（遗传学专业论文）核糖体相关蛋白ecp参与果蝇学习记忆的初步研究.pdf

中文摘要 核糖体相关蛋白e c p 参与果蝇学习记忆的初步研究 中文摘要】 研究生：徐敏 导师：谢维( 教授) ( 东南大学发育与疾病相关基因教育部重点实验室，南京，2 1 0 0 0 9 ) e c p 是从野生型黑腹果蝇胚胎e d n a 文库中筛选并克隆得到的一个新基因，生物信息学分析及 本实验室蔗糖密度梯度离心分离核糖体结合w e s t e mb l o t t i n g 分析表明e c p 可以和核糖体的4 0 s 小 亚基及6 0 s 大亚基共沉降，提示e c p 是一个核糖体相关蛋白，可能参与蛋白质合成的起始过程。 e c p 在果蝇组织中持续广泛地表达，没有明显的组织特异性。过表达e c p 无明显可观测的表型。2 0 0 3 年j o s hd u b n a u 等发现一株p 因子插入在e l f 5 c e c p 的突变体果蝇c 0 1 5 0 存在长期记忆的缺失，而 与我们得到的e c p 的突变体果蝇1 1 5 8 1 表型不同。所以到目前为止，果蝇中e e p 的具体功能还不是 很清楚，e c p 是否参与长期记忆的形成及其可能的分子机制尚有待进一步的研究。 为进一步分析e c p 在体的功能，我们首先用p c r 对e c p 的两株突变体果蝇1 1 5 8 1 、c 0 1 5 0 的p 因子插入位点进行验证，对这两株果蝇的e c p 表达水平进行检测，并对其表型进行初步分析；其次， 我们利用p 因子的非精确剪切技术制备e e p 完全缺失的突变体果蝇，并对其表型进行初步分析；此 外，为研究e e p 是否参与果蝇长期记忆的形成，我们通过免疫荧光染色分析了e c p 在幼虫及成虫的 中枢神经系统的表达情况。 实验结果表明：突变体果蝇1 1 5 8 1 和c 0 1 5 0 中p 因子均插在e e p 第一个内含子区，分别插在距 起始密码子a t g 上游8 5 9 b p 和1 2 9 7 b p 的位置，其纯合子中e c p 表达均下降；对他们的表型分析发 现l1 5 8 1 纯合子具有半致死、刚毛变短、翅膀变小等核糖体蛋白突变所致的m i n u t e 表型；获得一株 e c p 完全缺失的突变体果蝇6 3 t m 6 b ，w e s t e r nb l o t t i n g 和遗传学的互补实验均证明了e c p 的完全缺 失，其纯合子存在蛹前期致死、生长发育迟缓等表型。幼虫及成虫脑袋的免疫荧光染色结果表明e c p 在整个中枢神经系统均有表达，果蝇的嗅觉学习记忆中枢蘑菇体的发育无明显异常的缺陷。为对其 突变体果蝇长期记忆能力进行检测，我们初步建立了果蝇成虫嗅觉联想式长期记忆检测系统。 关键词；黑腹果蝇；e e p ；蛋白质合成；突变体；长期记忆 中文摘要 e c p ，an o v e lr i b o s o m e a s s o c i a t e dp r o t e i n i n v o l v e d i nl e a r n i n ga n dm e m o r yi nd r o s o p h i l a a b s t r a c t l g r a d u a t es t u d e n t x um i n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx i ew e i t h ek e yl a b o r a t o r yo f d e v e l o p m e n tg e n o sa n dh u m a nd i s e a s e s 。 m i n i s t r yo f e d u c a t i o ns o u t h e a s tu m v e r s i w t h ec d n a g e n b a n ka c c e s s i o nn o a f 3 2 5 5 2 9 lo fe c pw a sc l o n e df r o md r o s o p h i l ae m b r y o n i c b r a i nc d n al i b r a r y b o t hr e s u l t sf r o mb i o i n f o r m a t i e sa u a l y s i sa n do u rd a t ut h a ts h o w se c p e o s e d i m e n t sw i t hb o t h4 0 s a n d6 0 sr i b o s o m a is u b u n i t so ns u c r o s eg r a d i e n t , s u g g e s tt h a te c pm i g h t b ean o v e lr i b o s o m ea s s o c i a t e dp r o t e i na n dm a yp a r t i c i p a t ei nt h ei n i t i a t i o no ft r a n s l a t i o n e c p e x p r e s s e su b i q u i t o u s l ya n dc o n t i n u o u s l yd u r i n gf l yd e v e l o p m e n t t h e r ei sn oo b v i o u sa b n o r m a l p h e n o t y p ew h e no v e r e x p r e s s e dw i l dt y p ee c p ；i n2 0 0 3 ，j o s hd u b n u ur e p o r t e dt h a tc 0 1 5 0 。a p - e l e m e n ti n s e r t e dm u t a n to fe c p e x h i b i t e dd e f e c ti nl o n gt e r mm e m o r y ；b u tt h e s ea r ea l ld i f f e r e n t f r o mt h ep h e n o t y p eo f1 1 5 8 1w eg o t t h e r e f o r e 9e c pm i g h tb ean o v e lc a n d i d a t ef o rl e a r n i n ga n d m e m o r y h o w e v e r , t h em o l e c u l a rf u n c t i o na n dt h em e c h a n b mo fe c pi nl o n gt e r mm e m o r y 缸 a w a i t t i n gf o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i o n b o t h1 1 5 8 1a n dc 0 1 5 0c o n t a i n sap - e l e m e n ti n s o r t e di nt h ef i r s tj n t r o no f e c p a se x p e c t e d t h e e x p r e s s i o no fe c pi nt h e s e2l i n e sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dt ow i 埘t y p e t h eh o m o z y g o u s 1 1 5 8 1p o s s e s st y p i c a lm i n u t ep h e n o t y p e a ，e x a m p l e du ss h o r tb r b t l e , s m a l l e rw i n g ，s e m i - l e t h a l , e t e ；i n c o n t r a s t h o m o z y g o u sc 0 1 5 0f l i e ss h o wi o n g - t e r mm e m o r yd e f e c ta n do t h e r w i s ee o m p l e t e l yn o r m a l t oa d d r e s st h ed i s c r e p a n c yo ft h ea b o v e2e c pa l l e l e sa n df o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i o no f t h em o l e c u l a r f u n c t i o no fe c p a ne c pn u l lm u t a n tw a sg e n e r a t e d 。w h i c hc a r r i e da3 6 7 2 b pd e l e t i o ni ne c pg e n e r e g i o n w e s t e r nb l o t t i n gs h o w st h a te c pw a sc o m p l e t e l ya b s e n t t h i sn u l lm u t a n tw a sl e t h a la tt h e p r e - p u p as t a g e g e n e t i cr e s c u ew i t h w i l dt y p ee c pu n d e rt h eb a e k g r o u n do fh o m o z y g o u sc 0 1 5 0 d r i v e nb y2 0 1 y - g a l 4w a sd o n et oa d d r e s sw h e t h e rl o n gt e r mm e m o r yd e f e c ti nc 0 1 5 0w a sr e s u l t e d f r o me c di n a e t i v a t i o n l a l v aa n da d u l tb r a i ns t a i n i n gs h o w st h a te c pd o e sn o te x p r e s si nt h ea x o no f t h em u s h r o o mb o d yn e u r o n s t h el o n g - t e r mm e m o r ya s s a ys y s t e mi sr e q u i r e dt oe s t a b i i s h f o r f u r t h e rs t u d yi no u rl ah k e yw o r d s ：d r o s o p h i l a ；e c p ；p r o t e i ns y n t h e s i s ；m u t a n t ；l o n g t e r mm e m o r y 主要缩略词表 主要缩略词表 缩写词 英文中文 a c t a n t e n n a lc e r e b r a lt r a c t 触角脑通路 a la n t e n n a l l o b e 触角盘 a na n t e n n a ln e r v e 触角神经元 a r ma n e s t h e s i a - r e s i s t a n tm e m o r y 抗麻醉记忆 c a m k i i c a l c i u m c a l m o d u l i nd e p e n d e n tk i n a s e 钙，钙调蛋白依赖激酶i i i i c d s c o d i n gs e q u e n c e编码序列 c n s c e n t r a ln e u r a ls y s t e m 中枢神经系统 c r e b c a m p r e s p o n s i v e e l e m e n t b i n d i n gc a m p 反_ 匣兀件结合蜇臼 p r o t e i n c sc o n d i t i o n e ds t i m u l u s 条件刺激 c x m c y c l o b e x i m i d e放线菌酮 d p md o r s a lp a i r e dm e d i a ln e u r o n 背部成对的中间神经元 e l f s e u k a r y o t i ci n i t i a t i o nf a c t o r s真核翻译起始因子 l e gi m m e d i a t ee a r l yg e n e 即刻早期基因 i r e s i n t e r n a lr i b o s o m ee n t r ys i t e 内部核糖体进入位点 1 1 a f si r e st r a n s a c t i n gf a c t o r s i r e s 反式作用因子 l hl a t e m lh o r n 侧角盘 l n sl o c a li n t e m e u r o n s 中间神经元 l t m l o n g - t e r mm e m o r y 长期记忆 m b m u s h r o o mb o d y 蘑菇体 m b cm u s h r o o mb o d yn e u r o n 蘑菇体神经元 m f c m u l t i f a c t o rc o m p l e x 多因子复合体 m t mm e d i a l - t e r mm e m o r y 中期记忆 o r n s o l f a c t o r yr e c e p t o rn e u r o n 嗅觉受体神经元 p a b p p o l y ab i n d i n gp r o t e i n p o l y a 结合蛋白 p a c a p p i t u i t a r ya d e n y l y lc ，l a s ea c t i v a t i n g垂体腺嘌呤环化酶激活肽 d e o t i d e p n s p r o j e c t i o nn e u r o n投射神经元 r i s cr n ai n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x r n a 诱导沉默复合物 r r m r n ar e c o g n i t i o nm o t i f r n a 识别基序 s t ms h o r t t e r mm e m o r y 短期记忆 t c t e r n a r yc o m p l e x三元复合体 u s u n c o n d i t i o n e ds t i m u l u s 非条件刺激 n i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：缦l 日 期：耻，7 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：盎坠导师签名：研究生签名：笠蠡竺k导师签名： 文献综述 第一章文献综述 蛋白质合成起始与果蝇长期记忆形成机制的研究进展 摘要：学习记忆作为神经系统的高级功能之一，一直是神经科学研究的热点和重点，但关于其 形成的具体的分子机制还不是很清楚。果蝇因具有体积小、繁殖力强、周期短、易饲养、能产生大 量的后代、具有保守的遗传机制及方便的遗传学技术、多种学习范式等优势而为学习记忆等高级神 经功能的研究做出了巨大的贡献，对人类神经退行性疾病的研究也具有一定的启发意义。果蝇的学 习记忆分为短期、中期及长期记忆，不同时期的记忆有不同的形成机制，其中长期记忆的形成需要 蛋白质的合成，而蛋白质的合成包括蛋白质翻译的起始、延伸和终止三个过程，其中起始是合成的 限速步骤。本文就蚩自质合成起始与长期记忆形成机制的研究进展情况分别进行介绍。 关键词：果蝇蛋白质合成学习记忆长期记忆 无论在无脊椎动物还是脊椎动物，长期记忆的形成都需要新的蛋白质的合成，尤其是定位在突 触的蚩白质的合成，可以导致选择性的突触改变和神经环路修饰的变化。学习记忆时蛋白质合成增 加，并有新的蛋白质或多肽产生，对于果蝇来说亦是如此”“i 。新的蛋f 鼻质的合成是从m r n a 到 蛋白质的过程，它包括蛋白质翻译的起始、延伸和终止三个过程；而学习记忆的过程包括记忆的获 得、存储和提取三个过程，按时程来划分，可以分为短期记忆、中期记忆和长期记忆，不同时期的 记忆也具有不同的形成机制，本综述着重从蛋白质合成起始的机制和长期记忆的研究现状两方面来 阐述跃期记忆形成的分子机制的研究进展情况。 一，蛋白质合成起始机制的研究进展 在蛋白质合成的起始、延伸和终止三个过程中，蛋白质翻译的起始过程是最重要、最复杂的， 也是蛋白质合成的限谜步骤，它主要是在一系列蛋白质翻译起始因子的参与下，m r n a 与核糖体大 小亚基及携带有蚩氨酸( 真核生物) 或甲酰蛋氨酸( 原核生物) 的t r n a i ( 起始t r n a ) 结合形成完 整的具有翻洋活性的8 0 s ( 真核生物) 或7 0 s ( 原核生物) 起始复合物的过程。而延伸阶段则包括 进位、肽键形成及移位三个周而复始的过程，每个循环按照m r n a 上的密码子使新生肽链延长1 个氨基酸。终j p 阶段则是当m r n a 终止密码子进入到核糖体a 位点后，在终止因子的参与下使蛋 白质合成复合体解聚，m r n a 及终止因子、新生肽链释放的过程。在原核和真核生物中，蛋自质合 成起始步骤在细节和机制上具有明显的不同，但都基本包括如下几个过程：1 ) 翻译起始因子1 f 2 ( 原核生物) 或e l f 2 ( 真核生物) 与o t p 及f m e t 4 r n a i ( 原核生物) 或m e t - t r n a i ( 真核生物) 形成三元起始复合物( e ) l f2 g t p ( f ) m e t - t r n a i ( 简称t c ) ；2 ) 在翻译起始因子的参与下，t c 与4 0 s 核糖体小亚基结合形成起始前复合物；3 ) m r n a 结合到前述起始前复合物，形成3 0 s ( 原核生物) 或4 8 s ( 真核生物) 起始复合物：4 ) 沿m r n a 5 端向下游扫描起始密码子a u g ( 原核生物无需扫 描过程) ；5 ) 当m c t - t r n a i 上的反密码子与m r n a 上的起始密码子( 通常为第一个) 正确配对 后，i f 2 ( 原核生物) 或e i f 2 ( 真核生物) 的g t p a s e 活性被激活，并水解g t p ，进而与5 0 s ( 原核 生物) 或6 0 s ( 真核生物) 核糖体大亚基结合，最终形成具有翻译活性的7 0 s ( 原核生物) 或8 0 s ( 真核生物) 翻译起始复合物。相比较而言，原核生物的翻译起始过程要简单得多，目前认为只需 要三种翻译起始因子参与即可完成。而真核生物则需要至少1 3 种蛋白质因子参与，其中有不少为 多聚体，因而加起来需要近2 7 种不同的多肽链参与才能完成。因原核生物的蛋白质翻译起始的机 制比较简单，篇幅所限，就不再赘述。下面主要阐述一下真核生物蛋白质翻译起始的机制。 ( 一) 、真核生物蛋白质翻译起始的机制 真核生物蛋白质生物合成的过程与原核生物相比，由于m r n a 有其独特的特点、众多地翻译 起始因子的参与、对翻译起始密码子的选择，使得其机制也更加的复杂。其中其m r n a 与原核生 物的相比，就具有在5 末端具有一个帽子结构、3 末端具有多聚腺苷酸( p o l y a ) 尾巴结构、为单 顺反子三个结构特点。5 帽子结构是指真核生物m r n a5 末端所具有的5 - 5 连接的m 7 g p p p n ( n 为 任一核苷酸) 。另外，在有些真核生物中发现除第一个核苷酸的鸟嘌呤被甲基化外，在其后的第二甚 至第三个核苷酸的戊糖的2 - o h 也被甲基化，这三种帽子结构分别被称为；帽0 、帽1 和帽2 。帽 i 东南大学硕士学位论文 子结构不仅对m r n a 的翻译而且还对m r n a 前体的拼接以及成熟的m r n a 的核质转运等过程有关 “”j 。真核生物的m r n a 除了其5 端的帽子结构外，其3 的一个5 0 3 0 0 m 的p o l y a 结构在蛋白质 生物合成起始过程中也具有十分重要的作用。与5 帽子结构类似，p o l y a 结构同样可以促进m r n a 与核糖体小亚基的结合，但其机制是完全不同的。p o l y a 调控蛋白质合成的其中的一个机制是通过 一种p o l y a 结合蛋白( p o l y ab i n d i n g p r o t e i n ，简称p a b p ) 来实现的。p a b p 带有四个r n a 识别基 序( 简称r r m ) l l 。多个p a b p 可以与同个m r n a 的p o l y a 结合，平均每个p a b p 占据大约 2 7 个核苷酸的长度”。d e o 等d 4 通过晶体结构分析发现了人的p a b p 的n 端的两个r r v l 能够与 li n t 的p o l y a 结构形成复合体，p a b p 中的保守氨基酸残基与p o l y a 结构中的腺苷酸的特异识别是 通过氢键、范德华力和芳香环之间的堆积力来实现的。另外一种机制是p o l y a 结构是新合成的m r n a 在细胞核中经p o l y a 聚合酶催化聚合而形成的。而且只有m r n a 经过加帽、加p o l y a 和拼接形成 成熟的m r n a 后，才会被运输到细胞质中进行翻译。近年来的实验表明，在很多后生动物 ( m e t a z o a n s ) 的卵母细胞( o o c y t e s ) 中存在有多种休眠的( d o r m a n t ) m r n a ，这些m r n a 只带有 很短的一段p o l y a ，因而其翻译效率也是很低的。在爪蟾及其他一些物种中，对这种母源性的m r n a 的翻译调控是通过在细胞质中延长其p o l y a 来进行的，这种方式被称为胞质多聚腺苷酸化 ( c y t o p l a s m i cp o l y a d e n y l a t i o n ) 。在这种调控中有两种至关重要的蛋自质：c p e b 和m a s k i n 蛋白。 m a s k i n 能够同时与c p e b 及翻译起始因子e l f 4 e 结合”。m a s k i n 与e l f 4 e 的结合阻止了e l f 4 e 与 e l f 4 g 的结合，因而同时也阻止了m r n a 与核糖体小亚基的结合，所以这些m r n a 的翻译起始过 程就无法完成。c p e b 是一种r n a 结合蛋白，通常总是与m r n a 结合，但多聚腺苷酸化作用只有 在其被激酶a u r o r aa 磷酸化后才体现出来”“。在原核生物中通常是利用a u g 作为起始密码予，但 有时也可以利用g u g 或u u g 作为起始密码子。在真核生物中通常总是利用5 末端的第一个a u g 作为翻译的起始密码子，这一规律被称为“t h ef i r s ta u gr u l e ”，极少数情况下，也会利用a c g 或 c u g 来充当翻译起始密码子，但真核生物中绝大多数m r n a 的起始密码子前面都有一个约 1 0 0 - 3 0 0 n t 的5 u t r ，而且核糖体小亚基又是直接与m r n a 的5 末端帽子结合形成4 8 s 起始复合体， 那么在这种情况下，它利用现在普遍被人们接受的“扫描模型”( s c a n n i n gm e c h a n i s m ) 找到起始 密码子，即在一系列翻译起始因子的帮助下，核糖体小亚基首先与m r n a 的5 帽子结合，然后开 始向下游扫描，直至遇到第一个起始密码子”。真核生物的翻译起始过程与原核生物相比，都是核 糖体小亚基在一系列翻译起始因子的参与下与起始t r n a 、m r n a 结合，并进一步与核糖体大亚基 结合形成具有翻译活性的核糖体复台体。但是与原核生物只需要3 种翻译起始因子相比，真核生物 需要多种翻译起始因子的参与，由此可以看出：1 ) 真核生物的翻译起始机制要远比原核生物复杂； 2 ) 翻译起始因子之间复杂而有序的相互作用在翻译起始过程中肯定具有十分重要的作用。在此， 我们引用表一l i l ”来概括1 2 种哺乳动物的翻译起始因子在蛋白质合成中的作用。其翻译起始的机制 包括c a p 依赖的5 末端翻译起始机制( 第一个a u g 作为翻译起始密码子的翻译起始机制和第一个 非a u g 作为翻译起始密码子的翻译起始机制) 和i r e s 起始机制。 l 、c a p 依赖的5 末端翻译起始机制 下面首先介绍一下以第一个a u g 作为翻译起始密码子的翻译起始的机制：这一过程可以按如 下5 个步骤来划分，即1 ) 8 0 s 核糖体的解离；2 ) e l f 2 识别起始t r n a 并与4 0 s 核糖体小亚基结合； 3 ) m r n a 加载到核糖体小亚基形成4 3 s 起始复合体；4 ) 6 0 s 大亚基的结合；5 ) e l f 2 b 使e i f 2 g d p 再生为e l f 2 - g t p 。其中步骤2 ) 和3 ) 的顺序还有待实验的迸一步证明。所有生物的蛋白质生物合 成的过程都是从核糖体大小亚基的解离开始的，因为只有游离的核糖体小亚基才能与起始t r n a 和 m r n a 结合。在生理离子浓度条件下，倾向于大小亚基结合成8 0 s 核糖体，真核生物中，e l f l a 和 e l f 3 能够与4 0 s 核糖体小亚基结合，并防止其与大亚基结合。到目前为止，在真核生物中核糖体 大小驱基的解离究竟是一个自发的过程，还是必须在某种，些蛋白质因子的参与下才能进行，还是不 清楚的。总之，尽管在生理条件下，有利于二者的结合，但是由于e l f i a 和e l f 3 能与解开的小亚 基结合，就会使平衡向解离的方向移动，并使大量的8 0 s 核糖体解离为4 0 s 小亚基和6 0 s 大亚基。 由、b 、t 三个亚基组成的异源三聚体e l f 2 与g t p 、m e t - t r n a i 结合形成三元复合体( 简称t c ) ， 然后在e l f l 、e l f i a 、e l f 3 及e l f 5 等翻译起始因子的参与下，与4 0 s 核糖体小亚基结合形成4 3 s 起始复合体。再在翻译起始过程中起决定性作用的e l f 4 f ( 包括e l f 4 a 、e l f 4 e 和e i f 4 0 ) 作用下，e l f 4 f 通过其帽子结合蛋白e l f 4 e 与m r n a 5 帽子结合，再通过其支架蛋白e l f 4 g 与e l f 3 4 0 s 小亚基相互 作用晟终使m r n a 与4 3 s 起始复合体结合后，就会通过我们前面阐述的“扫描模型”从m r n a 5 2 文献综述 3 姗上对忡蕾白勺鸯i晕融妻旨团咔 _ - 盘o r n o o f poiype鼍“es 苷m 禽零v p f n 暑i e fu。ctjo露。交鼍。莴：ies o | f i e i o 疗l f n e i f 2 e f 唧 m l f 4 a 笔 伟i f 曩 e l f 4 m m i f a 6 ( 霉 疗l f 扛 e i m ” 疗i f 价 _ 1 n 6 办- s w m 2 霉一 3 9 - o s 一 r 8 ( y w 7 零v w口o芦一 s o 4 s q 8 奄一 o t 2 一o ，南wotota一 | 奉厶缸6 9 b n 蚺 l q 一萌扛峪1 3 舀 80鲁el盖，一鸳布ne母de厶of芝cces计。一oboso霉僵3jno foo誊l西lioo 8 d 1 ) f 1 m 拳a theylsoe”pen堑翻f1)_eaico r n o 曼o r l h m fdei蚕ofc&o毒墨ods要eraclj2 mor3讲eimn玉_f节器竺前na一er霉鼋c03砬ex，叮蓦ds go”ri铲0sornaissltj口 6每|-荨s13带ccie。磊deexcha露撙factor孚lc了ca童”es m了j心疗。萋ersio：o一绋fn09， zee分才：ecvc|掌o oelf2 誊vo掌edn鳌毛agesol|篓籼a器j孑鼙篱嚣wl乎e|f1elf40辱m an“瓤尊蚺鲁蠹 zas封；&gen务nl1-孑se ac晕l婶，骘鼠rnhe茅蓉a(|c至重y净de翌街nl 0 1 1 t p 暑d r o l ysi辅骘a亡i霹尹要ef盘c坞薹季elfdd(f嚣urm 18)se8基薷iesm嚼厶蓉 (4争lcdss悖nc olq款霉-垒一ef倚nl q e ，e precse銎内cncerla，ro云母es刀z丁书|jose 8 c 晕砖v oe11多 罄l n d ”t o s，ca尊蚺霉cnt|f零季ernts至em-l小童qu高1by 口葛钟rs t o fu窭scafiold lltloj1_了m cej苷筻分；苗苎著8九iconioo至壁m赫 窨莴rs零de零eti蓐鼍暑&ao娑口sltfol莓尊萎，ales”挈器鐾h se8&篱ciep e|fhq二17m器：”害odeg o垒fe蔫nt q e ；e l 8尊piex oei嘲|l|4m是a缸小一”eem_蟾crel8一 z 毒s 0pase毒_i季一盂薯。签了activ童鬻。誊。嚣嚣孑辞oly跨ofl茅夏嚣ry o。誊plex小孑孑鼍亭d fiecoo：ltj饿一of【琴坼霹l nodo，晕b8s乍palrio蠕一lb器悖卜t霸z；nlo岔罩 惹dea f o r su口曼*誊ni器hafigsoi零&epmaenc6_se a c 量幂 东南大学硕士学位论文 图1 ：真核生物依赖帽子结构的8 0 s 翻译起始复合体的形成i 4 i 。 向下游扫描起始密码子，当发现起始密码子后，触发4 3 s 起始复合体构象改变，导致e l f l 的解离， e l f 5 激活e l f 2 的g t p 酶活性，使与之结合的g t p 水解为g d p ，于是核糖体大小亚基结合，并引 起与e l f 5 b 结合的g t p 水解( 这个水解过程可能对随后的e l f 5 b 和戚其他翻译起始因子离开核糖 体是非常重要的) ，并最终形成具有翻译活性的8 0 s 核糖体复合体。 再简单介绍一下以第一个非a u g 作为翻译起始密码子的翻译起始的机制：这包括l e a k y s c a n n i n g 和r e i n i t i a t i o n 。l e a k ys c a n n i n g 是指4 0 s 核糖体沿m r n a5 端向下游开始扫描起始密码子 时，越过第一个a u g ，从第二甚至第三个a u g 开始翻译。最可能的原因是第一个a u g 的侧翼序 列不符合起始密码子所偏爱的序列特征，它通常被用来产生两种功能蛋白。r e i n i t i a t i o n 是指核糖体 翻译完上游的一个小的阅读框( u p o r f ) 并遇到终止密码子后。核糖体大小亚基解离，然而4 0 s 小 亚基继续结合在m r n a 上，重新开始扫描，又从下游的一个起始密码子开始翻译。 4 文献综述 2 、i r e s 起始机制 另外一个翻译起始的机制是i r e s 机制，即内部核糖体进入位点的机制，它是在1 9 8 8 年人们发现 没有帽子结构的小核糖核酸病毒( p i c o m a v i r u s ) 的m r n a 仍然可以组装翻译起始复合体进行蛋白质 生物合成时发现的“。i r e s 元件不具有序列上的相似性和保守性，它在翻译起始机制中既需要一些 经典的翻译起始因子( e l f s ) ，也需要另外一些只在i r e s 翻译起始机制中所需的特异反式作用因子( 缩 写为i t a f s ) 的作用它在翻译起始中主要是依赖其独特的空间结构，具体的机制就不再赘述。 ( 二) 、果蝇中蛋白质生物合成起始的研究进展 下面我们再简要介绍一下果蝇中蛋白质生物合成起始的研究进展情况。果蝇因具有生活周期 短，易培养，子代众多，全基因组序列分析已经完成，具备大量遗传学研究方法( 如g a l 4 u a s 系统、 图2 ：推测的o s k a r m r n a 的翻译调控机制口，9 l 在卵子发生的早期，运输中的o s k a r m r n a 可能通过一种我们尚未知的m i r n a 来组装r i s c ，并阻断翻译过程；在卵子发生的 晚期，运输过程中的o s k a rm r n a 通过c u p 依赖的机制来抑制其翻译过程；当o s k a r m r n a 被正确运输到卵母细胞后端时o r b 蛋白介导在细胞质中延长o s km r n a 的 p o l y a ，再通过p a b p 与e l f 4 g 的相互作用来引导正常的翻译起始过程。 f l p f r t 系统、基因靶向敲除( k n o c ko u t ) 、基因敲入( k n o c ki n ) 、d s r n a 干扰技术、嵌合体的 构建等) ，积累了大量的果蝇突变体，果蝇与哺乳动物的多数信号传导通路都是保守的等优势而作 为一个很好的模式生物。虽然在果蝇中有关基本翻译机制方面的研究还很少，也只有少数的翻译起 始因子被克隆和鉴定，但是果蝇在翻译调控机制方面的研究进展很明显，在蛋白质生物合成方面仍 然是一个不可多得的选择。到目前为止。果蝇中已经克隆并初步分析7 e l f 4 ”，”j 、e l f 4 g 1 2 4 】、i f 4 a 1 2 ”、 e l f 2 、e l f 4 8 1 2 7 1 及e l f 2 8 1 2 1 1 1 等翻译起始因子的功能。蛋白质生物合成的调节可分两类：一种为整体 调节，使得细胞内所有或绝大部分蛋白质的合成都受到影响；另一种是针对个别蛋白质合成的调节， 只影响个别特定m r n a 的翻译。其中整体水平的调节主要是通过调节e l f 4 e 、e l f 2 、e l f 2 b 来进行的； 调节细胞内特定m r n a 翻译的机制现在研究得比较多、比较清楚的是o s k a r m r n a 的翻译调控( 见图 2 ) ，它或者是帽子结合蚩 l c u p 首先通过r n a 结合蛋b r u n o i b r u ) 间接与o s k a r 的3 u t r 结合；然 后c u p 再与e l f 4 e 结合，并阻断e l f 4 e 与e l f 4 g 之间的相互作用，进而阻断其翻译起始过程，或者是通 过在转录后水平对基因进行表达调控的r n a i 介导的r i s c 的组装，来阻断o s k a rm r n a 的翻译。 前面我们简略回顾了一下真核生物的翻译起始过程以及果蝇中蛋白质合成的一些研究进展情 况。真核生物的翻译起始过程非常复杂。在这一古老的研究领域，还有很多问题需要进一步的阐明。 二、果蝇中长期记忆的研究进展 果蝇因具有众多的优势，作为遗传学、神经生物学和学习记忆研究的良好的模式生物，尤其是 东南大学硕士学位论文 在长期记忆形成机制的研究中，比起小鼠等哺乳动物的寿命比较长、神经系统比较复杂等缺点，具 有无可比拟的优势；谈到果蝇的长期记忆，就不得不首先来回顾一下果蝇的学习记忆环路的形成、 研究的方法及目前研究的现状。 i 、果蝇的神经系统 果蝇的神经系统具有一定的复杂性，但是，相对于脊椎动物等其它物种，果蝇的脑结构及其它 神经系统结构又相对简单，使得利用果蝇神经系统进行学习记忆等高级功能的生理、生化及解剖基 础的研究相对简单易行。果蝇的整个中枢神经系统( c e n t r a ln e u r a ls y s t e m ，c n s ) 大约分布t 3 0 0 。0 0 0 个神经元，按照神经元所处位置又分为食管上神经节( s u p r a o e s o p h a g e a lg a n g l i o n ) 、食管下神经节 ( s u b o a s o p h a g e a lg g l i o n ) 以及胸腹神经节( t h o r a x - a b d o m i n a lg a n g l i a ) - - = 部分。除视盘( o p t i cl o b e s ) 以外 的食管上神经节及食管下神经节组成了通常意义上的果蝇脑一中央脑( c e n t r a lb r a i n ) 。其中包含了 大约5 0 0 0 0 个神经元。果蝇脑的具体结构见图3 。 2 、果蝇研究的条件化范式 到目前为止，人们分别利用果蝇的视觉、嗅觉、体感线索及进食、求偶等基本生理反应，已经 设计出了数十种行为反射进行学习记忆的研究j 。譬如：使糖水奖励与一定气味相结合可以建立果 蝇的条件化展喙反射( p a v l o v i a nc o n d i t i o n i n go f t h ep r o b o s c i se x t e n s i o nr e f l e x ) ；在颜色分辨条件化任务 中( c o l o r d i s c r i m i n a t i o nc o n d i t i o n i n g ) 。使气味惩罚与一定颜色相结合可以建立果蝇选择性躲避受惩罚 颜色的反射；研究成熟雄蝇与未成熟雄蝇或者雌蝇交配的求偶行为而建立的条件化求偶反射 ( c o n d i t i o n e dc o u r t s h i pw i t hi m m a t u r em a l e s ，c o n d i t i o n e dc o u r t s h i pw i t hm a t u r ef e m a l e s ) ；以及视觉飞行 定向操作式条件化反射( v i s u a lo p e r a n tc o n d i t i o n i n g ) ，嗅觉飞行定向操作式条件化反射( o l f a c t o r y o p e r a n tc o n d i t i o n i n g ) ，嗅觉经典条件化反射( o l f a c t o r yc l a s s i c a lc o n d i t i o n i n g ) ，以及研究某些类认知的 高级功能的条件反射等等。但被应用最多的还是嗅觉的条件化反射。在果蝇中有两个主要的实验方 法用于嗅觉记忆的检测。第一个是q u i n n 和他的同事( 1 9 7 4 ) p 所创造的嗅觉行为反射。另外一种 范式是由j e l l i e s ( 1 9 8 1 ) 首创，在t u l l y 和q u i n n ( 1 9 8 5 ) p 0 1 基石出1 - 改进的嗅觉经典的条件化反射。在这 个反射中，把一组果蝇放到一个塑料管子里，然后通过真空吸尘器让两种气体连续的通过这个管子。 果蝇通过包裹在这个管子里的通电的铜网来获得多个脉冲的电刺激 u s ( u n c o d i t i o n e ds t i m u l u s ) ，非条 件刺激】，同时偶联一个作为条件刺激的气体 c s ( c o n d i t i o n e ds t i m u l u s ) ，条件刺激1 ；然后，让这些果 蝇再接触第二个无电刺激相偶联的相反的气体。 3 、果蝇学习记忆的时程 一般认为记忆的巩固过程是多个不同成分同时进行的过程，不同的记忆成分可以被不同的药物 所阻断。结合行为学分析手段、药物学方法和各种单基因突变体果蝇，人们提出了果蝇 在嗅觉联想式学习记忆过程中的多时程模型，以及不同的单基因突变对不同时间阶段果蝇学习记忆 的影响i7 ，”。药物行为学方法广泛应用于包括果蝇在内的各种动物的学习记忆时间特性 图3 ；果蝇脑结构示意图【2 i 研究中。实验表明，在果蝇的嗅觉联想式学习记忆的巩固过程中( 1 虱4 a ) ：存在可以被k c i 、l i c i 6 文献综述 ( a ) ( b ) r e t e n t i o nt i m e 24 d a y = 曼m 爨t t b a pt m 狮m t t i = 。l e a r n i n os t m m t m 。零删 h n m 。簧一_ 帕柏狮 j n 弛、删 图4 、( a ) 果蝇记忆巩固时程划分的多阶段模型【1 1 。 ( b ) 果蝇学习记忆过程不同阶段的相关基因f 7 1 。 等去极化药物阻断的短时程记忆( s h o r t - t e r mm e m o r y ，s t m ) 阶段，中时程记忆阶段( m e d i a l - t e r m m e m o r y 。m t m ) ，可以被乌本昔、利尿酸等阻断的抗麻醉记忆阶段( a n e s t h e s i a - r e s i s t a mm e m o r y , a r m ) ，可以被蛋白质合成抑制剂放线菌酮等阻断的长时程记忆阶段( 1 0 n g - t e r mm e m o