磷酸钙盐组成的混合物，能在人体的环境和温度下 自行硬化，其成分最终转化为h a ，但仍无法满足较大承力部位的使用要求。 生物活性材料：材料将与周围人体组织形成直接的骨键合( 化学键合) 。生物 活性材料具有良好的生物相容性和生物活性，能与人体生物活性硬组织形成化学 键合。其中羟基磷灰石由于具有与人骨无机质相似的化学成分和晶体结构而被认 为是一种最有潜力的人体硬组织替代材料。羟基磷灰石( h a ) 植入人体后，将在种 植体一组织界面上发生一系列生物物理和生物化学反应，这些反应最终产生骨性 结合界面【1 2 】。此类界面是一种化学结合界面，因此具有较高的结合强度，但它 们的自身强度较低，只能用于非承载部位的骨修复。9 0 年代后期，h a 复合骨替 代材料得到很快发展。如h a 与天然生物材料( 如骨形成蛋白、胶原、红骨萌和成 骨细胞等) 的复合；h a 与有机高分子聚合物的复合( 如聚乳酸材料p l a ，聚乙烯材 料p e 等) 。理想的骨替代材料应该是一种具有高的生物相容性和生物活性的物质， 它的机械性能与天然骨相当或稍优于天然骨。 第一章文献综述 1 3 3 硬骨组织修复的要求 对骨修复材料的要求体现在生物相容性、生物活性及稳定性方面： ( 1 ) 骨修复材料首先要具备生物安全性。对人体无毒、无刺激、无致癌、无 突变；此外还要利于细胞粘附，增殖，降解产物无毒。 ( 2 ) 材料应具有力学相容性。除在力学性能上达到骨修复的要求之外，还应 与骨的力学强度相匹配，避免过大的模量导致应力屏蔽。材料降解过程中，力学 强度不应下降得很快。耐摩擦磨损、耐疲劳。 ( 3 ) 材料应是生物活性的。可与骨组织形成骨性键合，增强界面强度。 ( 4 ) 材料应该具有化学性能上的稳定性。在一定的时间内保持有效的支持功 能。耐腐蚀，不产生有害的降解产物。 ( 5 ) 材料还应具有较好的加工性。 1 4 钛表面羟基磷灰石生物复合涂层 1 4 1 钛合金的性能 目前常用的金属医用材料主要是有不锈钢、c o - c r 合金、钛及其合金。近 年来，n i t i 合金及z r 合金也开始引起注意。相比之下钛及其合金耐蚀性强，植 入体内后，组织反应轻微，表面性能好，从未发现中毒反应。因此，钛及其合 金在硬组织修复和替换材料方面已逐渐占主导地位，成为首选的金属医用材料 【1 3 ，1 4 。 。 钛作为生物医用材料的优点： ( 1 ) 具有良好得生物相容性，可以在植入后实现与骨的融合式愈合。 ( 2 ) 比强度大，机械性能好，重量轻，密度小( 4 5 l g c m 3 ，接近人骨) ( 3 ) 地球储量大，在金属中排列第四，价格也相对较低，宜推广。 但钛及其合金也存在一些缺点，限制了它的应用： ( 1 ) 钛及其合金耐磨性较差，质软，不足以抵抗使用过程中产生的磨擦磨 损，生成的磨屑游离，骨吸收后诱发炎症，产生无菌松动而导致置换失败。 ( 2 ) 钛及其合金在人体中虽然有一定的耐蚀性，但植入体在某些部位常承 受较大的交变应力作用而引起疲劳腐蚀，降低了材料正常的疲劳强度，这是造 成植入体早期断裂的主要原因。植入体松动后，骨骼和高分子磨屑会破坏钛及 其合金的钝化膜。人体的组织受伤或感染时，p h 值在3 5 9 0 之间变化，加速 了金属材料的腐蚀。同时，体内存在较高浓度的氯离子。这些原因造成的腐蚀 产物进入人体导致严重的生理病害。也使植入体松动、断裂，最终失效。 第一章文献综述 ( 3 ) 骨的弹性模量和钛及其合金的弹性模量不匹配，使植入体周围的骨骼严 重弱化，医学上称之为应力遮挡。 1 4 2 羟基磷灰石( h a ) 1 4 2 1 羟基磷灰石的性质 羟基磷灰石 c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 】的组成接近于生物体的骨组织的无机成分，具 有非常好的生物相容性 1 5 。h a 的密度为3 1 5 9 c m 3 ，溶度积为l o - 6 l 5 ；摩尔质量 为1 0 0 4 6 4 9 m o l ；低结晶质h a 的微粉末，其比表面积很大，可达到1 0 0 m 2 g 。h a 微溶于水，呈弱碱性( p h = 7 9 ) ，易溶于酸而难溶于碱。h a 的表面性能取决于其 结构。h a 的表面主要存在两个吸附位置，当o h 一位于晶体表面时，该位置联结 着两个c a 2 十，在水溶液中这个表面的o h 一至少在某一瞬空缺，由于两个c a 2 十带正 电，形成一个吸附位置。同理，当表面的c a 2 十在某一瞬间空缺时，表面形成另一 个吸附位置。当h a 材料植入人体后，这两个吸附位置可以吸附周围组织中的异 电性粒子。 按化学分子式计算，正常的h a 中的c a p = i 6 7 。但h a 分子中 幂j c a 2 + 位置( a 位) 易被1 、2 、3 价阳离子替换；p 0 4 3 位置( x 位) 易被a s 0 4 3 。、v 0 43 - s i 0 44 - s 0 4 2 。、c 0 32 等替换；o h 。位置( z 位) 易被f 、c l - 、b r 、i 。、0 2 、c 0 3 2 。离子替代； a 、x 、z 位还能互相耦合替代。 此外，羟基磷灰石还具有以下性质：( 1 ) 生物相容性。h a 对含磷酸基的蛋白 质及羟基含量高的蛋白质吸附很强，诱导骨组织生成，并与生物的骨骼生长在一 起，排斥反应很小，结构与生物骨骼接近。( 2 ) 高脆性。由于韧性很差并且是多 孔结构，所以很脆，不能单独作为应用材料，要与其它金属复合使用。( 3 ) 低的 抗拉强度。这是羟基磷灰石多孔的结构和本身强度低的必然结果。 1 4 2 2 羟基磷灰石的活性机理 h a 与周围骨组织结合主要通过化学性结合和生物结合两种方式 1 6 ，1 7 。 ( 1 ) 化学性结合：h a 的c a2 + 、p 0 4 孓吸附周围骨骼组织中的c a 、p 离子形 成化学键。t k a w a s a k i 提出h a 表面主要存在两个吸附位置，当o h 一位于晶体 表面时，该位置联结着两个c a 2 十，在水溶液中这个表面的o h 至少在某一瞬间 空缺，可形成一个吸附位置。同理，当表面的c a 2 + 在某一瞬间空缺时，表面形 成另一个吸附位置。 ( 2 ) 生物结合：骨细胞长入h a 的微小空隙中。h a 植入人体后，可与周围 的骨组织和体液发生化学反应，不断的与周围体液中的磷酸三钙、磷酸四钙进 行离子交换，这是一个动态平衡，当达到这个平衡时，在h a 与骨的界面上便 7 第一章文献综述 产生了新的h a 。钙离子、磷离子不断从h a 表面弥散出来，体液中的c a 、p 离 子在电化学力的作用下不断向h a 表面浓聚，这样在h a 的表面就形成了一个富 含c a 、p 离子的反应层，此层中的钙磷离子与骨细胞中的蛋白质分子结合，从 而新生骨组织与h a 紧密结合为一体。在此过程中，h a 材料表面的限制性溶解 是重要的一步。其次为钙磷离子的外向性沉积和再沉积。这种表面溶解伴随着 h a 样骨矿物质的再沉积，在h a 与周围骨组织间产生了一个能传导相应应力的 界面，这些反应不一定按同样的速度进行。新生骨在h a 周围形成后，h a 表面 的液体滚动就会相应减慢，从而离子交换也会相应减慢。h a 上释放的钙离子在 重新沉积前溶解在体液中，由于h a 的限制性溶解，体内钙离子浓度升高，这 有利于h a 样物质的沉积，然而这种沉积不一定与刚溶解的钙结合。体液在h a 表面起介导作用，它影响细胞的增殖和分化。而h a 的存在为成骨细胞的扩散 和增殖创造了条件，成骨细胞在h a 表面的附着、扩散、生长、分化是发生骨 锚固的依赖因素。此外在这些过程中，成骨细胞制造和分泌粘连物质一粘连糖蛋 白，它是一个二聚体，两个单体片段通过二硫键相连，当它结合在h a 表面后 被激活去诱导骨细胞与h a 的结合。既然h a 能与粘连蛋白结合并能对细胞生长 有引导性，这就注定它能同周围的骨组织紧密连接在一起。 1 4 3 钛和钛合金表面的生物活化的方法 钛的生物活化就是要使钛经过处理后，能够在生理环境诱使h a 层在其表面 形成，与骨组织实现直接的化学键合。 生物陶瓷具有金属材料和有机材料无法比拟的优点，但其脆性大，尤其是 抗弯强度低，严重限制了这类材料的使用范围。利用金属材料与生物活性陶瓷 的复合，可通过不同材料的互补，达到增强材料强度，同时保持生物活性的目 的。 目前，钛基h a 涂层生物活化的方法主要有物理处理法：等离子喷涂、爆炸 喷涂、离子束辅助沉积、涂覆一烧结法、溶胶一凝胶法；化学处理法即生物矿化 法；电化学反应法等。不同的方法各有利弊。 物理处理方法是通过涂覆磷酸盐涂层或注入c a 等元素在钛表面引入生物活 性涂层，制成活性涂层一钛复合材料。在生理条件下，钛与骨组织经过所涂覆的 h a 涂层或引入的其他成分所产生的h a 形成直接的键性结合。这并非钛本身的 活化。不过涂覆过程也不能完全排除化学作用。如等离子喷涂的高温下h a 与钛 界面可能发生化学反应。这一反应有助于增强界面结合 1 8 】。 电化学方法中，电化学结晶和电泳沉积是在钛底材上引入磷酸钙涂层，阳极 氧化法可制备含h a 的复合膜，这些都是在钛底材上施加了生物活性的磷酸盐涂 8 第一章文献综述 层。即其活性是外加的活性涂层所反映出的。 化学处理法是对钛表面进行化学改性，改进其生物活性。然后置入磷酸钙过 饱和的模拟体液中，在钛基表面沉积类骨磷灰石。所以化学法也称为生物模拟法 ( b i o m i m e t i cp r o c e s s ) 或生物矿化法( b i o m i n e r a l i z a t i o n ) 。 1 4 3 1 等离子喷涂 等离子喷涂法是以高纯度的h a 粉末为原始粉，利用阴极和阳极产生的电弧 将气体电离成高速、高能的等离子气流，在气体中加入h a ，极短的时间内h a 被熔化、加速并最终沉积到钛基体表面，随后冷却形成涂层 1 9 ，2 0 1 。具有喷涂 时间短、结合强度高、涂层均匀和适合工业化生产等特点。该方法已被应用于制 作人工牙根和人工髋关节等承力的种植体，是当前制备这类材料的一种主要方 法。但是随着应用和研究的深入发现，这种方法也存在一些问题，从而使其在临 床上的广泛应用受到了一定限制。 这些问题主要是：( 1 ) 锘l j 备过程中温度高，冷却时基底与涂层界面会存在很 高的残余应力；( 2 ) 等离子喷涂的高温过程易使h a 发生分解，导致涂层中产生杂 质相，h a 的结晶度较低；( 3 ) 涂层结构致密度较低，植入人体后，生理组织溶液 容易沿连通孔隙渗透到基底界面，造成界面腐蚀，引起涂层剥落。 1 4 3 2 爆炸喷涂 爆炸喷涂是一种独具特色的金属表面涂层技术。它的工作原理是利用爆炸气 体产生的超音速冲击波能量进行喷涂，一般是将一定比例的乙炔和氧气的混合气 以及喷涂粉末同时送入爆炸喷枪，利用混合气体点火爆炸，产生3 4 0 0o c 左右的 高温，气流速度可达3 0 0 0 m s 。爆炸喷涂的温度较离子喷涂的要低得多，它的主 要特点是将喷涂粉料以极高的速度射向金属基体。该方法适用于喷涂熔点较低的 粉料。冲击波的作用有利于残余应力的释放，所以得到的涂层结合强度较其它喷 涂工艺的要高得多。 1 4 3 3 离子束辅助沉积法 离子束辅助沉积法是采用离子束轰击靶材，使溅射出的粒子沉积在基材表面 形成涂层，同时利用载能离子轰击h a p 陶瓷薄膜与t i 基体界面，通过形成c a t i 过渡层，实现薄膜与钛基体的牢固结合，从而制备t i 基体一m 址涂层高结合力 植入材料 2 1 2 3 。 这种方法制得的涂层为非晶态，在空气环境中于一定温度下进行退火处理 后，薄膜结构逐渐转变为完全的晶态，涂层较薄，并且涂层与基体实现了原子尺 9 第章文献综述 度的结合，结合强度高。另外，在涂层中引入c 0 3 卜，使薄膜在一定成份上更接 近含碳酸盐的自然骨成分。 1 4 3 4 涂覆一烧结法 涂覆一烧结法是将制备陶瓷涂层的以料浆的形式涂在金属基体表面，经过 干燥成为一种薄层涂粉，然后在高温下热处理，粉料与基体之间形成一层结合 高度的涂层【2 4 】。该方法具有工艺简单、涂层致密、涂层厚度可控等特点。但 在制备过程中由于采用了较高的温度反复烧结，使得钛基体的性能下降和h a 分解，同时由于钛基体和h a 涂层的膨胀系数相差较大，它们之间在烧结过程 中产生较大的热应力。热应力的存在降低了基体与涂层的结合强度，甚至造成 涂层的开裂和剥落。 1 4 3 5 溶胶一凝胶法 溶胶一凝胶法是将涂层配料制成溶胶，使之均匀覆盖于基体表面，由于溶剂 的迅速挥发，配料发生缩聚反应而胶化，再经干燥和热处理，即可得到涂层 【2 5 2 8 。这种方法制备温度较低，避免了h a 的高温分解，体系中的组分分布均 匀，材料制备过程易开展，工艺简单容易控制，产物纯度高。但是凝胶过程中易 开裂，难以得到较厚的涂层。 1 4 3 6 电化学方法 目前基于电化学原理制备金属基底生物陶瓷涂层复合材料的方法有阳极氧 化法 2 9 - 3 1 、电沉积技术 3 2 和电泳沉积技术等 3 3 ，3 4 。阳极氧化法是在较高 电压下使钛表面钝化态膜转化为多孔性生物活性t i 0 2 。电沉积技术是在含c a 2 + 和h 2 p 0 4 - 的溶液中，以石磨棒做阳极，金属基底为阴极，控制一定的电极电位 并适当调节p h 值，在阴极表面上沉积出磷酸钙类生物陶瓷；电泳沉积是将铅作 为阳极，金属基体作为阴极，两者保持一定的距离浸入含有涂层材料成分的乙 醇溶液中，通直流电，采用不同的电场强度和不同的沉积时间可以得到致密或 多孔、厚度各异的涂层。电化学方法制备h a 涂层是在温和条件下进行，避免 了高温喷涂引起的相变问题以及基体与涂层之间的热应力问题，电化学过程是 非直线过程，可以在形状复杂和表面多孔的基体上制备出均匀的陶瓷涂层。而 影响电化学涂层性能和结构的因素较多，如p h 值、浓度、溶剂、电压、电解时 间、电极间距、搅拌、预处理、陈化时间、烧结温度等。电沉积涂层的性能还 与粉末粒度、表面电位和电泳浓度有关。并且都需加热焙烧以提高涂层与底材 的界面结合强度和调节物相比例及结晶度等。 l o 第一章文献综述 1 4 3 7 化学处理法 以上方法制备出来的涂层，其成分与生物骨磷灰石有较大差距，这导致植入 骨在体内长期性能的不确定性因素增多。研究表明：钛及其合金在体内环境中可 自发地在其表面形成骨样磷灰石。因此人们发展了生物仿生法，这种方法为生物 涂层开辟了道路。化学处理法是对钛表面进行化学改性使其活化。然后置入磷酸 钙过饱和的模拟生理溶液，使类骨磷灰石自然沉积在钛表面 3 5 - 4 1 。所以这类化 学方法也被称为生物模拟法( b i o m i n e t i cp r o c e s s ) 或生物矿化法 ( b i o m i n e r a l i z a t i o n ) 。现有的化学法往往步骤较多，费时，有些工艺中，需成膜后 高温处理，还常用到强酸或强碱。但是，化学方法操作简单，不需复杂设备，可 获得与天然骨成分、尺寸和结构近似的涂层，也可通过溶液的成分的变化来改变 涂层成分及其分布。材料表面形状复杂时也能均匀成膜。所以，化学方法逐渐成 为近年的研究热点。 1 5 牛血清蛋白的性质 血清白蛋白是人和动物血清中含量最丰富的一种蛋白质，目前研究较多的是 牛和人的血清白蛋白，简写为b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) 和h a s ( h u m a ns e r u m a l b u m i n ) 牛血清白蛋白是牛血清中的主要蛋白质，其含量约占血清中蛋白质总量 的一半，分子量6 7 ，0 0 0 ，等电点4 7 ，在血液中参与维持渗透压以及物质运输等 功能，是人们最早发现并对其进行研究的蛋白质之- - 4 2 。 牛血清白蛋白性质比较稳定，来源十分丰富，在分子生物学和细胞生物学等 方面得到了广泛的应用。细胞培养用的许多优良的培养基中都含有牛血清白蛋 白，免疫生化中的e l i s a 法以及分子生物学中的免疫杂交法常用牛血清白蛋白 作为非专一吸附的抑制剂，s d s 电泳中用b s a 作为标准分子量样品，b s a 也常 加到某些酶和活性蛋白质抑制剂中作为他们的保护分子。牛血清白蛋白的另一重 要用途是用来合成各种单糖，二糖以及寡糖的拟糖蛋白( n e o g l y o o p r o t e i n ) 。基于 牛血清本身不含糖这一重要性质，可人工加上一定的糖，用来研究糖与其他分子 间的相互作用，在肿瘤学等许多方面得到广泛应用。 牛血清的主要成分 4 3 】： 血清是一种很复杂的混合物，其组成成分虽大部分己为人所知，但还有一部 分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养 条件不同而异。 ( 1 ) 蛋白质。它是牛血清的主要成分。除包括可携带金属离子、脂肪酸的蛋 第一章文献综述 白和自身是激素类的蛋白外，主要还有白蛋白、球蛋白、纤维粘连素( 可促进细 胞附着) 、a 2 巨球蛋白( 可抑制胰蛋白酶) 。 ( 2 ) 多肤。血小板促生长因子能促进细胞分裂，是多肽家族的主要成员，是 主要的促进细胞增殖因子。成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞 生长因子等在血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。 ( 3 ) 激素。激素对细胞的作用是多方面的。主要有以下几种：一是胰岛素它 能促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。二是类胰岛素生长因子它 能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而具有与胰岛素相同的作用。三是促生长激 素，它具有细胞增殖的效应。四是氢化可的松，它可能兼有促细胞贴附和增殖作 用。 ( 4 ) 其它成分。氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养有一定 意义；与蛋白呈结合状态的微量元素对细胞培养也有一定意义。 牛血清在细胞培养中的主要功能： 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长所必要的 营养成分，具有以下极为重要的功能。 ( 1 ) 维持细胞指数生长的激素，提供其它基础培养基中没有或含量很少的营 养物，以及主要的低分子营养物。 ( 2 ) 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其它激素等，能结合或调 变它们所结合的物质活力。 ( 3 ) 结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。 ( 4 ) 细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子的来源。 ( 5 ) 具有起酸碱度缓冲液的作用。 ( 6 ) 提供蛋白酶抑制剂，在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受 伤害。 1 6 本论文的研究思路和内容 1 6 1 研究思路 本文利用仿生生长法将预处理以后的钛片浸入模拟体液和牛血清蛋白的混 合溶液中，在基体钛片上制备牛血清蛋白一羟基磷灰石的复合涂层。在钛基上制 备羟基磷灰石可以同时发挥金属和陶瓷的优势，在制备过程中添加牛血清蛋白可 以调节羟基磷灰石的生长，模拟体液中的钙磷盐和牛血清蛋白通过化学作用共沉 积到基体的表面。 第一章文献综述 虽然磷酸钙陶瓷，尤其是h a 具有优良的生物活性，但是，合成h a 与骨组 织中天然h a 仍然存在明显差异。一方面，合成h a 通常不含m g 、k 、f 和 c 0 3 2 - 等无机成分；另一方面，骨骼中h a 是与胶原和蛋白质等有机成分有序结 合。此外，在体内合成h a 表面层转化为类骨磷灰石往往需要较长的诱导期。因 此为了进一步改善生物活性，有时也对磷酸钙陶瓷进行表面改性。 此外在生理环境中，除了无机离子以外，还存在蛋白质和细胞等成分 4 4 4 6 。 细胞对材料的响应也是在蛋白质吸附之后，蛋白质吸附层将介入细胞与材料的作 用。 根据d u c h e n y 4 7 1 的观点，材料进入体会发生如下过程： 1 溶解。 2 从溶液中沉积。 一3 离子交换：结构重排。 4 界面融合：陶瓷表面键合层。 5 溶液对细胞的介导作用。 6 非结合沉积( 1 、矿物相2 、有机相) 。 7 结合沉积( 1 、矿物相2 、有机相) 。 8 趋化性。 9 细胞黏附和分化。 l o 细胞黏附和增殖。 1 1 细胞黏附和分泌。 血清蛋白在人工生物材料表面的吸附行为是在血液与非生体材料之问最基 本和最重要的作用之一，在于它在很大程度上决定并影响着血小板等生体细胞在 材料表面的黏附行为。当前植入式医用器件在临床应用过程中所出现的凝血及感 染现象便与之密切相关。白蛋白是体液中一种含量丰富的蛋白质，易于与多肽共 价结合，从而促进细胞在植入材料表面的吸附与生长。血清白蛋白能化学吸附到 h a 表面，形成难溶性血清白蛋白一h a 复合物。因此，无论在理论上还是应用 上，在生物材料的研究中考虑到蛋白质的介入具有相当的研究价值。 利用仿生生长的方法制备生物活性涂层已经成为近年来研究硬骨组织替代 材料的研究热点。本课题组已经对仿生生长法制备生物活性涂层进行了多年的研 究，对钛合金表面的活化的预处理过程已经进行了充分的探讨，并且优化出了合 理的工艺参数。认为钛合金在进行仿生生长之前进行酸处理、碱处理、预钙化处 理后，可以提高基体的生物活性。将这种经过活化后的钛合金进行仿生生长，可 以缩短生长时间，并且能够得到比较理想的羟基磷灰石涂层。 在以前研究的基础上本文采用仿生生长法，在模拟体液中添加牛血蛋白，期 第一章文献综述 望在钛基体上能够得到牛血清蛋白和羟基磷灰石的复合涂层。在仿生生长前同样 对钛基体进行预处理，提高钛的生物活性，然后在3 7 0 c 恒温条件下进行仿生生 长，在生长过程中能够通过牛血清蛋白和基体表面的钙磷以及模拟体液中c a 2 + 和p 0 4 3 一的化学结合实现对复合涂层的调控生长，使其在结构和组成上更加接近 人体的骨组织。 1 6 2 研究内容 本来利用仿生生长法在钛基体上制备牛血清蛋白一羟基磷灰石的复合涂层， 主要研究内容如下： ( 1 ) 在实验室以前的研究基础上，在模拟体液中添加牛血清蛋白，利用仿生 生长的方法制备牛血清一羟基磷灰石的复合涂层。 ( 2 ) 通过扫描电子显微镜( s e m ) 、x 射线衍射( x r d ) 、红外光谱( i r ) 、x 射线 光电子能谱( x p s ) 等对复合涂层的表面形貌、成分、结构等性质进行表 征分析。 ( 3 ) 对牛血清蛋白影响涂层生长的因素进行探讨，并在此基础上进一步优化 实验的参数，提高涂层的结构和性能。 ( 4 ) 探讨牛血蛋白一羟基磷灰石复合涂层的生长机理。 1 4 第二章钛表面复合涂层的制备与表征 2 1 引言 第二章钛表面复合涂层的制备与表征 植入体与骨组织的理想结合方式是材料一骨界面形成牢固的化学结合，即 骨键合，新生骨直接在植入表面形成，随后直接长入种植体内，最终使材料和 骨融为一体。 近年来的研究表明，通过物理，化学或者电化学表面改性的方法改变钛表面 的结构、化学成分等可赋予钛金属及其合金生物活性，从而在体内实现植入体与 硬组织间的生物活性结合。而在生理环境，除了植入体表面无机离子的释放和再 沉积，材料表面与蛋白质和细胞的相互作用必然也与其生物活性有关。由于细胞 对材料的响应是在蛋白质吸附之后，所以蛋白质吸附层将介入细胞与材料的作用 4 8 ，4 9 1 。材料表面性质和结构在蛋白质吸附过程有着重要影响。反之，蛋白质 吸附也可能改变材料的表面性质和结构，影响其生物活性。也有文献报道蛋白质 分子影响磷酸钙陶瓷表面的沉积行为 5 0 5 3 。在自然界，生物大分子调制生物矿 化也是普遍的规律 5 4 5 6 。从某种程度上讲，牛血清蛋白的加入会使钙磷涂层的 沉积速率降低，但是添加牛血清