红细胞血型血清学技术PPT课件.ppt

红细胞血型血清学技术,1,标本盐水介质凝集试验酶处理细胞的凝集试验抗球蛋白试验聚凝胺的应用,2,标本,3,（一）标本采集1红细胞标本,采集方法：针刺耳垂或指尖，直接用生理盐水配成红细胞悬液待用。静脉采血，用抗凝剂（ACD、CPD、Na-EDTA等）抗凝。直接从血凝块（血柱）中洗脱游离的红细胞。,4,（一）标本采集1红细胞标本,特殊情况：用于抗球蛋试验（Coombs试验）的标本要抗凝，否则，补体C3b、C4b容易致敏红细胞造成抗球蛋试验（Coombs试验）假阳性。存在有受Ca2+抑制的自身抗体时，不宜用抗凝血液作为红细胞抗原标本。,5,（一）标本采集2血清标标本,采集方法：取静脉血注入干燥试管内，放置37水浴中，凝固后用玻璃棒搅动血块，使之与试管壁剥离，然后放置4冰箱过夜，离心分离血清。必要时，当血液凝固后即可离心分离血清。,6,（一）标本采集2血清标标本,需注意的问题：血清如需于4冰箱保存，需加叠氮钠（NaN3）防腐，叠氮钠（NaN3）终浓度0.1%。血清如用于制备试剂（如抗A、抗B标准血清）要经过56灭活补体后才能使用。一般实验避免使用血浆，防止纤维蛋白的干扰。,7,（二）红细胞悬液的配制用于血型鉴定、配血等的红细胞至少要用大量生理盐水洗一次，其目的是通过洗涤可以去除红细胞表面的下列物质：,1)少量的血浆蛋白；如纤维蛋白原等；2)已溶解红细胞的基质；他们有竞争抗体的作用。,3)可溶性的抑制物质，如A、B、H、Lewis等血型物质；4)抗凝剂；他们有抗补体作用。,8,红细胞悬液的常用浓度,压积红细胞1滴加8滴生理盐水所配成的悬液约为10%，按此比例配制其他所需浓度的红细胞悬液。2%的红细胞悬液一般用于滴定抗体效价。5%的红细胞悬液一般用于血型鉴定、配血试验、及抗球蛋白试验等大多数血型血清学试验。10%的红细胞悬液一般用于测定抗体的亲和力试验。,9,（三）标本的保存,1血清标本没有稀释过的血清如加有防腐剂可在4冰箱保存数月；在-20以下可保存数年而其抗体活性基本不变。用白蛋白或无抗体活性的AB型血清作稀释剂稀释血清后保存，效果和上述相同。用生理盐水稀释过的血清只限当天使用，不能保存。用大分子物质做稀释介质，其对抗体活性不起保护作用。,10,2红细胞标本一般试验用的在4冰箱保存下的凝血标本要在5天内使用，以不溶血为准。ACD保存液或其它特制的保存液可保存红细胞3周。盐水配制的红细胞悬液只能当天使用，不宜保存。应注意的问题：用作交叉配血的供血者、病人标本（血清、细胞）要放4冰箱保存1周，以便在出现输血反应时可备查。各种保存的红细胞在使用前都要用盐水洗一次以上。,11,练习题：1.用于抗人球蛋白试验的标本要抗凝，否则：AC3b容易致敏红细胞造成抗人球蛋白试验假阳性。BC4b容易致敏红细胞造成抗人球蛋白试验假阳性。C血型物质吸附于红细胞造成试验结果假阳性.D血型抗体致敏红细胞造成抗人球蛋白试验假阳性。EA和B。,12,2血型血清学试验中，关于红细胞悬液使用浓度正确的是：A2%的红细胞悬液一般用于滴定抗体效价。B5%的红细胞悬液一般用于血型鉴定、配血试验及抗人球蛋白试验等大多数血型血清学试验。C10%的红细胞悬液一般用于测定抗体的亲和力试验。D血型血清学试验与红细胞悬液使用浓度无关。EA、B及C均正确。,13,3关于血清标本保存，以下表述不正确的是：A没有稀释过的血清如加有防腐剂可在4冰箱保存数月；在-20以下可保存数年而其抗体活性基本不变。B用白蛋白或无抗体活性的AB型血清作稀释剂稀释血清后保存，效果与上述相同。C用生理盐水稀释过的血清只限当天使用，不宜保存。D用大分子物质做稀释介质，其对抗体活性不起保护作用。E用ACD保存液可保存血清3周。,14,盐水介质凝集试验,15,原理,盐水介质中红细胞上的抗原决定簇与相应抗体分子上的抗原结合部位结合，交叉连结形成肉眼可见的凝集块。,16,用途：,盐水介质凝集试验用于IgM抗体的检出、鉴定、盐水配血试验。盐水抗体鉴定的血型抗原，如ABO、MN、P等血型系统的抗原。,17,例外情况：,在盐水介质中，凝集是IgM抗体的行为。ABO血型系统中的A、B抗原位点多，当IgG抗A、抗B的浓度足够大时，在盐水介质里也能与相应的红细胞发生凝集反应。,18,盐水介质凝集试验,(一)方法常用的方法有平板法和试管法。,19,盐水介质凝集试验（二）、立即离心法：,用途：盐水法鉴定血型和交叉配血时，多采用立即离心(immediatespin)法。正确的操作是红细胞悬液加到血清中后立即离心并观察结果。,20,延迟立即离心的后果：反应时间过长而延误立即离心的时间对ABO血型系统的抗体检出影响较大。如果在室温放置2分钟后离心，可能使3+4+的凝集减弱为01+，并伴有溶血现象。如果在室温放置5分钟后离心，原有的凝集可能消失，并有溶血。有的标本在延迟离心后，本来应有的凝集会变为既不凝集也不溶血，因而难以发现ABO血型的不配合，这多数发生在O型人的血清抗体与A型、B型或AB型红细胞反应的试验中，发生率为2%3%。,21,发生上述现象的原因：反应强的抗A、抗B和抗原强度强的A、B抗原作用时，补体C1在有Ca2+存在的条件下，固定到红细胞膜上，妨碍了红细胞的凝集，进一步可能引起溶血。,22,解决方法：血清与红细胞混合后立即离心用血浆或灭活的血清做试验。用EDTA盐水配制红细胞悬液，以消除这种现象。稀释血清后再做试验可消除这种现象，因而也称这种现象为前带现象,23,（三）、试验结果的判读和记录,判读结果前应预先设计好记录册，在记录册上标记好细胞样本和血清样本的位置。一定要一边观察，一边记录结果，不能事后记录。常用的记录符号及所示的凝集强度如下:,24,（三）、试验结果的判读和记录,4+：一个大凝集块，背景透明，无游离细胞。3+：:数个大凝集块，背景透明，无游离细胞。2+：许多小凝集块，肉眼可见，大小均匀，背景基本透明，有游离细胞。1+：很小的凝集块，肉眼可见，背景不透明，游离细胞较多，常要用显微镜观察。W+：:微小凝集块，肉眼很难看清，背景浑浊，要用显微镜观察。O：无凝集，无溶血，全部是游离细胞，要用显微镜观察。PH：部分溶血。H：完全溶血。,25,（四）缗钱状凝集的处理,概念：在盐水介质的凝集试验中，常见到缗钱状凝集现象，也称串钱状凝集，这是一种假凝集，由红细胞形成的这种假凝集就象许多硬钱币堆积在一起。,26,缗钱状凝集的特点：,1在显微镜下红细胞膜完整；2细胞间界限清晰地成缗钱串聚集；3缗钱状假凝集反应不不受温度影响；,4室温与37结果一样；5这种红细胞的直接抗人球蛋白试验Coombs试验）呈阴性反应。,27,（四）缗钱状凝集的处理,造成红细胞缗钱状凝集的原因：多种原因可以引起红细胞缗钱状凝集，有内因和外因。,28,内在因素：某些疾病致血浆球蛋白异常时，如高球蛋白血症、巨球蛋白血症时会出现缗钱状凝集。外在因素：病人在使用大分子右旋糖酐和羟乙基淀粉溶液作血容量扩张剂时，也可以产生缗钱状凝集。用玻片法试验时，如温度过高、时间过长，也容易发生这种假凝集，因为玻片接触面大，液体的蒸发面也大，致使血清容易浓缩。,29,缗钱状凝集的解决方法：,实验中遇到缗钱状凝集时，可将血清适当稀释后进行实验。在显微镜下观察到缗钱状凝集时，加1滴生理盐水到反应物并混匀，通常可以消除这种假凝集。做试管法实验时如发现缗钱状凝集，可将试管离心，去上清液，沥干，再加2滴生理盐水重新悬浮红细胞观察结果（这种方法称为盐水置换法），假凝集会消失，真凝集不会消失，严重的可重复一次。缗钱状形成不影响间接抗球蛋白试验。,30,练习题：4.盐水介质凝集试验适用于IgM抗体活性的试验，但哪种情况例外：A盐水介质凝集试验用于IgM抗体的检出及鉴定、盐水介质配血试验等。B盐水反应性抗体鉴定抗原，如ABO、MN、P等血型系统的抗原。C当IgG抗A（B）的浓度足够大时，在盐水介质里也能与相应的红细胞发生凝集反应。D当IgG抗C的浓度足够大时，在盐水介质里也能与相应的红细胞发生凝集反应。E盐水介质凝集试验可用于检测Lewis血型系统的抗原抗体反应。,31,练习题：5血清和红细胞混合后，延迟立即离心的后果对哪个血型系统抗体的检出影响较大？ARh血型系统。BMNSs血型系统。CABO血型系统。DP血型系统。ELewis血型系统。,32,练习题：6血清和红细胞混合后，延迟立即离心可使某些凝集反应减弱或消失甚至引起溶血，解决方法是：A血清和红细胞混合后立即离心。B用血浆或灭活后的血清做试验。C用EDTA盐水配制红细胞悬液，以消除这种现象。D稀释血清后再做试验可消除这种现象。E以上均正确。,33,酶处理细胞的凝集试验,34,(一)、原理,红细胞表面有丰富的唾液酸，带有负电荷，是红细胞互相排斥的原因。蛋白水解酶能消化破坏这种唾液酸，减少红细胞表面的负电荷。胶粒滑动面上的Zeta电势减小，红细胞的间距缩短，IgG抗体分子能与有相应抗原的红细胞产生凝集。酶法能显著增强Rh和Kidd系统的抗原抗体反应，但蛋白酶能破坏M、N、S、s、Fya和Fyb抗原，酶法不适用这些抗原的检测。,35,(二)、常用酶的种类,常用的酶有菠萝酶、木瓜酶、胰酶、无花果酶等。国内用得较多的是菠萝酶和木瓜酶。注意事项：在配制酶溶液时要注意防护，有少数人对菠萝酶、木瓜酶和无花果酶有过敏反应，酶对组织有损伤作用，特别是无花果酶。各种酶粉都容易潮解，要注意密封，宜在4保存。,36,(三)、操作方法,1一期法酶试验一期法通常也称为直接酶法，菠萝酶和木瓜酶都适用于一期法。在已标记好的试管中加2滴血清和1滴5%的红细胞盐水悬液，再加1滴酶溶液，37孵育15分钟，离心1分钟，观察结果；或37孵育30分钟后直接观察结果。一期法不如二期法敏感，但操作简单，用于抗体筛选和鉴定、Rh定型、交叉配血等比较方便。试验系统通常要设阴性对照、阳性对照和自身对照。,37,2二期法酶试验二期法也称为间接酶法。木瓜酶和无花果酶适用于二期法。二期法分两步完成。第一步是酶处理红细胞：在1份洗涤压积的红细胞中加2份木瓜酶溶液，37孵育30分钟，用大量pH7.4的PBS洗涤3次，用生理盐水配成5%的悬液备用。第二步是在己标记好的试管中加受检血清2滴，再加1滴酶处理过的红细胞悬液，37孵育1530分钟观察结果，凝集和溶血皆属于阳性。如没有反应可转入抗球蛋白试验。二期法也要设立与一期法相同的对照系统。一般用于抗体筛选和抗体鉴定试验。,38,(四)、酶处理红细胞凝集素,一般概念：有一些抗体能和胰酶、木瓜酶、菠萝酶等酶处理的细胞发生凝集，但不与未处理的细胞反应，其原因尚不完全清楚，可能是酶处理后某些抗原部位得以暴露，且不同的酶暴露的部位不完全相同。对于这类与酶处理红细胞才发生凝集的抗体称为酶处理细胞凝集素。,39,酶处理细胞凝集素有以下几个特点：,1抗球蛋白法试验没有反应；或反应微弱；常表现为自身凝集或全凝集；2可以和其他酶处理的细胞发生交叉反应；3也可能不发生交叉反应；4偶而有型特异性；,5也可能表现为同种异体抗体特异性；6一些Rh系统的抗体，尤其是抗E和抗C与木瓜酶处理的细胞反应强；7多表现为Rh血型系统抗体特异性；8通常不引起输血反应。,40,练习题：7.酶技术是检出IgG抗体方法之一，但它不适合哪个血型系统的抗原抗体反应的检测？ARh血型系统。BKidd血型系统。CABO血型系统。DMNSs以及Duffy血型系统。,41,名词解释：酶处理细胞凝集素有一些抗体能和胰酶、木瓜酶、菠萝酶等酶处理的细胞发生凝集，但不与未处理的细胞反应，其原因尚不完全清楚，可能是酶处理后某些抗原部位得以暴露，且不同的酶暴露的部位不完全相同。对于这类与酶处理红细胞才发生凝集的抗体称为酶处理细胞凝集素。,42,练习题：适用于血型血清学试验使用的蛋白水解酶有：A木瓜酶B菠萝酶C胰蛋白酶D无花果蛋白酶,43,抗球蛋白试验,44,（一）、概念：,抗球蛋白试验（antiglobulintest，AGT）又称Coombs试验，是检查IgG抗体的一种很好的方法。将抗球蛋白血清（antiglobulinserum，AGS）加入己致敏的红细胞盐水悬液中，红细胞表面的抗体球蛋白（使其致敏的IgG抗体）与抗球蛋白血清中的抗体发生特异性反应，使红细胞发生凝集。抗球蛋白血清除了可以测定红细胞上IgG抗体外，还可以测定IgM和IgA，也可以测补体组分（C3、C4）。所谓广谱AGS即包括抗IgG和抗C3。抗球蛋白试验分为直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验。,45,抗球蛋白试验,46,（二）、抗球蛋白试剂：,试剂来源简介：用人体免球蛋白免疫家兔获得。产量少，纯度低，属广谱抗人球蛋白试剂。用杂交瘤技术制备单克隆抗球蛋白试剂。产量大，纯度高，针对性强，多为单特异性抗球蛋白试剂，如抗IgG、。抗C3等，单克隆的广谱抗人球蛋白试剂为抗IgG、抗C3的混合物。,47,多特异性（广谱）抗球蛋白试剂组成：试剂中含有抗IgG和抗C3d.。用途：主要用于配血试验、抗体筛选、抗体鉴定以及直接抗球蛋白试验（DAT），如溶血性输血反应原因调查、新生儿溶血病检查、自身免疫性溶液血性贫血（AIHA）的检查等。,48,单特异性抗球蛋白试剂试剂种类：有抗IgG、抗IgM、抗IgA、抗C3、抗C4。实际应用以抗IgG、抗C3为主。用途：1、用于配血试验、抗体检出和鉴定。2、对多特异性（广谱）抗球蛋白试验阳性结果进行分型。用抗IgG、抗C3可分出IgG、IgG+C3、C3三个型。,49,IgM抗体分子在红细胞洗涤过程中容易解离，但同时致敏的补体能牢固地结合在红细胞上而不易解离。因为抗IgM抗体总是结合补体，因此，通过用抗C3测定红细胞上是否结合有补体，则可间接证明红细胞上是否有IgM抗体包被。冷抗体引起的自身免疫性溶血性贫血一般是补体型的。抗IgM在抗球蛋白试验中作用不大。,50,（三）、方法,抗球蛋白试验分为直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验。,51,（一）、直接抗球蛋白试验,概念：直接抗球蛋白试验是检查体内致敏红细胞的一种方法。用途：用于检查红细胞是否已被不完全抗体所致敏。如新生儿溶血病（胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏）、溶血性输血反应（输入的不相合红细胞被病人不完全抗体致敏）、自身免疫性溶血性贫血（病人红细胞被自身抗体致敏）以及药物诱导产生的自身抗体（由甲基多巴类药物，青霉素等所致）。.,52,直接抗球蛋白试验（1）操作方法,1取受检查红细胞，以生理盐水洗涤3次，配成3%红细胞盐水悬液。2取上述受检者红细胞盐水悬液1滴，滴入试管，加抗球蛋白血清1滴，混匀。3阳性对照：不完全抗D血清致敏的3%D阳性红细胞悬液1滴，加抗球蛋白血清1滴，混匀。.4阴性对照：正常人3%D阳性红细胞悬液1滴加抗球蛋白血清1滴，混匀。5受检者以及阳性，阴性对照管同时离心，观察结果。,53,直接抗球蛋白试验（2）结果判定,如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。,54,直接抗球蛋白试验（3）注意事项,1)标本采取后立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞上解离，造成假阴性结果。2)抗球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，否则，可产生前带和后带反应，而误为阴性结果。,3)受检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。4)如果要了解体内致敏红细胞的免疫球蛋白类型，可分别以抗IgG、抗IgM或抗C3单价抗球蛋白清进行分型试验。,55,直接抗球蛋白试验(3)注意事项,5)红细胞上吸附抗体太少，或Coombs阴性的自身免疫性溶血性贫血，其直接抗球蛋白试验可呈假阴性反应。,6)全凝集或冷疑集血液标本及含有Wharton胶（华通氏胶）的脐血标本，且洗涤不充分；血液标本中有很多网织红细胞，且抗球蛋白血清中含有抗运铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集（假阳性结果）。,56,（二）、间接抗球蛋白试验,概念它是一种检测血清中不完全血型抗体的方法。即用已知抗原红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体，或用已知抗体的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。,57,间接抗球蛋白试验,用途：常用于血型鉴定，抗体的检出和鉴定，输血前交叉配血试验以及其它的特殊研究。（1）操作方法1取试管3支，标明受检管，阳性对照及阴性对照。2按下表将各反应物加入相应试管内。,58,间接抗人球蛋白试验（1）操作步骤,反应物：受检管，阳性对照管，阴性对照管；37水浴60min，洗涤3次。每管各加最适稀释度抗球蛋白血清1滴，混匀，离心，观察结果。,59,间接抗人球蛋白试验（2）结果判定,阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检管出现凝集者为阳性，受检管不出现凝集者为阴性。效价滴定如果受检者血清中检出IgG抗体，可将受检者血清以盐水做倍量稀释后，按上法进行测定。,60,间接抗人球蛋白试验（3）注意事项,红细胞洗涤应迅速，一开始洗涤就不应中途停止。洗涤用盐水要足量并用力冲入管底，使压积于管底的红细胞松离。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防污染来自皮肤的蛋白。离心速度和时间十分重要，应按规定进行。如果检查的抗体为补体依赖抗体，则必需加入新鲜AB型血清，抗球蛋白血清中也应含有抗C3。,61,间接抗人球蛋白试验（四）、试剂对照细胞的制备,在直接和间接抗球蛋白试验中，阴性结果都要用IgG抗体致敏的试剂对照红细胞检查证实。,62,间接抗人球蛋白试验（四）、试剂对照细胞的制备,1、IgG致敏的试剂对照红细胞等量的IgG抗D+O型Rh(+)红细胞于37水浴30分钟，用大量的生理盐水洗涤3次后再用盐水悬浮成5%的红细胞即可。,63,间接抗人球蛋白试验（四）、试剂对照细胞的制备,2、补体致敏的试剂对照红细胞20ml10%的蔗糖溶液+46滴新鲜血液，或加2滴洗涤过的压积红细胞和4滴AB型新鲜血清，37水浴15分钟，用大量的生理盐水洗涤3次后再用盐水悬浮成5%的红细胞即可。,64,间接抗人球蛋白试验,（五）、增强抗球蛋白试验的方法目的：加快抗体致敏速度或增强敏感性。方法：1酶法：2低离子介质法：3牛白蛋白法：4聚乙二醇（PEG）法：,65,练习题1.何谓直接抗球蛋白试验？有何用途？2.何谓间接抗球蛋白试验？有何用途？,66,练习题：抗人球蛋白试验的用途不包括下列哪项试验？A母婴血型不合新生儿溶血病的实验诊断。B溶血性输血反应的实验室检查。C自身免疫性溶血性贫血的实验室检查。D球形红细胞增多症的实验室检查。E药物诱导产生的自身抗体检查。,67,练习题：间接抗人球蛋白试验可用于检测：A受检血清中的不完全抗体B受检血清中的自身抗体C受检红细胞中的抗原D以上都不对,68,练习题：增强抗人球蛋白试验的方法不包括：A盐水-间接抗人球蛋白试验。B酶-间接抗人球蛋白试验。C低离子介质-间接抗人球蛋白试验。D白蛋白-间接抗人球蛋白试验。EPEG-间接抗人球蛋白试验。,69,练习题：所谓广谱抗人球蛋白血清试剂，其成份包括：A抗IgGB抗IgAC抗IgMD抗C3,70,聚凝胺的应用,71,（一）、原理,聚凝胺（pol