（环境科学专业论文）苯胺、苯酚类化合物对发光菌的联合毒性研究.pdf

a b s t r a c t t h es i n g l et o x i c i t yo f9a n i l i n e sa n d1 2p h e o n o l st op h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u m w e r ed e t e r m i n e dr e s p e c t i v e l y o nt h eb a s i so fs i n g l et o x i c i t y , t h ej o i n tt o x i c i t yo fb i n a r ym i x t u r e so fa n i l i n ea n ds u b s t i t u t e da n i l i n e s ， p h e n o la n ds u b s t i t u t e dp h e n o l si nt h et o x i cu n i tr a t i o so f1 ：1 ，1 ：4 ，4 ：1 w e r e m e a s u r e da n d15 m i n - e c s 0v a l u e sw e r ed e t e r m i n e d t o x i cu n l t ( t u ) 、a d d i t i v ei n d e x ( a i ) 、m i x t u r e t o x i c i t yi n d e x ( m t i ) a n di s o b o l ep l o tw e r eu s e dt oe v a l u a t et h ej o i n tt o x i c l t yo fa n i l i n ea n d s u b s t i t u t e da n i l i n e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h et y p e sa n dm a g n i t u d e so f j o i n ta c t i o n s o fb i n a r ym i x t u r e so fa n i l i n ea n ds u b s t i t u t e da n i l i n e sa t d i f f e r e n ts o l u t i o nc o m p o s i t i o n sw e r ed i f f e r e n t ；m e a n w h i l e ，e v e na tt h e s a m es o l u t i o n c o m p o s i t i o n ，t h ee v a l u a t i n gm e t h o d sa l s o i n f l u e n c et h e r e s u l t s i n g e n e r a l ，m o s tb i n a r y m i x t u r e ss h o w e d a d d i f i v i t y w i t l lt h e o v e r l a p so f t h e i rc o n f i d e n c eb e l t sa n d t h ea d d i t i v i t yi n d e x t o x i cu n i t ( t u l 、a d d i t i v ei n d e x ( a i ) 、m i x t u r et o x i c i t yi n d e x ( m t i ) a n ds i m i l a rp a r a m e t e r ( ) w e r eu s e dt oe v a l u a t et h e j o i n tt o x i c i t yo fp h e n o l a n ds u b s t i t u t e dp h e n o l s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em a j o r i t yo f j o i n t a c t i o n so f b i n a r ym i x t u r e so fp h e n o l sa n ds u b s t i t u t e dp h e n o l sw e r em a i n l y a d d i f i v i t y , o n l yaf e wo n e ss h o w e dw e a ks y n e r g i s mo rw e a ka n t a g o n i s m w i t ht h e i re v a l u a t i n gv a l u e s f a l l i n go u t s i d et h el i m i t so fa d d i t i v i t y 8s t r u c t u r ep a r a m e t e r sa n d5 p h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r so fa n i l i n e s a n d p h e n o l s w e r ec a l c u l a t e d u s i n g t h e c o m p u t e r s o i t w a r e s t h e q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pw a sb u i l tb e t w e e nt h es i n g l e t o x i c i t yv a l u e so f a n i l i n e so rp h e n o l sa n dt h e i rp a r a m e t e r s ，f o ra n i l i n e s ： - l g e c s 0 。2 9 5 1 0 0 5 6 4 吩 + o 3 0 0 ：f o r p h e n o l s ：- l g e c 5 0 = 6 1 5 8 0 2 7 9 p k a t h es u b s t i t u t e da n i l i n e st o x i c i t yv a l u e sa n ds u b s t i t u t e dp h e n o l s t o x i c i t yv a l u e si nt h eb i n a r ym i x t u r e sw e r ep r e d i c t e dr e s p e c t i v e l y u s i n g t h e q s a re q u a t i o n s a n d a d d i t i v i t ym o d e l g o o da g r e e m e n tb e t w e e nt h e 针 p r e d i c t e da n d m e a s u r e dv a l u e sw a sf o u n d t h e r e f o r e ，t h eq s a r e q u a t i o n s c o u l db eu s e dt o p r e d i c tt h em i x t u r et o x i c i t y i ft h ej o i ma c t i o nm a i n l y s h o w e da d d i t i v i t y k e y w o r d s ：q s a r ；p h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u m ；j o i n tt o x i c i t y ； a d d i t i v i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：垫：堑垒圣日期 吾、6 、) ， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：丕：函毽指导教师签名： 日 期：冱查： ：兰日期： 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 童譬 j w a ，j 第一耄化学晶的联合毒作用及生态风险评价 随着工农业生产的迅猛发展，越来越多的污染物质，尤其是人工 合成静各耪有瓤污染甥透过务葶孛途径进入到舔境中，并在繇境中共存 i 。长期的毒瀵掌研究己揭示国大量单一化学品的物毽化学性质和环 境毒性效应，许多标准如安念浓度标准，废水允许排放标准等都是依 据零个化学品的海性效应建立起来的郾j 。假仅用单一化学品的毒性效 应怒无法惩释箕 蕈臻援淫静，嚣秀在多数漶凝下，秀秘躐多耱伍学渤 璜作用于生物时，会引起与各物质单独作并j 时完全不同的毒性反应州。 所以依赖于单一毒性效应制定的标准无法真实地反映环境质量要求， 匿此研究两种或多秘化学品蛉联合毒性效疲逐渐成为环壤毒理学研突 酌燕要方囱，它能为环境稼准的铝l 定和生悫风险评价褥供更可靠静依 据。 1 1 纯学晶薛联合毒俸鬻 1 , 1 1 联合作用方式的分类 竣旱提窭联会佟震理论懿怒b l i s s ，缝凌1 9 3 9 年磺究亵释毒黪鼗合 作用时首次提出了“拮抗作用、加和作用、协同作用”的划分。关于 联合作用的划分不同的文献提出了不同的分法，有许多文献采用相加 ( a d d i t i o n ) 、越捆加( s u p r a - a d d i t o n ) 和亚摆趣( i n f r a - a d d i f i o n ) 驰分 类方法；也霄攀簧据密，按照联合律焉豹靛质和程度，可敬对每释僚 用类型再分类，如加强和拈抗作用都可再分为单向、敝向和反应三种 类缴，单向是指一种无活性的化学物质影响另一种活性化学物质的效 应，双淀剃是撂蘧秘活惶纯攀甥矮之耀互稳影豌对方瓣效应。妥兹竣 为公认和普遍采翊的分类方法主要包括以下四类： 1 ) 独立作用( i n d e p e n d e n te f f e c t ) ：也称无相甄作用( n o i i n t e r a c t i o n ) ，怒指同时存在的有害因素以不同的作用方式产生毒性效 应鄞，即各毒物对机体的入侵途径，佟用靶位作用枫理等均不相同， 产生的生物学效应彼此无关，互不影响。 2 ) 诱蔺 乍霜( s y n e r g i s t i ce f f e c t ) ：亦称为增强 笮蠲( p o t e n t i a t i o n ) 、 大于相加( m o r et h a na d d i t i v e ) 或超相加( s u p r a - a d d i t i o n ) 5 1 ，它是指 惫效应大于各窍害毒物肇独终掰时静藤帮 5 , 6 t ，这可籍释为一_ 释物矮酌 毒性被另一种物质所增强。协同作用对环境安全有重大威胁，也使得 裁曩联合毒蕊亳薛突残鬃评徐纯会物瀵在毒程及铡定菜黧元素酱景谴其 有重要意义。协同作用的产生和强度与各组分加入的顺序和比例有关。 修璜琴等f 7 j 发璇，当礁葶羹c d 以浓度跑l ：l 燕至露斑鱼生活懿承髂中对， 表现为协同作用；但以其毒性比1 ：1 加入时，则表现为先协同席拮抗。 3 ) 掘和终赐，也目翅搬嚣震( a d d i t i o n ) ：是掺憨效应等予鑫毒害 因素单独作用时的总和。这种联合作用中的各化学物质的结构比较接 近，或属于同系物质，它们作蹋于枫体的同一部位或缎织鲍毒性 乍是 近似，作用视理也类似，如梭一定比例，用一种化学物质代替另一种 化学物质，其混合物的毒性不改变【8 1 。 4 ) 拮抗作用( a n t a g o n i s t i ce f f e c t ) ：也叫亚相加作朋，指总效应小 于各有害化学物单独作用时的效应之和，即毒性效应被2 种或2 种以 上污染物酶交甄作用繇低【9 l 。驭菜种獠度上讲，位点竞争是产生拮抗 作用的赢接原因。 癍量i 疆窭，纯学混合锈联合效应静榷凌往往与其幸搴实验条件有关， 如暴露的剂量不同，联合作用类型也可能不同，在一个剂量水平上出 现菜秘联合 乍麓，在鬟一耪赛l 豢东平上不一定辘踅到，掰究发溪许多 致癌物在低剂鬣时多为相加作用，而在商剂量时则为协同作用，因此， 混合物缀残及备维分( 元素) 懿魄镊是凌定混合镌毒鞋熬重要滋素，在 进行化学品的联合毒性研究时，无论魑在实验中，还魑在流行病学调 查中，必须设寇和说明发生联念作用弱兵体条黪。 1 1 2 联合作用机理： 1 ) 竞争活性位点 耪理化学性质相似的污染物由于作用方式和途径相似。因而在细胞 表面及代谢系统的活性部位存在竞争作用，从丽影响污染物的相互作 用i l ，铺。对吸附位点的竞争会导致一萃中污染物扶结合使点上取代另一种 处于宽争弱势的污染物。这种竞争的结果在很大程度上取决予参与竞 争的备污染物的种类、浓度魄和各啻的吸附特性。 2 ) 干扰生物正常的生理过程 彳乞合物之阋静联合作角会干抗生物体正常生毽滔动，影晌生耪体 对特定化合物的转移、转化、代谢等生理过程。如n i r m a l a l l 0 1 等研究三 丁基锈( t b t ) 帮多氯联苯( p c b ) 砖鱼俸繁蓬率表褒整懿戆抗终掰 与毒物在鱼体中的蓄积和向卵中转移有关。 3 ) 改交缨藏静续擒与功戆 污染物的联合作用可使生物体或有关内含物与外界环境隔离开， 姨瑟敬变其逶性及主鹚、被动转运能力，也会改变缨腮的结搀与功麓。 如e n s e n b e c h l l l 】等发现暴露予3 , 4 二氯苯胺的鱼体的肝细胞中粗面内 质网穿孔，线粒体膨胀，溶酶数量增多，热入林丹鼷，肝纲照会变缮 更加肥大。 4 ) 影响酶的活性 污染物的联合作用会改交与代谢污染物有关韵酶( 系) 的活性， 影响污染物在生物体内的扩散、转化和代谢方式，从而影响污染物在 生物体内的行为和毒性。有黧化合物可阻抑激物体肉自由基驹产生， 从而减低过氧化胁迫，使其它共存的瓣物的毒性降低。 5 ) 予抗生物大分子静结稳与功能 污染物通过抑制生物大分子的合成与代谢干扰撼因的扩散和表 达，辩d n a 遮藏按掰袋凌之凝袭荠影稿英修复，或与d n a 生藏耗擎 加合物。如d o n n e l l y 1 2 1 等研究发现，随着t n t ( - - 硝基甲苯) 加入量 豹增大，苯( 毯) 著蓖( ( 毡) p ) 懿毒经逐澎海燕，其覆困在予蓠者 干扰了后者与d n a 的结合。 6 ) 螯合或络合及沉淀馋爝 自然环境中存在许多络合剂如o h ，- n h 2 ，c o o h 等，它们会改 变污染物的形态分布晕嚣其生物有效性。有枧螯合刘纛被螯合物可形成 生物体不能吸收、蓄积的螯合物形式，同时污染物间还可形成沉淀， 从而降低污染物的溶解性和可利用性。 1 1 3 剂量一反应曲线陋“1 在毒理学研究中，常用的毒性指标可分为两类，一类是计量指标， 它是用测量值度量毒性强弱的差异；另一类是计数指标，这类指标只 有“有或无”的差别，没有性质和强度的差别。计数指标主要用于群 体研究，得到的测定值是非连续的，通常以一个群体中某效应出现的 几率表示，常用于生态毒理和生态风险评价研究中。 所谓剂量一反应关系，是指某种外来化合物的剂量与出现某种效 应的个体在整个群体中所占比例的关系。与此相区别的是剂量一效应 关系，所谓剂量一效应关系是指某种外来化合物的剂量与在个体中引 起某种效应强度改变的关系。 剂量一反应( 效应) 关系，可用剂量一反应( 效应) 关系曲线来 表示，剂量一反应( 效应) 曲线通常有三种形式( 图1 1 ) ( 1 ) 直线关 系，在这种关系中，剂量改变与效应强度或反应成正比，这种关系总 体来讲是少见的( 线a ) ；只是在简单的离体实验中，在一定剂量范围 内，才可能显示这种曲线，( 2 ) 对数曲线关系，是一条先锐后钝的曲 线，类似数学上的对数曲线，若将剂量取对数值，可转换成直线( 线 c ) ；( 3 ) s 状曲线，当群体中的全部个体对某一化合物的敏感性变异 呈对称正态频数分布时，剂量一反应关系呈s 状曲线( 线b ) 。这种曲 线在毒理学中较常见。 图1 - 1 剂量反应曲线 在邛境生态毒理学中，用半数有效量表示毒物的毒性大小。半数 脊效量是指实验生物有5 0 出现阳性结果时所需毒物的剂量。如梁以 实验生物的死亡率表示，该指标相应为半数致死量( l d s o ) ，若用空气 或水体中有极污染物的浓度袭示剂量，毒性指标相应变为半数致死浓 度( l c 5 0 ) ，之掰潋嗣半数有效量表示毒饿托大小，是鬣为在5 0 反斑 发生率或效应强度附近，剂嫩的变化引起反应发生率或效应强度的变 动比较骤急，曲线呈陡直形式，因而这种枣性指标比较灵敏。 s 姨裁量一爱疲蠢线是生态毒理学中较露冕熬一辩。对s 状麴量一 度应关系曲线，作迸一步分析，常态分布的反应频率对剂量作图，得 到照钟形g u s s i a n 分布曲线，这种钟形分布曲线，是由于生物差异引趣 的。在低剂量和舞剂量时，农少数动物发生反应，多数动物在中数粼 耄范围内发生葳痘，赛l 量一爱应螽线在1 6 和8 4 之溺遥纭予线性关 系。在进行l d 5 0 威l c 5 0 的计算时，可对s 型曲线用非线性模型模拟， 也可以经线性转化后进行线性模拟。目前常用的非线性模型有对称的 l o g - n o r m a l ，l o g i s t i e 模型和不对称夔w e i b u t l 模型 1 5 - 1 8 1 镣。 l o g - n o r m a l 模型有二参数、三参数等形式，二参数丽数形式可表 示为： p = f ( 1 ，2 9 易e x p 一1 2 ( 1 n c - c t ) s 2 泌( 1 - 1 ) l o g i s t i c 模黧有二参数、三参数甚至豳参数、五参数形式，二参数 形式可表示为： p = 1 ，垂+ e x p 一( 球+ i n 。) 0 - 2 ) w e i b u l l 模激事实上是指数函数的修磁形式，其函数可表示为： p 2 1 一e x p ( - a 妒) ( 1 - 3 ) n ( 1 一1 ) 式模鍪较难积分，一黢不壹接逡嚣菲线瞧叛合，豢将致疑 百分率) 迸行p r o b i t 转纯，即进行概率分柝，形成线性模型： p r o b # ( p ) 2 a + b l n c ( 1 - 4 ) 上蘸( 1 - 2 ) 式霹囊接遴牙 线瞧羧台，毽毒遴葶亍l o g i t 转曩：，髟残线瞧摸 裂： l o g i t ( p ) = a + b i n c ( 1 - 5 ) 上面( 1 3 ) 式可直接进行非线性拟合，也可转化成线性模型 i n ( 一l n ( 1 一p ) = a + b i n c ( 1 - 6 ) 当选择了合适的抑制率p ，就可计算相应的半数阈值浓度，这些基 本关系是计算毒性统计值的基础，其中以概率( p r o b i t ) 分析应用较多。 1 1 4 联合作用的评价方法 从b l i s s 提出联合作用以来，已出现了多种评价联合作用的方法， 每种方法都有各自的特点，对同一种联合作用，采用不同的评价方法， 得出的结论也可能有一定区别，因此选择恰当的评价方法也很重要。 下面将文献中出现的评价方法总结如下，见表1 1 ： 表1 - 1 联合毒性的作用类型与评价指标 评价方法计算方法分级作用类型 参考文 相加指数法兰憋+ 墅：s a i o协同作用 【2 ，4 ，6 ，9 ( a i ) a ib i a i = 0 加和作用。1 9 ，2 0 ，2 a i 霉1 s l _ o ( s l - 0 ) a i o 搬抗作用1 ，2 2 ，2 3 a 1 2 s ( - 1 ) + l l o ) 2 4 2 5 3 毒性单位法t u i = 混合物中组分i 的浓度 y ? t u 1 孝鑫撬作用2 , 3 3 ，3 4 ， 4 1 混台毒性指 m t i ； l o g 州 m t i 0 播抗作用 4 691 数法( m t d 芝黧翟患；詹 m t i ：o 独立作用9 , 2 0 ，2 2 ， t h i 。混合物中维努 的浓度 。 一” 。 ” 一纯台秘洋猿于窜疆的l 。0 1 貉霹 车矮3 , 2 7 ，2 9 ， t u i ：第i 组分的毒性单位 0 1描抗作用 3 1 1 ：相似性参数 ：o独立作用 量法( i l d s 0 ) 预期l d 5 。混l ds o , a l d s 0 , b a 。o4 拮抗作用 8 ，b 为化合物a , b 在混台物中所。4 a 。2 7 趣秘馋窝 占静霆量比铡。 a ，27 协同作用 姒= 巽器 糊k e p l i n ，g ，e 翊 0 5 7 1 0播抗作用【3 8 】 (eifac)x e 掰一l 鍪 磁力恒温攒j 掌器，上海南汇电讯器辛耋厂 ( 6 ) t g 3 2 8 b 分析天平，上海天平仪器厂 ( 7 ) y x q s g 4 1 2 8 0 电燕手提压力蒸汽港毒器，上海医鬻孩子仪器 厂 ( 8 ) s w - c j - i f 净化工痒台，棼建安泰空气技零鸯疆公司 ( 9 ) 1 0 1 1 型干燥箱，上海市实验仪器厂 ( 1 0 ) 微量遂撵器，上海安亭微量进拶爨厂 ( 1 1 ) 1 0 m l 具塞比甑管，1 0 0 m l 容量瓶，北京玻璃仪器二厂 2 。1 2 试剂 ( 1 ) 苯酚a r 北京化举试剂厂 ( 2 ) 邻、闻、对硝基苯酚a 。r 天津化工厂 ( 3 ) 间、对甲苯酚a r 上海化学试剂工厂 ( 4 ) 邻、对氨基苯酚a r j e 京化工厂 ( 5 ) 2 ，3 一二峄基苯酚a r 上海纯擘试裁工厂 ( 6 ) 2 ，6 - 二甲基苯酚a r 上海化学试剂工厂 ( 7 ) 2 , 4 一二硝基苯酚a r 上海纯学试帮工厂 ( 8 ) 对甲氧基酚a r 上海化学试剂工厂 ( 9 ) 苯藏a 鬏，上海亿学试韵工厂 17 ( 1 0 ) 邻、阍、对甲苯胺 ( 1 1 ) 邻、间、对硝基苯胺 ( 1 2 ) 酵母浸出j 鬻 ( 1 3 ) 胰蛋白胨 ( 1 4 ) n a c i ( 1 5 ) k h 2 p 0 4 ( 1 6 ) n a 2 h p 0 4 ( 1 7 ) 甘油 ( 1 8 ) 琼脂粉 2 2 实验材料 a r 上海化学试荆工厂 a + r 上海化学试刿工厂 北京化学试剂厂 北京化学试剂厂 a r ，j t 京仡工厂 a 。豫托京纯王厂 a 歉。上海化学试剂王厂 a r 天津化王厂 北京化学试剂厂 明亮发光杆菌( p h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o m u m ) t 3 变种，由中豳科 学院南京土壤研究所徽生物室撬供。 2 3 实验内容 2 。3 1 发澎菌生镌簿牲实验 当今环境阏联曩慧严黧，裁要对大爨戆环境污染物蹼进行毒一姨鉴 定和生态风险分据，传统懿分攒手段难以潢起要求，鼹越发震灏翡鉴 定和评价各类污染的有效方法显得非常迫切。目前，急性毒性分卡斥方 法已不断得到发展和完善，其测试的生物种类已涉及剿细菌、藻类、 底栖软体动物、浮游生物和鱼类等，其中发光菌因其独特的生瑷特性， 劳与现代光宅捡测手段福绥台，两藏该方法翼有快速、简便、灵敏、 壤徐躲饯点，瘸憨备受关注。 发光壤属孳兰氏骤燃、燕毽厌氧蘧，为 致瘘薤，大小终势0 4 1 0 1 0 - 2 5 i x m 。无孢子、荚膜，有端生鞭毛一根戚数根，薄养条件要 求不离，矮适温度为1 5 - - 2 5 。c , p h6 - 9 , n a c l 浓度3 ，o ，3 的甘油对发 光反应宥利，它们广泛分布于海洋或非海洋环境中，以游离或者是与 l s 爨类、浮游皇谚鼙共生、共援获态，分离培蓁魄较容菇。笈必薤在逶 宜条件下发光很强，光谱范围约4 2 0 - - 6 7 0 n m ，发光菌的生长过程包括 生长初期，对数生长期，稳定期和衰减期，发光菌在对数擞长中期发 光强度达到高峰，一般实验选择此时期进行毒物测试。 发光菌的生物发光原理：发光菌的发光是在荧光素酶( l u c i f e r a s ) 瓣徨位下壹氧褥长镶膳薅醛氧讫惫爨耱酸，还原垄荧豢肇孩萤酸 ( f m n h 2 ) 氧化戏脱氢型黄素单核蛰簸( f m n ) ，同时将纯学反应中 的一部分能量以光的形式释放出来。h a s t i n g 8 3 】等提出发光翁细胞体内 的发光模式如下： i 】h 州n # t 嘲# 一骈氇 r c 。# z m l 。一+ 瓣嗡 洲h o h 了一e f h 虻“。撕j h v e l ：缨越荧光素酶 e 2 ：n a d h ，f m n 氧化还原酶 e 3 ：脂肪酸还原酶 瞬2 - 1 发光菌缀缒体肉黥发光模式 上述发光反应谂径可简单概述为f 4 8 】： f m n 2 + 0 2 十r c h 0 一荧光+ f m n 十h 2 0 + r c o o h 1 9 髓 卜 一* 铡 这个发光现象是呼吸代谢耦台，作为光能被散发。这个反应是在 好氧性条件和酶的作用下而发缴的，所以如果有毒物质存在，就会影 响冀额陈代谢，籀剑酶的活性，从丽影响冀发光强度，且发光强度与 毒褴大小呈线牲关系，困魏可投裕发光强度寒翔断有毒化学物质毒瞧 的大小。本文正怒应用发光菌发光强度对化学物质毒性的敏感性检测 污染物的毒性。 发光菌毒陵实验主要爱发光蘩豹凉于耪藏悬液送行毒装测试，跌 1 9 7 8 年美国b e c k m a n 公司推出功能完备的生物发光光度诈m i e r o t o x ， 这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广，因此人们也将发光菌 毒燃测试称为m i e r o t o x 测试，它具有应用范围广、灵敏度高、相关性 努、反应速度幸哭等优点，发光蔼生耪毒往安骚采霜瑗我光电检澜手段 ( 生物发光光度计) ，基于发光随在仪器中的发光强度随水样品中具有 毒性的有机、无机化合物总体浓度增高而呈线性降低的负相关，用发 光强度来表 正、浚量毒物赝在黪境爨急牲毒燃，是毒理中生秘测定懿 方法之一，在有毒物质的筛选，环境污染物的生态风险评价等方面具 有羹露的意义。 2 3 。2 发光菌的培养 ( 1 ) 壤莠滚：酵母浸遗泞，o ，5 9 ；簇蛋壹蒜，o 5 9 ；n a c l ，3 9 ；n a 2 h p 0 4 ， o 5 9 ；k h 2 p 0 4 ，o 1 9 ；甘油，o 3 9 ：蒸馏水，1 0 0 m l ；调节p h 到7 0 5 ； 趁热分装于1 5 0 m l 三角瓶中，姆瓶各约5 0 m l ，塞上棉球，用牛皮纸包 l 好，经1 2 1 巅愿灭菌2 0 3 0 m i n 后备用。 ( 2 ) 固体培养鏊：取上述涪养液1 0 0 m t ，嬲入1 5 2 9 琼潞，电炉加热 使溶解至透明，调节p h 值为7 0 5 ，趁热用漏斗分装于试管中，每支 试管各约1 0 m l ，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经1 2 1 高压灭菌 2 0 3 0 r a i n 霞，毅爨锚成瓣蟊。 ( 3 ) 培养：将发光菌冻干粉用o 5 m l3 n a c i 溶解，迅速转入5 0 m l 培养液中，2 0 。c 恒温培养，每2 4 h 后转接一次斜面，将培养好的第三 代斜蕊置4 。c 冰籀中餐用。 游培养荮的鏊糖接入含有5 0 m l 培养滚静1 5 0 m l 三角魏内，2 0 瞧 温搬荡培养1 2 2 4 h 后备用。 2 0 2 3 3 标准溶液的配制 用差减法称取一定量的各有机物于2 5 0 m l 容量瓶中，加入3 n a c l 溶液，用超声清洗机溶解并定容，以上溶液均配在有机物溶解度以下。 2 3 4 预实验 选定几个浓度范围进行试验，观察1 5 m i n 发光菌的发光抑制率， 找出试验的正确浓度范围( 发光抑制率在5 0 上下均有分布) ， 2 3 5 单一毒性e c 5 0 的测定 吸取培养好的菌液l m l 于2 0 0 m l3 n a c l 溶液中，磁力搅拌该稀释 液备用。根据预实验的结果，按等对数间距设置5 个浓度梯度，每个 浓度点设三个平行，各吸取2 m l 于磨口具塞圆形比色管中，用2 m l 3 n a c l 作空白对照，迅速吸取o 5 m l 稀释菌液于各比色管中，加塞， 上下振摇5 次，去塞。在1 5 m i n 用生物毒性测试仪测定发光强度，计 算发光抑制率( 发光抑制率= ( 对照发光强度一样品发光强度) 对照 发光强度1 0 0 ) 。 2 3 6 联合毒性的测定 苯胺分别与8 种取代苯胺，苯酚分别与1 1 种取代苯酚以毒性单位 比为1 ：4 ，1 ：1 ，4 ：1 的比例混合，组成不同配比的混合体系。根据 预实验的结果，按等比级数设5 个浓度梯度，测定各混合体系对发光 菌的联合毒性e c 5 0 的实验步骤与单一毒性的实验步骤相同。 2 41 5 m i n - - e c 5 0 及其9 5 置信区间的计算 概率分析( p r o b i ta n a l y s i s ) 是生物毒性实验中一种有效的统计方法。 本文采用统计分析软件s p s s l 0 0 中的概率分析程序进行统计分析。在 概率分析程序中需要输入总的生物个体数，受到抑制的生物个体数及 化合物的浓度，t h o m u l k a 【8 2 】提出了一个适合发光菌实验的概率分析方 法，即以1 0 0 代表总的生物个体数，以发光抑制率代表受抑制的生物 个体数，本文采用此方法用概率分析程序计算了苯胺和苯酚类化合物 对发光菌的单一毒性和联合毒性。 q s a r 方程的建立采用s p s s l 0 0 中的多元逐步回归分析的方法完 成，通常用方程的相关系数r ，假设检验( f 一检验) 值和估算的标准偏差 ( s e ) 和显著性水平( p 值) 四个指标来评价回归方程的质量。对于一个方 程来说，一般显著性水平要在0 0 5 以下，表明相关具有显著性，而相 关系数r 越高、f 检验值越高、标准偏差越低，则表明所建的方程的 预测能力越强。 第三睾不同配 e 苯胺、苯酚类化食物的联合毒性评价 3 1 本文中采用的联合毒性的评价方法 l 毒性单位( t u ) 毒蛙擎寝( 弼) 最早是国s p r a g u e ；| ：鞋r a m s a y 2 6 ) 掇爨，势惩蘧方法 对c u z n 之间交互作用对大两洋大马哈鱼幼体生长发育的影响进行了 研究，螽来m a 攒堍秘d a w s o n 【8 3 1 燎这一概念撼广到混食物蜓蝴趣作用。 毒性单位中规定混合物中第i 组分的海性单位为： t u ：旦f 3 1 1 l c 5 “ 、 式中：c i 为混合物在半数致死效应时第i 组分的浓度 l c 5 0 , i 为第i 种化合物单独作用时的半数致死效应浓度 漉合裙静毒注单使等予备缀分的毒性单佼之帮( m ) ，郎m = t u m i x = t u i ，若令m o = m m a x t u i ( m a x t u i 液示混合物中毒性单位最大值) ， 校据m 篷嚣羚耋。篷胃敬谔徐混合物豹佟孺类黧，其钵评价稼猴为磷； 当m = i 时，为简单相加作用；当m m o 时，为拮抗作用；当m m 1 对，兔 部分相加作用。 2 槌鸯羹指数法( 越) 早在1 9 6 1 年，l l o y d 8 4 】农评价c u z n 对虹鳟鱼的联合效应时就使 鼹了这一概念，1 9 7 7 年，m a r k i n g 2 1 l 系统地耀述了这一概念。它是农 毒性单位概念的基础上发展起来的。m a r k i n g 将a j 定义为： 若m l 时，a i = i m 一1 ； 8 - 2 m 1 时，a i = i m 。 f 3 3 1 a l 的评价标准是：当a i = 0 时，为简单的相加作用：当a i 0 对，为秘舄馋用。 袁星等豁】曾用a i 法研究了2 , 4 - d n t 与硪慕苯及苯胺类化合物对 发光菌的联合毒性作用，效果较好。 3 混合毒往指数法( m t i ) 1 9 8 1 年，k 6 n e m a 黼 3 q 首次使瑙混合毒襁指数( m t i ) 谮价了多元 混会甥对鱼豹联合毒俘矮。k 6 n e m a n n 耱m 1 定义爻： m t i = i l o g m l o g m 0 ( 3 - 4 ) 其中m = t u m i x = t u i ，若令m 0 = m m a x t u i 。m t i 的评价标凇为： 当m t i = i 时，为简单相加作用；当m t i l 时，为协同律用：当m t i = 0 时，为独立作用；警0 m t i 1 时，为协同作用；当 o x 甲基苯胺 苯胺；对于阍一萃申取代基，取代基的使 委凌会影穗至l 毒戆，惑蒋来说莛对位 邻像 海经。莠l 溯褥的9 释苯 胺类化合物对发光菌的单一毒性数据与上述1 3 种物化参数进行逐步 回归，得到如下方程； 一 卜寸 _ _ 凸n西昏n 一 ” 一一 n卜 、。 n。、 甘 。、。、卜卜卜”n 嶂 州 卜卜 v 、卜nn卜 oonnn non n_ n卜寸noa 、_ n寸 葛导窨葛葛昌昌字苫 ” _ _ no口onn - _ nnnnn“n c i 乱。一c i 心。一 c i c ic i c i i 1 ”一卜。一 = 卜o 【n _ 【卜o i n i - n 乱 1 6 0 n 寸n ，o o o c 一 崞吨o n 母卜 寸。卜o i | 寸乱n o”小o n 昏q n 寸凸t o 啦_ l 冀_ 【 崎1 9 o o 寸寸i o 心o 器一 窨咕。 一寸叶一 乱n 心o 寸卜n 小一o n n 也”n 寸崞c n n o口一乱 o